Padlock探针设计
1.4 Padloek探针的设计
从GenBank中下载需要检测细菌的ITS序列,与GenBank登录的100余种细菌序列进行比较。然后选取待检测病原菌核酸序列特异部分作为padlock探针的T2端,序列特异部分临近端作为探针的Tl端。所有探针的杂交温度都采用HyTher TM来预测(http://ozone2:https://www.wendangku.net/doc/8810307586.html,/)。在设计探针时,采用Oligo6软件对所有探针的二级结构进行预测,避免设计的探针出现严重的二级结构从而影响杂交的结果。
每条探针的zipCode序列都是在GeneFlex TM TagArray set(Affymetrix)中选取的,在选的过程中,对每一个ZipCode序列都在NCBI中进行BLAST,以保证其特异性。对于每一条探针上的ZipCode序列,我们都设计一条与其完全互补的核酸序列用于Macroarray高通量检测。
1.3 锁式探针
1.3.1 锁式探针的结构
典型的锁式探针的结构如图1.1所示，其两端是与靶序列互补的长度为15-25bp的短片段，中间是一段长度约为50-80 bp的连接序列，具有扩增的引物结合位点以及用于杂交的zipcode序列，有的锁式探针没有zipcode序列。探针与靶序列结合的特异性由两个末端的序列保证。只有当锁式探针和相应的检测靶DNA同时存在于连接体系中且二者完全互补配对时，线型锁式探针才能在连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应靶DNA存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在。用以扩增锁式探针的引物可以是通用引物，从而实现使用一对引物扩增多条锁式探针，也可以是半特异性的引物。半特异性引物是指两条引物中的一条是通用的，而另外一条具有模板特异性，其5’端带有一个特殊的标记有荧光发光基团和荧光淬灭基团的发夹结构，主要用于检测单核苷酸多态性或检测两种不同的核酸（或核酸片段）。Zipcode序列是一段与模板序列（或检测核酸）无同源性的序列，根据模板不同而变化，主要用于锁式探针扩增产物的杂交。Zipcode序列或C-zipcode序列固定在固相支持物后可以与锁式探针扩增产物进行反向斑点杂交，通过显色检测或荧光扫描，读出特定杂交信号，判断待检测的模板是否存在，从而实现高通量检测。锁式探针这种独特的设计，满足了专化性检测需要，而且具有多种扩增方式以及可以携带检测标记物，可以适应多种检测平台。
超分支滚环扩增
上游引物结合到C-probe 上并被DNA 聚合酶延伸，生成一条长的单链，具有多条下游引物的多个结合位点。每条下游引物都被延伸并替换后面的引物及这些引物的延伸产物。下游引物延伸得到的产物上又具有上游引物的结合位点，从而进一步得到延伸和扩增，因而生成大量的级联扩增产物。
基于锁式探针的滚环扩增技术在植物病原检测中的应用
教你认识半导体与测试设备
? 第一章.认识半导体和测试设备(1) 本章节包括以下内容， ●晶圆（Wafers）、晶片（Dice）和封装（Packages） ●自动测试设备（ATE）的总体认识
●模拟、数字和存储器测试等系统的介绍 ●负载板（Loadboards）、探测机（Probers）、机械手（Handlers）和温 度控制单元（Temperature units） 一、晶圆、晶片和封装 1947年，第一只晶体管的诞生标志着半导体工业的开始，从那时起，半导体生产和制造技术变得越来越重要。以前许多单个的晶体管现在可以互联加工成一种复杂的集成的电路形式，这就是半导体工业目前正在制造的称之为"超大规模"（VLSI，Very Large Scale Integration）的集成电路，通常包含上百万甚至上千万门晶体管。 半导体电路最初是以晶圆形式制造出来的。晶圆是一个圆形的硅片，在这个半导体的基础之上，建立了许多独立的单个的电路；一片晶圆上这种单个的电路被称为die（我前面翻译成"晶片"，不一定准确，大家还是称之为die好了），它的复数形式是dice.每个die都是一个完整的电路，和其他的dice没有电路上的联系。 当制造过程完成，每个die都必须经过测试。测试一片晶圆称为"Circuit probing"（即我们常说的CP测试）、"Wafer porbing"或者"Die sort"。在这个过程中，每个die都被测试以确保它能基本满足器件的特征或设计规格书（Specification），通常包括电压、电流、时序和功能的验证。如果某个die不符合规格书，那么它会被测试过程判为失效（fail），通常会用墨点将其标示出来（当然现在也可以通过Maping图来区分）。 在所有的die都被探测（Probed）之后，晶圆被切割成独立的dice，这就是常说的晶圆锯解，所有被标示为失效的die都报废（扔掉）。图2显示的是一个从晶圆上锯解下来没有被标黑点的die，它即将被封装成我们通常看到的芯片形式。
结构设计常识及规范
第一章材料 SPCC 一般用钢板，表面需电镀或涂装处理 SECC 镀锌钢板，表面已做烙酸盐处理及防指纹处理 SUS 301 弹性不锈钢 SUS304 不锈钢 镀锌钢板表面的化学组成------基材（钢铁），镀锌层或镀镍锌合金层，烙酸盐层和有机化学薄膜层. 有机化学薄膜层能表面抗指纹和白锈，抗腐蚀及有较佳的烤漆性. SECC的镀锌方法 热浸镀锌法: 连续镀锌法（成卷的钢板连续浸在溶解有锌的镀槽中 板片镀锌法(剪切好的钢板浸在镀槽中，镀好后会有锌花. 电镀法: 电化学电镀，镀槽中有硫酸锌溶液，以锌为阳极，原材质钢板为阴极. 1-2产品种类介绍 1.品名介绍 材料规格后处理镀层厚度 S A B C＊D＊E S for Steel A: EG （Electro Galvanized Steel）电气镀锌钢板---电镀锌 一般通称JIS 镀纯锌EG SECC （1） 铅和镍合金合金EG SECC （2） GI (Galvanized Steel) 溶融镀锌钢板------热浸镀锌 非合金化GI，LG SGCC （3） 铅和镍合金GA，ALLOY SGCC （4） 裸露处耐蚀性2>3>4>1 熔接性2>4>1>3 涂漆性4>2>1>3 加工性1>2>3>4
B: 所使用的底材 C (Cold rolled) : 冷轧 H (Hot rolled): 热轧 C: 底材的种类 C: 一般用 D: 抽模用 E: 深抽用 H: 一般硬质用 D: 后处理 M: 无处理 C: 普通烙酸处理---耐蚀性良好，颜色白色化 D: 厚烙酸处理---耐蚀性更好，颜色黄色化 P: 磷酸处理---涂装性良好 U: 有机耐指纹树脂处理(普通烙酸处理)--- ---耐蚀性良好，颜色白色化，耐指纹性很好A: 有机耐指纹树脂处理(厚烙酸处理)---颜色黄色化，耐蚀性更好 FX: 无机耐指纹树脂处理---导电性 FS: 润滑性树脂处理---免用冲床油 E: 镀层厚 1-4物理特性 膜厚---含镀锌层，烙酸盐层及有机化学薄膜层，最小之膜厚需0.00356mm以上. 测试方法有磁性测试(ASTM B499), 电量分析(ASTM B504), 显微镜观察（ASTM B487） 表面抗电阻---一般应该小于0.1欧姆/平方公分. 1- 5 盐雾试验----试片尺寸100mmX150mmX1.2mm, 试片需冲整捆或整叠铁材中取下，必须在镀烙酸盐后24小时，但不可超过72小时才可以用于测试，使用5%的盐水，用含盐的水汽充满箱子，试片垂直倒挂在箱子中48小时。 测试后试片的镀锌层不可全部流失，也不能看到底材或底材生锈，但是离切断层面6mm范围有生锈情况可以忽略。
芯片测试的几个术语及解释(CP、FT、WAT)
CP是把坏的Die挑出来，可以减少封装和测试的成本。可以更直接的知道Wafer的良率。FT是把坏的chip挑出来；检验封装的良率。8 % 现在对于一般的wafer工艺，很多公司多吧CP给省了；减少成本。 ＣＰ对整片Ｗａｆｅｒ的每个Ｄｉｅ来测试 而ＦＴ则对封装好的Ｃｈｉｐ来测试。 ＣＰＰａｓｓ才会去封装。然后ＦＴ，确保封装后也Ｐａｓｓ。 WAT是Wafer Acceptance Test，对专门的测试图形（test key）的测试，通过电参数来监控各步工艺是否正常和稳定； CP是wafer level的chip probing，是整个wafer工艺，包括backgrinding和backmetal（if needed），对一些基本器件参数的测试，如vt,Rdson,BVdss,Igss,Idss等，一般测试机台的电压和功率不会很高； FT是packaged chip level的Final Test，主要是对于这个（CP passed）IC或Device芯片应用方面的测试，有些甚至是待机测试； Pass FT还不够，还需要作process qual和product qual CP测试对Memory来说还有一个非常重要的作用，那就是通过MRA计算出chip level的Repair address，通过Laser Repair将CP测试中的Repairable die修补回来，这样保证了yield和reliability两方面的提升。 CP是对wafer进行测试,检查fab厂制造的工艺水平
FT是对package进行测试,检查封装厂制造的工艺水平 对于测试项来说,有些测试项在CP时会进行测试,在FT时就不用再次进行测试了,节省了FT 测试时间;但是有些测试项必须在FT时才进行测试(不同的设计公司会有不同的要求) 一般来说，CP测试的项目比较多，比较全；FT测的项目比较少，但都是关键项目，条件严格。但也有很多公司只做FT不做CP(如果FT和封装yield高的话，CP就失去意义了)。在测试方面，CP比较难的是探针卡的制作，并行测试的干扰问题。FT相对来说简单一点。还有一点，memory测试的CP会更难，因为要做redundancy analysis,写程序很麻烦。 CP在整个制程中算是半成品测试，目的有2个，1个是监控前道工艺良率，另1个是降低后道成本（避免封装过多的坏芯片），其能够测试的项比FT要少些。最简单的一个例子，碰到大电流测试项CP肯定是不测的（探针容许的电流有限），这项只能在封装后的FT测。不过许多项CP测试后FT的时候就可以免掉不测了（可以提高效率），所以有时会觉得FT 的测试项比CP少很多。 应该说WAT的测试项目和CP/FT是不同的。CP不是制造（FAB）测的!% Q) `8 而CP的项目是从属于FT的（也就是说CP测的只会比FT少），项目是完全一样的；不同的是卡的SPEC而已；因为封装都会导致参数漂移，所以CP测试SPEC收的要比FT更紧以确保最终成品FT良率。还有相当多的DH把wafer做成几个系列通用的die，在CP 时通过trimming来定向确定做成其系列中的某一款，这是解决相似电路节省光刻版的最佳方案；所以除非你公司的wafer封装成device是唯一的，且WAT良率在99%左右，才会盲封的。 据我所知盲封的DH很少很少，风险实在太大，不容易受控。
荧光探针设计原理
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +
Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光
real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价
real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价 一、实时荧光Taqman 探针设计 总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。 在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。 若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。 另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。 二、探针的设计 探针设计的基本原则： 1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。 2．探针长度
Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。 3．探针的名称 应标记探针在基因组的位置及长度。 4．探针Tm值计算 用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。 5．探针的评价 用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name” 中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primer self dimer”,分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dime r，并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“p rimer hairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins，并对此探针的h airpins进行评价。多重荧光PCR时，要对多条探针进行“pair dimer”进行分析。 6．探针的5’端不能为G 因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 7．Taqman探针与引物之间的位置
两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则
两种定量分析方法的比较及Taqman 探针、引物设计原则 遗传物质DNA 首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA （mRNA ）,携带遗传信息的mRNA 从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA 携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA 完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA 的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA 含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 定量PCR 仪是在普通PCR 仪的基础上加装了荧光激发装臵和荧光检测装臵，PCR 扩增和检测同时进行；在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 定量PCR 常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct 值 扩增曲线：反映PCR 循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR 仪每次轮PCR 扩增都会自动记录 荧光强度的变化 荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设臵的原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保 证回归系数大于0.99。 CT 值： PCR 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 扩增曲线 阈值及CT 值 荧光定量PCR 的数学原理 理想的PCR 反应： X=X0*2n 非理想的PCR 反应： X=X0* (1+Ex)n （n ：扩增反应的循环次数；X ：第n 次循环后的产物量；X0：初始模板量；Ex ：扩增效率） 在扩增产物达到阈值线时 : C(t) value
垂直式探针卡项目计划书(项目投资分析)
第一章项目总论 一、项目概况 （一）项目名称 垂直式探针卡项目 （二）项目选址 xxx高新技术产业示范基地 节约土地资源，充分利用空闲地、非耕地或荒地，尽可能不占良田或少占耕地；应充分利用天然地形，选择土地综合利用率高、征地费用少的场址。项目建设区域以城市总体规划为依据，布局相对独立，便于集中开展科研、生产经营和管理活动，并且统筹考虑用地与城市发展的关系，与项目建设地的建成区有较方便的联系。 （三）项目用地规模 项目总用地面积40453.55平方米（折合约60.65亩）。 （四）项目用地控制指标 该工程规划建筑系数63.75%，建筑容积率1.60，建设区域绿化覆盖率5.29%，固定资产投资强度177.66万元/亩。 （五）土建工程指标
项目净用地面积40453.55平方米，建筑物基底占地面积25789.14平 方米，总建筑面积64725.68平方米，其中：规划建设主体工程40148.13 平方米，项目规划绿化面积3421.74平方米。 （六）设备选型方案 项目计划购置设备共计90台（套），设备购置费4403.12万元。 （七）节能分析 1、项目年用电量556462.07千瓦时，折合68.39吨标准煤。 2、项目年总用水量34509.88立方米，折合2.95吨标准煤。 3、“垂直式探针卡项目投资建设项目”，年用电量556462.07千瓦时，年总用水量34509.88立方米，项目年综合总耗能量（当量值）71.34吨标 准煤/年。达产年综合节能量20.12吨标准煤/年，项目总节能率24.50%， 能源利用效果良好。 （八）环境保护 项目符合xxx高新技术产业示范基地发展规划，符合xxx高新技术产 业示范基地产业结构调整规划和国家的产业发展政策；对产生的各类污染 物都采取了切实可行的治理措施，严格控制在国家规定的排放标准内，项 目建设不会对区域生态环境产生明显的影响。 （九）项目总投资及资金构成 项目预计总投资14706.96万元，其中：固定资产投资10775.08万元，占项目总投资的73.27%；流动资金3931.88万元，占项目总投资的26.73%。
四探针操作手册
南开大学 硅光电子学与储能实验室 Four-Point Probe Operation | 2011 四探针操作手册
四探针操作说明书 Four-Point Probe Operation 第1章引言 (1) 1. 目的 (1) 2. 应用范围 (1) 3. 测试设备 (1) 四探针 (1) 数字电压源表 (2) 第2章原理简述 (3) 1. 薄膜(厚度≤4mm)电阻率： (3) 2. 薄膜方块电阻 (3) 第3章操作方法 (5) 1. 引言 (5) 2. 测试线连接方式 (5) 3. KEITHLEY 2400高压源表设置指南 (6) 4. 探针接触方式 (8) 5. 数据测试指南 (8) 第4章注意事项 (10) 附表 ................................................................................................................................................... I
第1章引言 1.目的 本说明书主要介绍用四探针法测试薄膜方块电阻及电阻率的原理及具体操作方法。 2.应用范围 测量参数：方块电阻，电阻率 测量样品：均匀薄膜，均匀薄片 方块电阻测试范围：0.01?～500M? 电阻率测试范围：10-5??cm～103??cm 样品大小：直径>1cm 精度：<±5% 3.测试设备 四探针 生产厂商： 广州四探针有限公司RTS-2型 基本指标： 间距：1±0.01mm； 针间绝缘电阻: ≥1000MΩ； 机械游移率: ≤0.3％； 探针：碳化钨或高速钢材质，探针直径Ф0.5mm； 探针压力：5～16 牛顿(总力)； 使用环境： 温度:：23±2℃； 相对湿度：≤65％； 无高频干扰； 无强光直射； 基本参数： Fsp=0.1 探针间距：1.0mm
qPCR引物设计原则及具体操作步骤
qPCR引物设计原则及具体操作步骤 1.找基因（DNA） 1)通过英文名称查找 通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称 →进入NCBI官网 →点击网页右下角GenBank，进入GenBank界面 →在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search搜索即可 2)通过序列号查找 通过查找文献，找到相应基因在GenBank上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。 例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。 3)通过引物查找 通过查找文献，找到别人用过的对应的引物 →在NCBI官网右下角点击Primer-BLAST →输入正、反向引物序列 →设置对应参数 →点击“Get Primers”进行搜索即可 4)找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存 序列。
2.qPCR引物和TaqMan探针的设计 1)引物设计注意事项 a)引物长度17bp-25bp为佳。太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出 现引物高级结构的几率增加。两者都会干扰定量结果的准确性 b)扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180） c)引物的Tm值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距 不超过1℃，推荐使用Primer Premier 5进行Tm值计算； d)引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其 是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。 e)引物设计时请尽量避开TC或者AG的连续结构。 f)3’端不能超过3个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能 搭上 g)特异性要有保证，与非特异模板3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4个及以上的 GC互搭 h)引物3’端最后五个碱基不能包含超过2个以上的G或者C i)引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间 j)正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域 k)在Primer-BLAST设计时，在Organism 处选择相应物种 l)需跨外显子设计，避免基因组污染 2)TaqMan探针设计指南 a)探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔1~5个 碱基（一般10个以内，最好是1个碱基）。 b)应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免GGGG或者更多的连续G出现。 c)探针5’端应避免使用碱基G，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存 在淬灭作用 d)3’端应避免使用碱基A
垂直式探针卡项目简介(立项备案申请)
垂直式探针卡项目简介 一、基本情况 （一）项目名称 垂直式探针卡项目 （二）项目建设单位 xxx公司 （三）法定代表人 董xx （四）公司简介 公司将“以运营服务业带动制造业，以制造业支持运营服务业”经营 模式，树立起双向融合的新格局，全面系统化扩展经营领域。公司为以适 应本土化需求为导向，高度整合全球供应链。 公司已拥有ISO/TS16949质量管理体系以及ISO14001环境管理体系， 以及ERP生产管理系统，并具有国际先进的自动化生产线及实验测试设备。公司自建成投产以来，每年均快速提升生产规模和经济效益，成为区域经 济发展速度较快、综合管理效益较高的企业之一；项目承办单位技术力量
相当雄厚，拥有一批知识丰富、经营管理经验精湛的专业化员工队伍，为研制、开发、生产项目产品奠定了良好的基础。 公司通过了ISO质量管理体系认证，并严格按照上述管理体系的要求对研发、采购、生产和销售等过程进行管理，同时以客户提出的品质要求为基础，建立了完整的产品质量控制体系，保证产品质量的优质、稳定。 上一年度，xxx投资公司实现营业收入24321.50万元，同比增长 26.81%（5142.16万元）。其中，主营业业务垂直式探针卡生产及销售收入为20707.76万元，占营业总收入的85.14%。 根据初步统计测算，公司实现利润总额5350.67万元，较去年同期相比增长472.34万元，增长率9.68%；实现净利润4013.00万元，较去年同期相比增长629.35万元，增长率18.60%。 （五）项目选址 某某高新技术产业开发区 （六）项目用地规模 项目总用地面积35371.01平方米（折合约53.03亩）。 （七）项目用地控制指标 该工程规划建筑系数69.65%，建筑容积率1.57，建设区域绿化覆盖率7.52%，固定资产投资强度180.15万元/亩。
甲基化引物探针设计方法
本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。
首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用https://www.wendangku.net/doc/8810307586.html,/methprimer/，较为简单直观。
直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图： 以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。
关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： a)引物长度一般在18-35mer。 b)G-C含量控制在40-60%左右。 c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g)退火温度Tm控制在58-60C左右。 h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 T aqMan 探针设计的基本原则： a)T aqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b)长度一般为18-40mer 。 c)G-C含量控制在40-80%左右。 d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e)在引物的5’端避免使用G。 f)选用比较多的碱基C。 g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。 另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。
探针的设计原则
实时荧光Taqman 探针设计的几个要点 实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、 引物的设计及评价。 荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信 标Molecular Beacon。 广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号 的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 (请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T 的模板可以区分得更为理想。 Taqman探针法已经得到广泛使用，不过有人认为这种技术利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，难 于做质控检测。 Real time PCR Taqman探针设计、实时多重PCR探针的选择和引物的设计及评价 一、实时荧光Taqman探针设计 总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的 片段是保守的。
两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则
两种定量分析方法的比较及Taqman探针、引物设计原则 遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA（mRNA）,携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行；在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化 荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保 证回归系数大于0.99。 CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 C(t) value 扩增曲线阈值及CT值 荧光定量PCR 的数学原理
垂直式探针卡项目投资建设可行性研究报告参考范本模板
垂直式探针卡项目 投资建设可行性研究报告 规划设计 / 投资分析
摘要 该垂直式探针卡项目计划总投资18423.85万元，其中：固定资产投资14198.27万元，占项目总投资的77.06%；流动资金4225.58万元，占项目总投资的22.94%。 达产年营业收入36422.00万元，总成本费用27547.96万元，税金及附加345.46万元，利润总额8874.04万元，利税总额10443.51万元，税后净利润6655.53万元，达产年纳税总额3787.98万元；达产年投资利润率48.17%，投资利税率56.68%，投资回报率36.12%，全部投资回收期 4.27年，提供就业职位664个。 本文件内容所承托的权益全部为项目承办单位所有，本文件仅提供给项目承办单位并按项目承办单位的意愿提供给有关审查机构为投资项目的审批和建设而使用，持有人对文件中的技术信息、商务信息等应做出保密性承诺，未经项目承办单位书面允诺和许可，不得复制、披露或提供给第三方，对发现非合法持有本文件者，项目承办单位有权保留追偿的权利。 概述、投资背景及必要性分析、项目市场研究、项目建设内容分析、项目建设地研究、土建工程设计、工艺技术方案、环保和清洁生产说明、企业卫生、项目风险评价、项目节能评估、项目实施安排方案、投资估算与资金筹措、盈利能力分析、综合评价结论等。
垂直式探针卡项目投资建设可行性研究报告目录 第一章概述 第二章投资背景及必要性分析 第三章项目市场研究 第四章项目建设内容分析 第五章项目建设地研究 第六章土建工程设计 第七章工艺技术方案 第八章环保和清洁生产说明 第九章企业卫生 第十章项目风险评价 第十一章项目节能评估 第十二章项目实施安排方案 第十三章投资估算与资金筹措 第十四章盈利能力分析 第十五章项目招投标方案 第十六章综合评价结论
实时荧光定量 原理 taqman 探针简介
实时荧光定量 PCR技术原理与应用 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。 图 1 实时荧光扩增曲线图 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧 光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光 背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再
呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）（如图 2 所示）。
用于筛选Wafer中不良Die的测试系统和方法与制作流程
本申请涉及一种用于筛选Wafer中不良Die的测试系统、方法、计算机设备及存储介质，其中该系统包括：测试主机、传输卡、多个测试卡以及探针卡；其中，所述测试主机通过串口与传输卡通讯用于获取每个测试卡上每个测试通道的测试结果；所述传输卡用于给所述多个测试卡供电，所述多个测试卡与所述测试主机是通过传输卡的串口进行通讯；所述测试卡都可以用于测试多个通道，每个通道上的信号以及电源都是通过所述探针卡连接到对应待测试的Wafer。本技术中的测试系统以及方法可以直接应用于自动化平台上，并且能实现多个通道的自动测试，可以有效地提升测试效率。 技术要求 1.一种用于筛选Wafer中不良Die的测试系统，其特征在于，所述系统包括：测试主机、传输卡、多个测试卡以及探针卡； 其中，所述测试主机通过串口与传输卡通讯用于获取每个测试卡上每个测试通道的测试 结果； 所述传输卡用于给所述多个测试卡供电，所述多个测试卡与所述测试主机是通过传输卡 的串口进行通讯； 所述测试卡都可以用于测试多个通道，每个通道上的信号以及电源都是通过所述探针卡 连接到对应待测试的Wafer。
2.根据权利要求1所述的用于筛选Wafer中不良Die的测试系统，其特征在于，所述传输卡与所述多个测试卡之间的信号以及供电链接需要在所述探针卡上实现，且所述传输卡与所述多个测试卡使用的连接器规格相同。 3.根据权利要求2所述的用于筛选Wafer中不良Die的测试系统，其特征在于，所述测试卡的数量为4张。 4.根据权利要求3所述的用于筛选Wafer中不良Die的测试系统，其特征在于，所述传输卡内设有传输子系统； 其中，所述传输子系统中单片机的GPIO用于控制4个开关的电源； 所述传输子系统中单片机的1个UART通过一个1选4路芯片来控制4个测试卡。 5.根据权利要求4所述的用于筛选Wafer中不良Die的测试系统，其特征在于，所述测试卡内设有测试子系统； 其中，所述测试子系统中信号切换模块用于信号开关切换； 电源开关控制模块用于电源开关的控制以及电流测量； 所述信号切换模块与所述电源开关控制模块均由系统芯片控制。 6.一种应用于如权利要求1-5任一项所述测试系统的用于筛选Wafer中不良Die的测试方法，其特征在于，所述方法包括： 在测试电脑上打开测试软件； 对测试卡和传输卡上电，并加载对应的固件程序； 从服务器下载Wafer Map，检查Wafer Map后安装Wafer和Probe； 读取产品信息检查原厂坏块，并进行电流检测、时间检测以及误码率检测； 擦除所有数据恢复原始状态；
定量PCR Taqman探针设计要领
定量PCR+Taqman探针设计要领 自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR 荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。 一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。 第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA 或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DN***段重叠的情况）内。 第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则： 总体原则 * 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 * 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。 * 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。 * 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G） * 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。 引物设计原则 * 序列选取应在基因的保守区段 * 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构 * 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 * Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% * 引物之间的TM相差避免超过2℃ * 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 * 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 * Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp
实时定量PCR引物和探针设计操作步骤Primer Express软件
实时定量PCR引物和探针设计操作步骤Primer Express软件 Primer Express 是实时定量PCR引物和探针设计的专用软件。遵守以下三个原则有助于快速建立定量PCR反应体系： 1.所有扩增按照同样的原则设计 (Primer Express)； 2.所有PCR反应在ABI PRISM ?7000/7900上使用同样的热循环条件； 3.所有反应使用相同的PCR试剂。 引物和探针的设计原则 下述原则的重要程度由上往下越来越低，请尽量满足编号靠前的条件。它们中有的已经在Primer Expre软件中设置成缺省值，有的则需要在选择引物和探针时由设计者加以运用。如果是设计SYBRGreen 引物，也要选择TaqMan Primer and Probe design并遵守这些规则，但是只需要合成引物就可以了。 TaqMan 探针： 1. 保持G-C含量在30-80%之间。 2. 避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。 3. 5' end不能是G。 4. 尽量使探针中的Cs多于Gs。如果不能满足，则使用互补链上的探针。 5. 对于单探针反应，用Primer Express?软件计算出来的Tm值应当在68-70 °C 之间。 引物：1. 在探针确定以后再选择引物。 2. 引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。 3. 保持G-C含量在30-80%之间。 4. 避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。 5. 用Primer Express?软件计算出来的Tm值应当在58-60 °C之间。 6. 3' end 的5个碱基中G and/or C碱基的总数不能超过2个。 实时TaqMan 引物和探针设计 Begin by opening Primer Express and selecting "File", "New", and "TaqMan? Primer & Probe Design". The following screen will appear. You can close the TaqMan? Primer & Probe Data box as shown.