5灵芝菌丝体液体发酵产胞外多糖的研究
灵芝菌丝体液体发酵产胞外多糖的研究
陈芳莉
冮
洁
李曼曼
包一彤
戴婷婷
屈子艳
陈芳莉，大连民族学院生命科学学院，１１６６００，辽宁大连经济技术开发区辽河西路１８号。
冮洁（通讯作者）、李曼曼、包一彤、戴婷婷、屈子艳，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：２００８－０４－２１
★大连民族学院太阳鸟项目
灵芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）全名灵芝草，属于菌物界，真菌门，担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，灵芝科，灵芝属［１］。灵芝有紫、赤、青、黄、白、黑６种颜色。随着人们对灵芝化学成分及其药理作用的深入研究，证实灵芝具有多种有效成分和广泛的生物学作用，其中从灵芝中提取出的灵芝多糖，更表现出免疫调节和抗肿瘤的重要作用，为寻找抗癌药物展示了良好的前景。灵芝及灵芝生物活性物质因其独特的理化特性和神奇的生物学功能而成为新型绿色饲料添加剂领域的研究热点［２］。目前，灵芝多糖的获得多从子实体中提取，但随着需求量增大，野生资源极为有限，获得子实体的人工栽培周期长，费工费时。利用液体深层培养菌丝体获取生物活性物质，具有培养周期短、能大规模生产、易于标准化等特点［３］。本试验通过对灵芝菌丝体液体发酵产胞外多糖条件的研究，从而提高灵芝的胞外多糖产量，为灵芝多糖的生产提供一条新途径。
１试验材料与方法１．１
试验材料１．１．１
菌种
黑灵芝、红灵芝和韩灵芝均购自朝阳市食用菌研
究所。
１．１．２试剂
葡萄糖、琼脂粉、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＣｌ、
ＣｕＳＯ４、ＣａＣｌ２、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖、乳糖、酵母浸膏、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵、ＶＣ、ＶＢ１、ＶＢ２、ＶＢ６，
以上试剂均为分析纯或化学纯。
１．１．３仪器
电子精密天平、电热恒温培养箱、无菌操作台、紫
外可见分光光度计、恒低温气浴摇床、ｐＨ酸度计、智能水分测定仪等。
１．２培养基
斜面培养基（ＰＤＡ培养基）：马铃薯２００ｇ、葡萄糖２０ｇ、
琼脂粉２０ｇ、水１０００ｍｌ，ｐＨ值自然。完全培养基：葡萄糖２０ｇ、蛋白胨２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、ＭｇＳＯ４０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ、
水１０００ｍｌ，ｐＨ值自然。１．３试验方法１．３．１
菌种活化
将保存菌种用接种针接入斜面培养基中，２５℃
恒温培养７ｄ。
１．３．２液体培养
在完全培养基中接入等量的菌体，培养温度２８℃，
摇床转速１５０ｒ／ｍｉｎ，培养７ｄ后测定菌丝体干重。
１．３．３菌丝体干重的测定
利用智能水分测定仪，用移液管吸取１０ｍｌ菌
液，烘干至恒重，测得每１０ｍｌ菌液菌丝体干重。
１．３．４胞外多糖的测定采用苯酚－硫酸法［４］。
２试验结果与讨论２．１
灵芝菌种的筛选
分别将培养的黑灵芝、红灵芝、韩灵芝菌丝体按
１０％的比例接种于完全培养基进行液体发酵，７ｄ后测
其菌丝体干重和胞外多糖含量，试验结果如图１所示。
１６１４１２
１０８６４２０
含量（ｇ／ｌ）
１韩灵芝
２黑灵芝
３红灵芝
菌丝体干重胞外多糖
图１
不同灵芝种类菌丝体生长及产胞外多糖的比较
试验结果表明：红灵芝发酵速度快，生长良好，菌丝体干重和胞外多糖产量都较高。故选择红灵芝为供试菌种。
２．２不同碳源对菌丝体生长和产胞外多糖的影响供试碳源为蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖、玉
米粉、马铃薯，取代完全培养基中的葡萄糖，加量分别
《饲料工业》?２００８年第２９卷第１６期
试验研究
为２０ｇ／ｌ，以完全培养基为对照，培养温度２８℃，摇床转速１５０ｒ／ｍｉｎ，培养７ｄ后测定菌丝体干重和胞外多糖，试验结果如表１所示。
表１碳源对菌丝体生长和产胞外多糖的影响
项目
葡萄糖
蔗糖
麦芽糖
可溶性淀粉乳糖
玉米粉
马铃薯菌液形态
较浓稠
浓稠
较浓稠
清澈
较浓稠
浓稠
较浓稠
菌丝体干重（ｇ／ｌ）
７．８
６．３
５．５
６．４
７．４
８．２
７．９
胞外多糖含量（ｇ／ｌ）
２．３２
２．６４
１．２０
０．７５
１．１１
３．６９
１．１３
菌体数目
＋＋＋
＋＋＋＋
＋＋＋
＋＋
＋＋＋
＋＋＋＋
＋＋
注：“＋”用来定性表示菌体数量多少，“＋”越多表示菌体数量越多。
下表同。
试验结果表明，红灵芝液体发酵的最佳碳源为玉米粉，其次为蔗糖和葡萄糖。
２．３不同氮源对菌丝体生长和产胞外多糖的影响供试氮源为酵母浸膏、牛肉膏、氯化铵、硝酸铵、麸皮、豆饼粉，取代完全培养基中的蛋白胨，添加量分别为２ｇ／ｌ，以完全培养基为对照，培养温度２８℃，摇床转速１５０ｒ／ｍｉｎ，培养７ｄ后测定菌丝体干重和胞外多糖，试验结果如表２所示。
表２氮源对菌丝体生长和产胞外多糖的影响
项目
蛋白胨酵母浸膏牛肉膏氯化铵硝酸铵麸皮
豆饼粉菌液形态
较浓稠
浓稠
较浓稠
清澈
清澈
浓稠
浓稠
菌丝体干重（ｇ／ｌ）
１０．０
１．１
３．５
７．７
１６．２
７．８
１４．９
胞外多糖含量（ｇ／ｌ）
３．３９
１．７５
０．２６
１．５４
１．５４
０．９５
１．１３
菌体数目
＋＋＋＋
＋＋
＋＋＋
＋＋＋
＋＋＋
＋＋＋
＋＋
由表２可见，红灵芝液体发酵的最佳氮源为蛋白胨，其次为麸皮和豆饼粉。
２．４不同维生素对菌丝体生长和产胞外多糖的影响分别向完全培养基中加０．００１ｇ／ｌ的ＶＣ、ＶＢ１、ＶＢ２、ＶＢ６，以完全培养基为对照，培养温度２８℃，摇床转速１５０ｒ／ｍｉｎ，培养７ｄ后测定菌丝体干重和胞外多糖含量，测得结果如表３所示。
表３维生素对菌丝体生长和产胞外多糖的影响
项目对照ＶＣＶＢ１ＶＢ２ＶＢ６菌液形态
较浓稠
较浓稠
较浓稠
浓稠
浓稠
菌体数目
＋＋＋
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
＋＋＋
胞外多糖含量（ｇ／ｌ）
１．５４
０．８８
０．６４
３．２１
１．７６
菌丝体干重（ｇ／ｌ）
４．９
４．７
４．０
８．６
６．９
试验结果表明，添加维生素Ｂ２和Ｂ６均能促进菌丝体的生长，获得较多的胞外多糖。其中，ＶＢ２的促进作用更为明显。
２．５无机盐对菌丝体生长和产胞外多糖的影响为了确定各种无机盐对灵芝产胞外多糖的影响，进行正交试验，各因素和水平如表４所示，正交试验结果见表５。
表４无机盐正交试验因素水平表Ｌ８（２７）（ｇ／ｌ）
１
２
Ａ
Ｋ２ＨＰＯ４
０
１
Ｂ
ＫＨ２ＰＯ４
０
０．５
Ｇ
ＣａＣｌ２
０
０．０１
Ｃ
ＭｇＳＯ４
０
０．５
Ｄ
ＦｅＳＯ４
０
０．０１
Ｅ
ＺｎＳＯ４
０
０．０１
Ｆ
ＭｎＳＯ４
０
０．０１因素水平
表５无机盐正交试验结果
项目
１
２
３
４
５
６
７
８
均值１
均值２
极差
Ａ
１
１
１
１
２
２
２
２
１．９８
２．８８
０．９
Ｄ
１
２
１
２
１
２
１
２
２．１５６
２．７
０．５４４
胞外多糖（ｇ／ｌ）
０．４１０
０．５１３
０．５３２
０．５２６
０．５４８
０．５８２
０．６６８
１．０８２
Ｂ
１
１
２
２
１
１
２
２
２．０５２
２．８０８
０．７５６
Ｃ
１
１
２
２
２
２
１
１
２．６８４
２．１８８
－０．６１２
Ｅ
１
２
１
２
２
１
２
１
２．６０４
２．２５２
－０．３５２
Ｆ
１
２
２
１
１
２
２
１
２．５６４
２．２９２
－０．２７２
Ｇ
１
２
２
１
２
１
１
２
２．６
２．６７２
０．０７２
注：极差是由均值２减均值１计算出来的，极差为正表示该无机盐对胞外多糖的产生有促进作用，极差为负表示无机盐抑制胞外多糖的产量。
表５试验结果分析表明，Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４和ＦｅＳＯ４能提高灵芝胞外多糖的产量；ＺｎＳＯ４、ＭｇＳＯ４和ＭｎＳＯ４对灵芝产胞外多糖有抑制作用；ＣａＣｌ２则对灵芝产胞外多糖的影响较小。
２．６温度对菌丝体生长和产胞外多糖的影响接种１０％培养的菌丝体，于１５０ｒ／ｍｉｎ的摇床，分别在２０、２５、２８、３０、３５℃温度下培养７ｄ，测定菌丝体干重和胞外多糖如图２所示。
胞
外
多
糖
含
量
（
ｇ
／
ｌ
）菌
丝
体
干
重
（
ｇ
／
ｌ
）
２
１．５
１
０．５
０
２０
１５
１０
５
０
菌丝体干重
胞外多糖
２０２５２８３０３５
温度（℃）
图２温度对菌丝体生长和产胞外多糖的影响
图２试验结果表明，红灵芝对温度敏感，温度低
试验研究
陈芳莉等：灵芝菌丝体液体发酵产胞外多糖的研究
于２５℃或高于３５℃，不利于其生长和胞外多糖的合成，２８℃是其生长和合成胞外多糖的最佳温度。２．７ｐＨ值对菌丝体生长和产胞外多糖的影响
将灵芝菌丝体接种于ｐＨ值分别为５、６、７、８、９、１０、１１的完全培养基中，测定其菌丝体干重和胞外多
糖含量，结果如图３所示。胞外多糖含量（ｇ／ｌ）
菌丝体干重（ｇ／ｌ）
１４
１２
１０８６４２０菌丝体干重胞外多糖
０
５
１０
１５
３．５３２．５２
１．５１０．５０
ｐＨ值
图３
ｐＨ值对灵芝菌丝体生长和产胞外多糖的影响
从图３可知，红灵芝适合生长在中性环境中，ｐＨ值为６时是其生长和产胞外多糖的最适ｐＨ值。过酸或过碱都不适宜其生长和胞外多糖的合成。
３结论试验所采用的黑灵芝、红灵芝和韩灵芝３种灵芝
菌种在液体培养条件下均能很好生长和产生胞外多糖，其中红灵芝生长情况最好，产胞外多糖的量最高。
其适宜的培养基组成为：玉米粉２０ｇ／ｌ、蛋白胨２ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４０．０１ｇ／ｌ、ＶＢ２０．００１ｇ／ｌ，
适宜培养温度２８℃，ｐＨ值６。食用菌在深层发酵培养的菌丝体与子实体在化学组成、生理功能上均很相似［５］。
在液体培养过程中，灵芝能产生较多的胞外多糖，具有广阔的应用前景。
参考文献
［１］陈国良，陈小清．灵芝有效成分研究综述［Ｊ］．中国食用菌，２００１，１４
（４）：２８－２９．［２］
晓艳，张日俊．灵芝真菌的液体深层发酵技术［Ｊ］．饲料工业，
２００５，２６（８）：２１－２３．
［３］李云，曾东方．食用菌液体深层发酵的研究热点［Ｊ］．食品工业科技，
２００６，２７（７）：１９８－２０１．
［４］张惟杰．复合多糖生化研究技术［Ｍ］．上海：上海科技出版社，
１９８７：６－７，２１１－２１３．［５］
朱道红，李春，杨劲伟．食用菌深层发酵工艺研究及功能性食品开发［Ｊ］．生物技术，２００２，１２（６）：４０－４１．
（编辑：王芳，ｘｆａｎｇ２００５＠１６３．ｃｏｍ）
摘
要
采用改进的离体消化法研究草鱼（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎｉｄｅｌｌｕｓ）对俄罗斯鱼粉、国产鱼粉１、
国产鱼粉２、罗非鱼鱼粉１和罗非鱼鱼粉２的消化能力，结果显示，２种国产鱼粉粗蛋白质含量（７２．１４％、６８．２６％）、蛋白质消化率（４９．７８％、４９．４１％）均显着高于俄罗斯鱼粉（６５．４１％、４７．８２％），且０ｈ时水解液中氨基酸总量显着高于俄罗斯鱼粉；２种罗非鱼鱼粉虽然粗蛋白质含量（５６．０３％、５２．６９％）相对较低，但它们的氨基酸生成量与俄罗斯鱼粉相近。研究表明：两种国产鱼粉中掺入了可以溶解的高含氮物质；罗非鱼鱼粉可以作为饲料原料被较好的利用；此方法可以对鱼粉真伪和蛋白质有效利用效果进行鉴定。
关键词
离体消化；草鱼；鱼粉；氨基酸
中图分类号
Ｓ８１６．４８
改进离体消化方法对四种鱼粉的质量鉴定和分析
李
婧
叶元土
谭芳芳
代小芳
高艳玲
诸葛燕
李高锋
张伟涛
李婧，苏州大学生命科学学院，２１５１２３，苏州市工业园区横一路苏州大学生命科学学院７０２幢２２２２室。
叶元土（通讯作者）、谭芳芳、代小芳、高艳玲、诸葛燕、李高锋、张伟涛，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：２００８－０３－２４
不同饲料原料对养殖品种具有不同的可利用性，同时同一养殖品种对不同的饲料原料消化利用能力也不同。消化率是评价饲料原料的可利用性和动物对饲料原料可利用的综合性指标之一；而离体消化率测
定具有快速和简单的优点，是对饲料原料可利用性的评价方法之一。
鱼粉掺假是影响配合饲料质量、引发养殖质量事故的主要因素之一，而对鱼粉质量的鉴定方法必须根据所掺假原料、手段等作相应的改进，同时，还要适合于饲料企业的检测条件。采用改进的离体消化率测定方法，在测定蛋白质消化率的基础上，增加水解液中氨基酸的生成量作为关键指标，是判别鱼粉掺入非蛋白氮（ＮＰＮ）、难消化的高蛋白含量原料（如部分水解羽毛粉）的有效方法，该种方法适合于饲料企业的检
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《饲料工业》?２００８年第２９卷第１６期
试验研究