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骨组织工程应用可降解聚合物的可能性探讨

骨组织工程应用可降解聚合物的可能性探讨

颜晓慧1,郑 磊2,洪华容1,王 前2,张 晓1

(1.第三军医大学成都军医学院中心实验室,四川成都 610083; 2.第一军医大学附属南方医院创伤骨科,广东广州 510515)

俞耀庭 审

(南开大学分子生物研究所,天津 300071)

摘要:成骨细胞细胞外基质材料的选择是骨组织工程研究中一项重要而紧迫的任务。本文阐述了理想骨组织工程基质材料的研制要求,介绍了几种可降解聚合物在骨组织工程中的应用现状,并重点介绍了P LA 、PG A 及其共聚物的优缺点和相应的改进方法。作者认为,以合成可降解聚合物为主要组成成分的新型基质材料必将在未来骨组织工程研究中展示出可喜的应用前景。关键词:可降解聚合物;骨组织工程;细胞外基质材料

中图分类号:R 318.08 文献标识码:A 文章编号:1001-1110(2000)01-0011-07

Application of biodegradable polymers in

bone tissue engineering

YAN Xiao-hui 1

,ZHENG Lei 2

,HONG Hua-rong 1

,

WANG Qian 2

,ZHANG Xiao

1

(1.Center L ab o f Chengdu M edical Co llege ,T hird M ilitar y M edical U niv ersit y ,Cheng du 610083,China;2.Department of T r aumutolog y and Or thopedics,N anfang Hospital,First M ilit ary M edical U niv ersit y,Guangzhou 510515,China)

Abstract :T he selectio n o f ext racellular mat rix mater ials for o steoblasts is an impor tant and ur gent challenge in bone tissue eng ineer ing.T his ar ticle int ro duced the r equir ements of ideal ex tr acellula r matr ix mater ials and the applica tio n o f sever al biodegr adable synthetic poly mers in bone t issue engineer ing ,especially str essed o n the adv ant ages and disadvantag es o f P LA ,P GA and P LG A.It also put up so me met ho ds to impr ov e the char acter istics of PL GA .W e t hink that a new ex tracellular m etrix ma terials consisting mainly o f biodegr ada ble synthetic polymer s w ill pla y a gr eat r ole in the future study .

Key words :bo ne tissue eng ineering;biodegr adable po lymer s

 收稿日期:1999-06-21

1 前言

组织工程学是近年来发展起来的一门新学科。它是应用生物学和工程学的原理研究开发能够修复、维持或改善病损组织功能的生物替代物的一门学科。方法是体外分离、培养细胞,将一定量的细胞种植到具有一定空间结构的三维支架上,然后将此细胞—支架复合物植入体内或体外继续培养,通过细胞间的相互粘附、增殖和分化,分泌细胞外基质,从而形成具有一定结构和功能的组织或

器官。目前,有关学者应用组织工程方法已经生产出人工骨、软骨、皮肤、肌腱、血管甚至人工胰、人工肝等,其中骨的组织工程研究进展较快,已经利用组织工程化骨修复骨缺损取得成功[1]

。但是,在骨组织工程研究中还存在许多困难,其中理想的细胞外基质材料的制备和选择是骨组织工程中十分重要而迫切的任务,也是组织工程化骨组织能否应用于临床的重要影响因素之一。

2 骨组织工程细胞外基质材料应具备的条

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理想的骨组织工程细胞外基质材料的要求[2,3]有:1)良好的生物相容性:除满足生物材料的一般要求,如无毒、不致畸等之外,还要利于种子细胞粘附、增殖,降解产物对细胞无毒害作用,不引起炎症反应,甚至利于细胞生长和分化;2)良好的生物降解性:基质材料在完成支架作用后应能降解,降解率应与组织细胞生长率相适应,降解时间应能根据组织生长特性作人为调控;3)具有三维立体多孔结构:基质材料可加工成三维立体结构,孔隙率最好达90%以上,具有较高的面积体积比。这种结构可提供宽大的表面积和空间,利于细胞粘附生长、细胞外基质沉积、营养和氧气进入及代谢产物排出,也有利于血管和神经长入;4)可塑性和一定的机械强度:基质材料具有良好的可塑性,可预先制作成一定形状,并具有一定的机械强度,为新生组织提供支撑,并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性;5)良好的材料—细胞界面:材料应能提供良好的材料细胞作用界面,利于细胞粘附、生长、更重要的是能激活细胞特异基因表达,维持正常细胞表型表达。

3 人工合成可降解聚合物在骨组织工程中的应用

目前可用作成骨细胞种植基质材料的生物可降解聚合物主要有:聚乳酸(poly lactic acid,PLA)、聚乙醇酸(poly giycolic acid, PGA)、聚偶磷氮(polyphophazenes)、聚原酸酯((polyo rtho ester,POE)、聚己内酯(poly capr olactone,PCL)、聚酯尿烷(polyeste-r urethane)、聚酸酐亚胺共聚物(poly(anhydride-co-im ides))、聚羟丁酯(poly hy dro xy rate,PHB)及其共聚物等。这些聚合物作为细胞外基质材料各有其优缺点,下面介绍几种生物可降解聚合物在骨组织工程中的应用情况。

3.1 聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物

PLA、PGA均属 -聚酯类。PLA有三种异构体,PDLA、PLLA、PDLLA,在体内降解生成乳酸,是糖的代谢产物;PGA在体内降解为羟基乙酸,易于参加体内代谢。聚合物中酯键易于水解,属非酶性水解。共聚物的降解时间可通过改变两者的比例来调控,约为几周到几年,这类聚合物属热塑性塑料,可通过模塑(m oulding)、挤压(ex trusion)、溶剂浇铸(solvent casting)等技术加工成各种结构形状。因其降解产物无毒及良好的生物相容性, PLA、PGA已被美国FDA批准广泛用于临床,用作医用缝线、暂时性支架和药物控释载体。Vacanti[4]首先将PGA、PLA用作软骨细胞体外培养基质材料,通过组织工程方法获得新生软骨成功,此后,PLA、PGA及其共聚物被广泛用于组织工程各类组织细胞种植的基质材料,如软骨、骨、肌腱、小肠、气管、心瓣膜等,取得了初步成功。

3.1.1 PLA、PGA及其共聚物在骨组织工程中应用的主要结构形式

PLA、PGA及其共聚物在骨组织工程中应用的主要结构形式有纤维支架、多孔泡沫以及管状结构等[3]。

纤维支架是由PGA或其他结晶态材料组成。PGA通过挤压制成10~15 m的纤维,再通过编织加工技术形成编织状或无纺状结构,孔隙率可高达97%,面积体积比高达0.05 m-1。但是这样形成的支架不能承担压力,要将无纺PGA纤维支架中邻近纤维通过物理键合方式连接才能提高其机械强度。一般有两种方法:一是用另一种聚合物包埋,多用PLLA或PLGA;第二种是热处理。以PGA纤维为基础的支架容易塑形成多种形状,用作软骨细胞、成骨细胞、肝细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、小肠表皮细胞、皮肤成纤维细胞、尿道上皮细胞等的外基质材料。

Br eitbar t[5]等将PGA无纺纤维支架制成直径15mm、厚2mm的圆盘状,复合体外

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培养的兔骨膜成骨细胞,植入修复兔颅骨直径为15m m的全层骨缺损。4周后缺损区有骨岛形成,12周后缺损区大量骨生成,完全修复骨缺损。在新生骨过程中未见软骨生成,为膜内成骨,考虑与植入部位(颅骨胚胎学来源是膜内成骨)或细胞培养条件有关。

高度多孔PLLA或PLGA泡沫为组织细胞提供三维立体生长空间,是一种理想的结构形式。目前制作多孔泡沫的主要技术包括溶剂浇铸(solvent casting)、微粒滤除(particulate leaching)、相分离(phase separ ation)和气体发泡(gas foaming)。这些技术制成的泡沫孔隙率高达94%,且由于连接的固相结构,其抗压强度达104Pa左右,远高于未连接的纤维支架的强度(约102Pa)。尤其是M ooney[6]采用气体发泡技术,即将PLGA固体室温暴露于5.5M Pa高压CO2气体72h达溶解饱和,然后将气压降至大气压水平,聚合物中CO2溶解度迅速下降,产生大量的CO2气腔,最终形成多孔泡沫样结构,孔径约100 m,孔隙率达93%。这种利用CO2热不稳定性制成的PLGA泡沫,避免了有机溶剂的细胞毒作用和高温处理的影响,是一种较理想的细胞种植载体,尤其有利于负载生长因子作用于种植细胞。

Ishaug[7]等将大鼠骨髓基质细胞种植于PLGA泡沫,再将复合物移植于大鼠肠系膜观察其成骨能力。组织学检查发现7天后复合物中即可见矿化骨组织,7周后,孔径为150~300 m的泡沫复合物中矿化骨组织厚度达370±160 m。可见,这种泡沫复合物显示出良好的成骨效应。

另外,PLA、PGA及其共聚物亦被制成管状结构用于小肠、尿道等管状器官的组织工程细胞种植载体材料。

3.1.2 PLA、PGA及其共聚物用作骨组织工程细胞外基质材料的不足之处和改善方法(1)亲水性不足,细胞吸附力较弱

以PLA包埋的PGA无纺纤维支架亲水性差、细胞吸附力弱的问题一直困扰着组织工程学家,人们一直在寻找解决这一问题的方法。M ikos通过乙醇和水二步预湿的方法,有效地对支架进行预湿,增强了亲水性,促进了细胞在支架表面均匀分布,并将有利于体内移植后纤维血管的长入。刘彦春[8]等选择卵磷酯和多聚赖氨酸共同包埋PGA+ PLA,也显著提高了支架的亲水性和细胞吸附力。Hubbell[9]指出,聚乙醇是一种水溶性、非离子聚合物,可减少生物材料对蛋白的吸附作用。将聚乙醇与聚酯形成共聚物,可提高材料的亲水性,但同时也加速了聚合物的降解。

(2)引起无菌性炎症

PLA、PGA应用于临床过程中发现患者出现非特异性无菌性炎症反应率较高,约为8%[10]。Spenel[11]的实验中提出中分子量降解产物可增加非感染炎性反应,PLA平均分子量低于20000时,无菌性炎症发生率较高,使用高分子量PLA可延迟但不能消除这一反应。

目前认为出现无菌性炎症的原因可能与聚合物降解过程中酸性降解产物引起局部PH值下降有关[12]。因此,有学者将碱性物质,如碳酸钙、碳酸氢钠、钙羟基磷灰石引入聚合物中,可代偿聚合物降解引起的PH值下降,有助于防止无菌性炎症的发生[13]。另外,将聚酯—聚乙二醇共聚物作为前体物质合成水溶性降解水凝胶,这种水凝胶中聚酯在聚已二醇末端以低聚体形式存在,含量较低,在体内降解过程中不会引起炎症反应[9]。当然,无菌性炎症的根本解决办法是开发一种降解不释放或缓慢释放酸性降解产物的新型聚合物。

(3)机械强度不足

单纯编织成的PGA无纺纤维支架不具备一定的抗压强度,通过聚合物包埋或热处理虽然可改善其机械强度,但仍然存在抗压强度不足的缺陷。Dev in[14]将羟基磷灰石

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(HA)与50:50PLGA共聚物组成多孔复合基质材料,实验表明复合材料抗压弹性模量随H A成分增加而增加。聚合物降解后,含50%HA的复合材料模量为1459M Pa,而不含HA的基质材料模量为293M Pa。同时, HA的引入也延缓了聚合物的降解时间。含10%HA的复合材料6周内可完全降解,而含50%HA的复合材料则相对稳定。因此,将钙磷陶瓷引入PLGA共聚物,可改善PLGA 的机械性能差、降解速度快、骨结合力弱等缺点。

(4)其他

PLA、PGA及其共聚物还存在其他一些问题,如聚合物中残留的有机溶剂的细胞毒作用和可能引起的纤维及与周围组织的免疫反应等问题[15]。

3.2 聚丁酸(po lyhydr ox ybutyrate,PHB)

PHB最早由Lemoigne(1964)从细菌中分离出来,随后在诸多细菌,如巨杆菌属、红螺菌属等的胞浆颗粒中均发现有这种聚合物。在人体血液中也少量存在。PHB是由3-羟基丁酸通过酯键链接而成。PHB最早被美国ICI农业食品组织用作动物饲料,后来人们发现PHB具有压电效应,十分适合作为骨折固定材料,但由于单纯PHB易碎、热不稳定、降解时间长、可塑性和机械性能差等缺点限制了它的广泛应用。

将聚羟戊酸(PHV)引入PHB主链,形成PHBV共聚物,由PHB和0~24%PHV 组成,可改善PHB的上述缺点。PHBV可在较低的温度下加工塑形,避免了PHB的热降解问题。PHBV通过微生物酶解和水解作用而发生降解,水解作用主要与环境酸碱度有关。Riv ard[16]用PHB/9%HV组成的PHBV 共聚物制成三维立体泡沫用作软骨细胞、成骨细胞培养支架,细胞均匀分散在整个聚合物基质中,呈良好的粘附、增殖状态,并在培养21天时细胞生长达最大密度。但PHBV 共聚物还存在机械性能差、骨结合力弱等问题。

为改善这些缺点,有人将可溶性磷酸盐玻璃、HA、磷酸三钙(TCP)等与PHBV组成复合物。可溶性磷酸盐玻璃虽然有助于提高机械强度,但其光滑表面不利于与PHBV的物理结合,且早期溶解率高,释放出大量Na+、P5+和Ca2+,引起较强的组织反应,软组织增生,而新骨生长被抑制。H A可以提供粗糙表面,有利于PHBV与之结合,且HA 还具有良好的骨结合力,有利于新骨组织长入,但存在降解难的问题。相比之下,T CP具有较好的生物降解及良好的骨结合力,用T CP作为PHBV的添加剂既有效地增加了机械强度,又提高了骨结合力,对PHBV的降解影响较小[17]。

3.3 聚偶磷氮(poly phosphazenes)

Allcock最早通过聚二氯化偶磷氮与氨基酸酯反应制得含氨基酸酯取代基的聚有机偶磷氮(poly(org ano)phosphazenes)。这种聚有机偶磷氮具有良好的生物相容性,降解产物无毒,逐渐被用作药物控释载体。聚有机偶磷氮降解是通过氨基酸酯的水解,生成羧酸,再催化主链的裂解。因此通过调节水解不稳定性的氨基酸酯取代基与主链的化学组成可以实现聚合物降解速度的调控。其完全水解产物对人体基本无毒害作用。

Laurencin[18]等将聚有机偶磷氮用作成骨细胞培养载体,发现取代基为乙基甘氨酸酯的聚有机偶磷氮不仅有利于细胞的粘附生长,而且可提高聚合物的降解率。在此基础上,通过盐析技术制成具有三维立体结构的聚甲基苯氧基乙基甘氨酸偶磷氮(po ly [(m ethypheox y)(ethylglycinato) phosphazene]),平均孔径165 m,分布均匀,孔隙之间相互交通。将成骨细胞种植于其上,培养第1天成骨细胞就从材料表面长入孔隙内,并在21天的培养期中细胞以恒定速度增殖,呈现出良好的生物相容性。

3.4 聚氨基酸(poly am ino acid)、假聚氨基

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酸(pesudo-poly amino acid)

聚氨基酸可由多种氨基酸制备得到一系列均聚物和共聚物,主链两侧基团可提供药物交联剂及用于调节其性能的悬浮基团结合位点。降解过程释放天然氨基酸,降解产物无毒,聚氨基酸已用作医用缝线、人工皮肤和药物控释体系。

绝大多数聚氨基酸为非溶性,不易加工成型,在水介质中呈现出溶胀状态。作为药物控释载体材料时,难以控制药物的释放速度,并且聚氨基酸的降解通过酰胺键的酶解来实现,因为个体间酶活性的差异,因而很难控制其在体内的降解速度,且酰胺键在聚合物链中反复出现,影响了它的机械性能。

用酯键来取代主链结构中的多肽键,用于改善聚合物的机械性能和降解速度,得到一类改性聚氨基酸,称为“假聚氨基酸”,是由二肽作为其始单体材料,经聚合反应制备而得。目前化学方法制备而得的假聚氨基酸主要有两种,一种是从N-基保护的羟脯氨酸制备的聚(N-酰基-羟脯氨酸)酯;另一种是用酪氨酸二肽取代双酚A,产物为亚氨基碳酸酯-酰胺共聚物。假聚氨基酸既保持聚氨基酸的良好生物相容性,又改善了机械性能,且易溶于有机溶剂而易于塑形,但还存在疏水性较强、降解缓慢的缺点。

3.5 聚原酸酯(polyo rtho esters,POE)

聚原酸酯为疏水性聚合物,在一定条件下其表面与水分子相互作用发生“融蚀”过程,使之降解,降解产物无毒、无副作用。Tag lorm s对4种聚合物纯降解产物引起的细胞毒性进行定量检测,从大到小依次为PLA、PCL、PGA、POE[19]。POE可分为三类: (1)Choi和Heller用2,2-二乙氧基四氢呋喃与二乙二醇经酯转化反应制备获得,商品名为Chro no mer和Alx amer。由于在水解过程产生酸性产物,使降解过程中存在自催化作用,有效地提高了它的降解速度;(2)在酸催化条件下二醇与双烯酮反应制备聚合物,其特点是合成反应中使用二醇的种类决定产物的性能。由于原酸酯键比较稳定,降解缓慢, Heiier采用在聚合物中加入酸性赋形剂的方法来控制POE的降解速度,但熔融过程中加入酸性赋形剂,POE稳定性降低;(3)1,2,6-己三醇与三甲基原酸酯在无水条件下反应制备POE,产物为疏水性,半固体。

POE生物相容性好,通过表面融蚀发生降解,不产生碎片,降解早期不产生酸性代谢产物,以后缓慢缓放,降解产物细胞毒性弱。降解时间通过酸性赋形剂来调节。但还存在亲水性差、降解缓慢等缺点。

3.6 聚酯尿烷(poly esterurethane)

Saad[20,21]等最近开发出一种可降解高度多孔的聚酯尿烷泡沫,孔径大小为100~150 m。降解产物为聚(R)-3-羟基丁酸(PHB-P),呈小结晶颗粒状,直径为2~20 m,降解临界数分子量M(n)约为2300。实验表明,这种聚酯尿烷泡沫具有良好的生物相容性。

他们用巨噬细胞株J774、大鼠原代成骨细胞、成骨细胞株M C3T3-E1分别与泡沫体外培养检测了聚酯尿烷泡沫的生物相容性。观察显示成骨细胞与巨噬细胞均呈正常形态,未见细胞损伤征象,未见巨噬细胞中有明显TNF- 、NO产生。与组织培养的聚苯乙烯(tissue culture polysty renes,TCPS)相比,聚酯尿烷泡沫显示出更强的促细胞粘附、增殖作用。大鼠原代成骨细胞、M C3T3-E1细胞株在聚酯尿烷泡沫上粘附率分别是T CPS的1.4倍和1.8倍,细胞倍增时间也由6天和8天左右缩短至5天左右,8天后细胞多层生长并移入孔内。另外,泡沫上成骨细胞亦呈现良好的成骨细胞表型,分泌高浓度的Ⅰ型胶原,培养12天内ALP活性、骨钙素水平呈持续升高趋势,说明聚酯尿烷泡沫不影响成骨细胞表型表达。

聚酯尿烷的降解产物为PHB-P,可被巨噬细胞吞噬,成骨细胞也表现出对PHB-P的

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微弱吞噬功能。低浓度的PHB-P不会引起细

胞毒效应或巨噬细胞活化,但当PHB-P浓度大于200pg/个细胞时可显示对巨噬细胞的毒害效应,大于400pg/个细胞时对成骨细胞有微弱毒害效应。进一步研究表明,成骨细胞不仅参与PH B-P的吞噬,而且在低PHB-P 浓度下,这种吞噬作用还伴随ALP活性变化。PHB-P有助于成骨细胞的ALP活性提高,呈剂量和时间依赖关系。实验中可见200mgPHB-P的浓度作用于成骨细胞4天, ALP活性达高峰,但对胶原和骨钙素的表达无明显影响。

3.7 聚酸酐(po lyanlydr ides)

聚酸酐是由羟酸聚合而成。性质活泼,遇水极不稳定。脂肪簇聚酸酐在几天内完全降解,而芳香簇聚酸酐则需几年时间才能降解完全。综合两者的特点,通过调整主链中两种单体的组成比例来调控材料的性能和降解速度。毒理学评价表明,聚酸酐的体内生物相容性非常理想,被广泛用于药物控释体系。

Attaw ia[22,23]将酸酐和亚胺聚合成共聚物用作成骨细胞培养载体。其中亚胺成分由苯均四酸亚胺丙氨酸(pyrom ellity lim id-oalanine)或偏苯三酸亚胺甘氨酸(trimellitylimido glycine)组成,酸酐成分由皮脂酸(sebacic acid)或1,6-二羧基苯氧己烷组成。将共聚物制成圆盘状,与成骨细胞株M C3T3-E1共同培养,发现24小时内,酸酐单体为1,6-二羧基苯氧己烷的共聚物培养体系中,细胞粘附良好,形态正常。而单体为皮脂酸的共聚物培养体系中,由于聚合物表面的快速降解,导致细胞不粘附。在此基础上,进一步研究了在共聚物降解产物苯均四酸亚胺丙氨酸和苯均四酸存在的情况下,成骨细胞仍能维持特征性的多角形,在21天的培养期内维持分泌骨钙素的成骨细胞表型。这种亚胺酸酐共聚物对成骨细胞有良好的相容性,不影响表型表达,但其中的亚胺成分可能对细胞生长有影响。4 人工合成可降解聚合物用作骨组织工程细胞外基质材料的前景与展望

现有的骨替代材料用作骨组织工程细胞外基质材料都或多或少的存在一些缺点。生物类材料如同种异体骨、异种骨等虽然经过一定的物理化学方法处理,消除了部分抗原性,其天然的多孔隙结构也解决了人工合成材料在孔隙率、孔隙交通、孔隙大小等方面的制作难题,但仍然存在来源不足、传播某些传染病隐患、抗原性消除不确定以及力学强度不足、降解快等缺陷。钙磷陶瓷类材料具有三维孔隙结构,骨亲和力强,材料表面降解形成的微碱性环境十分利于成骨细胞粘附、增殖和成骨等优点,但脆性大、降解难限制了其在骨组织工程中的应用;天然高分子聚合物如胶原、纤维蛋白等具有良好的生物相容性,利于成骨细胞的粘附、增殖和分化,但由于缺乏一定的机械强度故也难于单独作为成骨细胞基质材料。

人工合成可降解聚合物材料由于其组成成分、分子量、表面微结构、大体形态、机械性能、降解时间等都能预先设计和调控,最后基本降解完全,避免了长期异物反应的危险,但是相比天然生物材料,人工合成材料最大的缺点是缺乏细胞识别信号,不利于细胞特异性粘附及特异基因的激活。为了增强材料对成骨细胞的粘附力,采取吸附或溶剂链接的方法,将纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、胶原或某些促细胞粘附氨基酸短肽如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Ar g-Gly-Asp,RGD)短肽和天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(Asp-Gly-Glu-Ala,DGEA)短肽引入基质材料的表面或整体,促进细胞粘附,增强生长代谢。

相信随着材料科学及其制作加工工艺的不断发展,以及对材料—细胞相互作用研究的不断深入,以合成可降解聚合物为主要成分的利于成骨细胞粘附和分化的新型基质材料在骨组织工程研究领域必将展现喜人的应用前景。

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