液相色谱分析方法的建立

一. 方法建立的步骤

二．开始前应知道

1. 样品的性质

在开始方法建立之前，我们应该检查自己对样品的了解程度，并明确分离目标。

表 1 有关样品组分和性质的重要信息

所含化合物的数目

化合物的化学结构<官能团）

化合物的分子量

化合物的pKa值

化合物的UV光谱图

化合物在样品中的浓度范围

样品的溶解度

样品的化学成分能够为选择HPLC分离的最佳初始条件提供有价值的线索根据已知的样品信息，HPLC方法建立有两种不甚相同的模式。一种模式依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件，色谱工作者需很大程度依赖于过去的经验<如类似结构化合物的分离）和/或用文献资料补充现有信息而另一种模式则直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意这两种HPLC的方法建立模式可分别称为理沦型与经验型初始分离一旦开始，可以根据类似的思路<理论的与经验的）选择进一步的实验。b5E2RGbCAP

2.分离的目的

HPLC分离的目的必须十分明确，下面的问题在建立方法之初就应确定：

<1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？；

<2）是否有必要解读出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。p1EanqFDPw

<3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度通常能达到±1—2%，特别是不需样品预处理的情况。DXDiTa9E3d <4）特殊化合物可能会以不同的样品形式出现<如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。是否需要一种以上的HPLC方法？单一方法分离不同形态样品是否理想？RTCrpUDGiT

<5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变得非常重要。有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代价，如缩短柱长或加快流速。当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。5PCzVD7HxA

<6）将要使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行？jLBHrnAILg

方法建立实验开始之前，应明确对方法的这些要求。

三. 样品的预处理和检测

1. 预处理：样品来源形式不同，可能以如下形式出现：

<1）可直接进样的溶液；:

<2）需稀释、pH缓冲、加人内标或其它定容操作的溶液；

<3）必须首先溶解或提取处理的固体；。

<4）样品需预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害。

可直接进样的样品有操作方便、精密度好的优点，然而大多数HPLC分析的样品需称重或稀释定容后才能进样。当样品溶剂成分接近于流动相时，一般不会产生基线波动等问题，通常能够得到较好的结果。有些样品在注入HPLC前需进行部分分离<预处理），以除去干扰物、浓缩样品或消除“柱杀手”，因此了解样品和各种被测物的浓度范围非常重要。xHAQX74J0X

2. 检测：HPLC方法建立期间，在第一次进样前，我们必须有把握所选择的检测器能检测到所有的被测样品组分。通常首选可变波长紫外(UV>检测器，因这种检测器使用方便，且可用于大多数样品。UV光谱数据可从文献中查找，也可通过所测样品成分的化学结构估算，直接测得<如果可拿到化合物纯品）或在HPLC分离期间用二极管阵列检测器，或衍生化样品使检测信号增强。LDAYtRyKfE

四. 建立分离方法

1. 选择HPLC分离模式与起始条件

首先，我们要确定使用什么方法最合适；如果我们选定HPLC分离模式，将样品分为一般样品或特殊样品。一般样品为小分子典型混合物，用近乎标准化的起始条件即可分开。而样品特殊需用特殊的色谱柱和特定的条件才能很好地分离。Zzz6ZB2Ltk

一般样品可进一步分为中性或离子样品。离子样品包括酸、碱、两性化合物和有机盐类(电离的强酸或强碱>。如样品为中性，一般不需在流动相中加缓冲液或添加剂，但对于酸或碱性样品，通常需在流动相中加入缓冲剂。碱性或阳离子样品，推荐用“弱酸性”的反相色谱柱，流动相中加人胺添加剂可能对分离有利。首次实验完成后，再按照结果系统地加以进一步完善。dvzfvkwMI1

样品的性质

HPLC GC CE

SEC TLC

一般样品特殊样品

中性的离子的无机离子

异构体

对映体

生物样品等度肽类

糖类

梯度大分子

蛋白质

离子对核酸

糖类

正相合成聚合物

图1. 利用样品的有关条件，选择初始实验分离

条件

表2 特殊样品的处理

样品要求

无机离

子

检测为主要问题；使用离子色谱

异构体有些异构体能用反相HPLC分开，可分为一般样品类中；用

(I>正相HPLC或(2>环糊精—硅胶色谱柱的反相分离能较好

地分离异构体

对映体分离这些化合物需要“手性”条件

生物样品多种因素如分子构象，极性官能团和宽范围的疏水性使这

种样品很特殊

大分子“大”分子需要大孔径的色谱柱填料(≥10.m孔径>表3 首次HPLC分离的较好实验条件

分离条件较好的首要选择

色谱柱

尺寸(长度,内径ID>

粒度

固定相15ⅹ4.6cn

5um

a.

C8或C18

流动相

溶剂A和B缓冲液—乙睛%B80—

100% b.

缓冲液(化合物、pH、浓

度>25mM磷酸钾，2.0＜pH＜

3.0 c.

添加剂(如胺改性剂、离子

对试剂>

开始时不用

流速0.5—2.0 ml / min 温度35—45℃

样品大小

体积

重量 d.＜25ul ＜100ug

备注：a. 3.5um微粒为另一选择； b. 用于初始等度分离；初始用梯度实验较好；

c. 中性样品不需要缓冲液；

d. 小体积色谱柱<如7.5*0.46cm,3.5um）需要的量更小。rqyn14ZNXI

表4 主要HPLC方法的特性

方法/特点/色谱柱何时应该使用该方法

反相HPLC

流动相：水—有机溶剂

色谱柱：C18(ODS>、C8、苯基、三甲基硅烷(TMS>、氰基能溶于水一有机混合液的大多数

样品尤其是中性或非离子化合物的首选

离子对HPLC

流动相：水一有机溶剂，控制PH的缓冲液和离子对试剂

色谱柱：C18、C8、氰基离子或可电离的化合物，尤其是碱或阳离子样品的良好选择

正相HPLC

流动相：有机溶剂混合液

色谱柱：氰基、乙醇基、氨基、硅胶当反相或离子对HPLC无效时的第二个良好选择石不溶于水一有机混合液的亲脂样品的首选品异构体混合物和制备规模HPLC的首选(最好用硅胶〕

此处推荐的所有色谱柱〔除了未键合硅胶>均用健合相硅胶微粒装填。

当分离目的是为了分离制备纯样品时，优化的最终HPLC方法将不同于用于常规定量分析的方法。

2. 开始建立方法

在首次进样之前，唯一需做的选择是流动相中的有机调节剂比例<%B）。通常不推荐用中等强度的流动相开始方法建立。更好的选择是先用非常强的流动相<如80%—100%B），然后按需要降低%B。另一种有别于起始等度分离的方法是梯度洗脱，梯度分离一般使样品分离得更好。EmxvxOtOco

3. 改善分离

在HPLC定量分析中，分离开是首要要求。基线分离是提供精确结果的有效保障。

含有5个组分或更少的样品，使谱峰之间达到基线分离一般较为容易。分离度会随色谱柱的使用时间逐步降低，也会由于分离条件的微小波动而在不同时间有所变化，因此在建立简单混合物的分离方法时，最好使R≥2。这样的分离度将有利于改善测试精度和方法的普适性；含10团种或10种以上组分的样品，分离一般会很困难，目标分离度往往必须降低至R＞1.0—1.5。SixE2yXPq5

表5 HPLC方法建立的目标

目标评论

分离度精密和普适性好的定量分析要求R＞1.5

分离时

间

<5—10min时日常工作较理想

定量含量测定：≤2%(1SD>；要求不高的分析：≤5%；痕量

分析：≤15%

压

力

<如果为新柱）

高

溶剂消

每次运行少用流动相最好

耗

注：大约按重要性递减排列，但因分析要求不同而异。

有些HPLC测定不必使全部被测组分达到基线分离，这种情况最常见于所测样品中可能存在数种化合物但仅需检测其中的一种时。比如在普查水或土壤样品中的某污染物(如定性分析不同的除芳剂>时，仅需要分离出个别除莠剂，确定其特征保留时间进行峰鉴别即可。6ewMyirQFL

尽管大多数HPLC设备能在更高的压力下工作，使用新色谱柱的工作压力不应超过170bar<2500psi , 17MPa），压力上限最好在2000psi以下。kavU42VRUs

限制该压力基于两点原因：第一. 随着色谱柱的使用，微粒杂质会逐步堵塞柱头，使柱压成倍升高；第二. 较低的压力<< 170bar）适于泵、进样阀、尤其是自动进样装置的稳定工作，密封垫的寿命更长，色谱柱堵塞的情况减少，系统的耐久性明显提高。因此，最好以小于泵的最大允许压力的50%作为目标压力。y6v3ALoS89

4. 可重现的分离

在进行实验时，要能够重现每次实验色谱图。在方法建立过程中改变实验条件<流动相、色谱柱、温度）时，必须经过足够长的时间使色谱柱在新流动相和温度下达到平衡。通常以10—20倍柱体积的新流动相冲洗色谱柱后，色谱柱可达到平衡。M2ub6vSTnP

五．HPLC方法的完善

最后的实验方案应达到方法建立开始时所设定的所有目标。方法本身在日常工作中应经受住考验，应适用于所有的相关实验室以及人员。0YujCfmUCw

1. 定量与方法论证

一旦完成了HPLC方法建立，应对其进行论证，进行全面论证通常需通过简略核查方法的专属性、线性、准确性、精密度、回收率、灵敏度等而实施。在最终论证方法之前，应准备和检查书面分析方案，使之清晰、严密。实际的论证程序按方法的重要性不同，需时为1天一2周不等。理想的情况是，通过方法论证能找出可能因仪器和操作者的不同而导致的潜在问题。eUts8ZQVRd 在日常HPLC分析中，柱间重现性可能是主要问题之一。同种方法在不同批号的色谱柱上可能有不同的结果，任何意外的结果都应进行研究，以找出其原因，避免在日后的工作中出现同类错误。sQsAEJkW5T

表6 完善方法

1. 应预备数据表明所需方法的性能；

2. 应有为其它操作者使用的书面分析步骤；

3. 以一个以上的系统或操作者，用包括期望组分和期望被测物浓度的样品

系统地论证方法的性能；比较不同时间和不同实验室之间的实验数据；

4. 应得到色谱柱的期望寿命以及柱间重现性的数据；

5. 研究不正常的结果，以纠正潜在的问题；

6. 研究所有影响分离的条件<温度、流动相组成、pH等）；规定这些条件的限度；对可能发生的问题<关键谱峰对分离不足；随运

行时间延长，最末谱峰保留值增加等）提出建议措施。

备注：主要用于日常工作或质量监控方法

上表的要求适用于满足精密准确、稳定可靠并可移植转让的严格HPLC标准方法。在其它情况下，可能只要求一次成功的分离或能快速、“粗略”地答复某一特定问题，此时可免掉表5和表6中的许多建议，图1中一些步骤也可能是不必要的，仅明白并知道一个方法建立方案的真实目标就足够了。GMsIasNXkA

2. 解决出现的问题

随着方法建立的进行，会出现各种问题，其中有些已在表7中列出，其它的问题包括：开始时色谱图中有的谱峰可能比所期望的要宽<塔板数低），或谱峰严重拖尾；在方法应用中还会发现用同一<或不同）厂家的“规格相同”色谱柱替代原柱后，分离情况会变得难以接受，常规实验室无法用<规格相同的）另柱重复此方法；色谱柱寿命也可能很短<如进样不足100次即不能再用）；<同一色谱柱）重复进样的色谱图不一样，定量精度较差，保留时间从一系列运行的开始直至结束一直漂移；在后面样品的色谱图中可能出现了其它峰干扰被测物测定等。TIrRGchYzg

表7 方法建立和论证期间可能出现的问题

问题评论

塔板数低色谱柱选择不对，二次保留、峰形不

好的影响

色谱柱易变

色谱柱选择不对，二次保留的影响性

色谱柱选择不对，样品需预处理

色谱柱寿命

短

保留值变化色谱柱平衡不够，样品需预处理，键

合相流失

定量精度差需更好地校正，找出误差的来源

初始分离不够或初始样品无代表性出现新的千

扰峰

对于将长期使用的常规方法，最好在正式应用之前，对这些问题进行预测并加以改善。进人日常应用后才发现方法性能不好是不愿看到的情况，方法重现性差会影响质量控制或生产实验室的工作。7EqZcWLZNX

3. 方法的普适性

普适性好的方法指能容忍实验条件的微小变化、一般色谱工作者容易掌握、应用时也不必使用同一HPLC系统的方法，可移交他人使用。在论证期间，方法的普适性可通过深人细致地实验对该方法加以确证；也可将其设计成一种程式，研究不同条件对分离的影响。lzq7IGf02E

申明：

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液相色谱分析方法的建立

一. 方法建立的步骤 二．开始前应知道 1. 样品的性质 在开始方法建立之前，我们应该检查自己对样品的了解程度，并明确分离目标。 表 1 有关样品组分和性质的重要信息 所含化合物的数目 化合物的化学结构（官能团） 化合物的分子量 化合物的pKa值 化合物的UV光谱图 化合物在样品中的浓度范围 样品的溶解度 样品的化学成分能够为选择HPLC分离的最佳初始条件提供有价值的线索根据已知的样品信息，HPLC方法建立有两种不甚相同的模式。一种模式依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件，色谱工作者需很大程度依赖于过去的经验（如类似结构化合物的分离）和/或用文献资料补充现有信息而另一种模式则直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意这两种HPLC的方法建立模式可分别称为理沦型与经验型初始分离一旦开始，可以根据类似的思路（理论的与经验的）选择进一步的实验。 2.分离的目的 HPLC分离的目的必须十分明确，下面的问题在建立方法之初就应确定：（1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？； （2）是否有必要解析出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度通常能达到±1—2%，特别是不需样品预处理的情况。 （4）特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。是否需要一种以上的HPLC方法？单一方法分离不同形态样品是否理想？ （5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变得非常重要。 有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代价，如缩短柱长或加快流速。当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。（6）将要使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行？ 方法建立实验开始之前，应明确对方法的这些要求。 三. 样品的预处理和检测

高效液相色谱法的应用

高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展 摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。 关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用 在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，

色谱法是一种重要的分离分析方法,它是利用不同物质在两相

色谱扫盲班 第一课色谱法概述 色谱法是一种重要的分离分析方法，它是利用不同物质在两相中具有不同的分配系数(或吸附系数、渗透性)，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复分配而实现分离。在色谱技术中，流动相为气体的叫气相色谱，流动相为液体的叫液相色谱。固定相可以装在柱内，也可以做成薄层。前者叫柱色谱，后者叫薄层色谱。根据色谱法原理制成的仪器叫色谱仪，目前，主要有气相色谱仪和液相色谱仪。 色谱法的创始人是俄国的植物学家茨维特。1905年，他将从植物色素提取的石油醚提取液倒人一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，然后用石油醚淋洗，结果使不同色素得到分离，在管内显示出不同的色带，色谱一词也由此得名。这就是最初的色谱法。后来，用色谱法分析的物质已极少为有色物质，但色谱一词仍沿用至今，在50年代，色谱法有了很大的发展。1952年，詹姆斯和马丁以气体作为流动相分析了脂肪酸同系并提出了塔板理论。1956年范第姆特总结了前人的经验，提出了反映载气流速和柱效关系的范笨姆特方程，建立了初步的色谱理论。同年，高莱(Golay)发明了毛细管柱，以后又相继发明了各种检测器，使色谱技术更加完善。50年代末期，出现了气相色谱和质谱联用的仪器，克服了气相色谱不适于定性的缺点。则年代，由于检测技术的提高和高压泵的出现，高效液相色谱迅远发展，使得色谱法的应用范围大大扩展。目前，由于高效能的色谱往、高灵敏的检测器及微处理机的使用，使得色谱法已成为一种分析速度快、灵敏度高、应用范围广的分析仪器。 在这里主要介绍气相色谱分析法。同时也适当介绍液相色谱法。气相色谱法的基本理论和定性定量方法也适用于液相色谱法。其不同之处在液相色谱法中介绍。 第二课气相色谱仪 典型的气相色谱仪具有稳定流量的载气，将汽化的样品由汽化室带入色谱柱，在色谱柱中不同组分得到分离，并先后从色谱柱中流出，经过检测器和记录器，这些被分开的组分成为一个一个的色谱峰。色谱仪通常由下列五个部分组成： 载气系统（包括气源和流量的调节与测量元件等） 进样系统（包括进样装置和汽化室两部分） 分离系统（主要是色谱柱） 检测、记录系统（包括检测器和记录器） 辅助系统（包括温控系统、数据处理系统等）

实用高效液相色谱法的建立破解版

液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。 一、 基本术语基本术语 读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分 在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）： 图1. 典型色谱图 1. 保留因子(k)： t t t k R ?= (1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.04 2. 拖尾因子(T f )

液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 a b a f W W W T 2+= (2) 图2. 典型拖尾峰 在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63. 3. 理论塔板数（N ）

液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 图3. 峰高与峰宽的关系 2(16W t N R = (3) 或 2( 54.55 .0W t N R = (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。 设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=3410 4. 分离因子(α) 10 212t t t t k k R R ??= =α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。只有当α>1时，两个色谱峰才有分离的可能性。 设在图1中峰2的保留时间为6.50min, 则分离因子为: (6.50-1.20)/(3.65-1.20)=2.16

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.

液相色谱柱活化再生方法的建立

液相色谱柱活化再生方法的建立一、建立色谱柱档案：

二、液相色谱柱清洗、活化方法 当色谱柱使用较长时间之后，就可能发生柱压升高、分离度不好、柱效降低、峰形不好等情况，这时就需要根据故障原因对色谱柱进行清堵与再生，以延长色谱柱的使用寿命。具体原因及处理方法如下： （1）筛板堵塞与柱头塌陷：主要现象有柱压严重升高或不稳定、色谱峰拖尾、色谱峰变宽、色谱峰分叉、秃峰等，需要进行清堵与弹性复原处理。（此方法适合于任何类型有相同故障的色谱柱的处理，不同的是溶剂要与相应类型色谱柱匹配。） 主要处理方法如下： ①一般情况下，将色谱柱反接，不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速冲洗约4h→再正向连接，接或不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速冲洗约1h→再提高流速至1.0ml/min冲洗1h，观察柱压变化。若不凑效，则拧开柱头螺母（色谱柱进口），小心取下筛板，用5%左右的硝酸溶液超声处理20min左右，再用纯水超声20min左右。用小勺清理掉柱进口污染的部分填料，再将用乙醇调和后的相应的硅胶装入柱入口（也可用已经报废的同类柱中的填料替代），用平面

不锈钢小铲压紧填平至略高出柱管口，但量不宜太多，否则，压得太紧柱压会升高，然后装上清洗过的筛板，注意筛板安装方向必需与原装相同，最后紧固。 ②冲洗与饱和：清堵紧固后，先反向连接色谱柱，不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速冲洗约4h→再换成甲醇以0.5ml/min流速冲洗约2h →再正向连接色谱柱，接或不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速冲洗约2h→再换成甲醇以0.5ml/min流速冲洗约1h→然后用甲醇或乙腈以1ml/min流速冲洗约1h以上，再根据测试用流动相比例调整水-甲醇（或乙腈）比例，以1ml/min流速冲洗约1h，最后用测试用流动相平衡2h，进样测试即可。 ③特别说明：如不是特殊情况，按其他办法可行，则最好不要反冲色谱柱和拆卸筛板。（2）柱效降低：主要特征性现象有柱压基本正常，但出现拖尾峰、秃峰、分叉峰、前延峰、峰变宽、基线漂移、理论板数降低、分离度降低等。需要进行再生处理， 具体方法如下： ①一般情况下，顺接色谱柱，按如下溶剂顺序及条件冲洗：95%水-5%甲醇（或乙腈）（1.0ml/min，1h以上）→100％甲醇（1.0ml/min，1h以上）→100％乙晴（1.0ml/min，1h 以上）→75％乙晴-25％异丙醇（0.5ml/min，10倍柱体积以上）→100％异丙醇（0.5ml/min，10倍柱体积以上）→100％二氯甲烷（0.5ml/min，10倍柱体积以上）→100％正己烷（0.5ml/min，10倍柱体积以上，根据实际情况可忽略）→100%异丙醇（0.5ml/min，20倍柱体积以上）→95%水-5%甲醇（或乙腈）（0.5ml/min，30min；再升至1.0ml/min，10倍柱体积以上）→检测用流动相平衡2h或至基线平稳，进样测试。在冲洗过程中，随时关注柱压变化，确保不超过4000psi；若超出，可通过降低流速，升高柱温来调整，具体操作可咨询具备相关专业知识背景和实践经验的人士。 ②若上述方法效果不理想，可按如上溶剂顺序和条件，先反接色谱柱冲洗→再顺接色谱柱，用100%乙腈以1ml/min流速冲洗约2h→再用与流动相同比例的水-有机相以1ml/min流速冲洗约30min→最后用流动相平衡2h或至基线平稳，进样测试即可。 ③特别说明：再生过程必须随时关注柱压变化，柱压过高易导致硅胶变形与开裂及键合相极性端连接顺序紊乱，同时要保证再生时间足够。

色谱分析分离方法概述

色谱分析分离方法概述 本书是色谱世界《色谱技术丛书》的第一分册。全书共四章，主要说明了色谱法的发展及其在分析化学中的地位和作用，色谱法的特点、分类及性能比较，色谱法的原理，色谱模型理论等方面的内容。 第一章色谱法的发展及其在分析化学中的地位和作用 第一节色谱法发展简史 一、色谱法的出现 二、色谱法的发展 三、色谱法的现状和未来 第二节色谱法在工业生产和科学研究中的作用 一、色谱法在经济建设和科学研究中的作用 二、色谱法在分析化学中的地位和作用 第三节色谱法与其他方法的比较和配合 一、色谱法的特点和优点 二、色谱法和其他方法的配合 第二章色谱法的特点、分类及性能比较 第一节色谱法的定义与分类 一、按流动相和固定相的状态分类 二、按使用领域不同对色谱仪的分类 第二节现代色谱法的应用领域和性能比较 一、色谱法的应用领域

二、各种色谱方法的性能比较 第三章色谱法的原理 第一节色谱分析的基本原理 一、色谱分离的本质 二、色谱分离的塔板理论 第二节色谱法中常用的术语和参数 一、气相色谱中常用的术语和参数 二、液相色谱中常用的术语和参数 第三节色谱的速率理论 一、气相色谱速率理论 二、液相色谱速率理论 第四章色谱模型理论 第一节色谱模型概述 一、色谱模型理论的意义 二、色谱模型的建立 三、色谱模型的求解 第二节线性色谱 一、理想过程 二、反应色谱 三、扩散的影响 四、相间传质阻力的影响 五、同时含扩散与相同传质阻力的情形

第三节单组分理想非线性色谱 一、理想非线性色谱数学模型分析 二、谱带发展与流出曲线 三、理想非线性色谱间断解的数学意义———弱解 四、非线性反应色谱 第四节双组分理想非线性色谱 一、数学模型分析 二、情形 三、简单波的传播 四、激波 五、谱带的发展与保留值的计算 第一节色谱法发展简史 俄国植物学家茨维特于1903年在波兰华沙大学研究植物叶子的组成时，用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物。他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内的碳酸钙上形成三种颜色的6个色带。当时茨维特把这种色带叫作“色谱”.茨维特于1906年发表在德国植物学杂志上用此名，在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。把茨

液相色谱仪的原理和分析方法

液相色谱仪的原理及分析方法 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 特点： 1．高压：液相色谱法以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

高效液相色谱法的计算方法

高效液相色谱法的计算方法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1、对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱;凝胶或玻璃微球等,用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外,柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法(附录ⅣA)项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外,其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2、系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。 (1)色谱柱的理论板数（N,用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。 在选定的条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间ｔR（以分钟或长度计，下同,但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2),按n=5.5４(t R/Wｈ/2)2计算色谱柱的理论板数,如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数,应改变色谱柱的某些条件(如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等),使理论板数达到要求。 （2) 分离度（R)

(推荐)薄层色谱分析步骤及注意事项

薄层色谱分析步骤及注意事项 薄层色谱法(thin layer chromatography简写TLC)是物理化学的分离技术，常用于药物的分离与分析现对此方法的分析步骤及注意事项提点建议。 薄层色谱分析步骤 完成TLC分析通常需经制板、点样、展开、检出4步操作。 ⑴制板 在一平面支持物(通常玻璃)上，均匀地涂制硅胶、氧化铝或其他吸附剂薄层、样品的分离、检测就在此薄层色谱板上进行。 一般选用适当规格的表面光滑平整的玻璃板。常用的薄层板规格有：10cm×20cm、5 cm×20cm、20cm×20cm等。称取适量硅胶，加入0.2％～0.5%羧甲基纤维素钠溶液（CMC-N a），充分搅拌均匀，进行制板。一般来说10cm×20cm的玻璃板，3～5g硅胶/块；硅胶与羧甲基纤维素钠的比例一般为1：2～1：4。制好的玻璃板放于水平台上，注意防尘。在空气中自然干燥后，置1l0℃烘箱中烘0.5～lh，取出，放凉，并将其放于紫外光灯(254nm)下检视，薄层板应无花斑、水印，方可备用。 ⑵点样 用微量进样器进行点样。点样，先用铅笔在层析上距末端lcm 处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样，如果要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过。一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm.底线距基线1～2．5cm，点间距离为lcm左右，样点与玻璃边缘距离至少lcm，为防止边缘效应，可将薄层板两边刮去1～2cm，再进行点样。 ⑶展开 将点了样的薄层板放在盛在有展开剂的展开槽中，由于毛细管作用，展开溶剂在薄层板上缓慢前进，前进至一定距离后，取出薄层板，样品组分固移动速度不同而彼此分离。 ①展开室应预饱和。为达到饱和效果，可在室中加入足够量的展开剂；或者在壁上贴两条与室一样高、 宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖。 ②展开剂一般为两种以上互溶的有机溶剂，并且临用时新配为宜。

液相色谱分析方法开发的技巧

液相色谱分析方法开发的技巧 你是否一直头疼于液相实验室或是方法开发问题出现的各种意外状况？或许本文总结的“应该避免做的七件事【DDT（Don't Do That）】”可以帮到你。以下提到7个DDT并没有特别的先后顺序，但是如果都能避免的话，我相信可以让在实验室的日子少一些鸡飞狗跳，多一些岁月静好。 DDT #1：不要滴定含有有机溶剂的溶液 配制缓冲液和并调节其pH有三种方法：正确的方法，简便的方法和错误的方法。 例如我们打算配1000 mL pH 4.0，浓度为20 mM的醋酸盐缓冲液。 正确的方法根据一些网站或者计算工具的计算结果称量好需要的醋酸和醋酸钠的量，然后使用容量瓶稀释到1000 mL。或者也可以分别配好20mM的醋酸溶液和醋酸钠溶液，然后混合在一起直到测到的pH是4.0为止。这两种方法都可以得到大约1000 mL pH 4.0 浓度20 mM的缓冲液。 简便的方法是先配好1000 mL 20mM的醋酸钠溶液，然后使用浓醋酸滴定到pH达到4.0。这方法会配得比1000 mL稍微多的缓冲液，而且使用了高浓度的醋酸滴定，所以缓冲液浓度不再是20mM。但是这有关系吗？如果使用反相柱的话，缓冲液的浓度影响并不大，所以得到的谱图基本不会有差别。但是如果使用离子交换、HILIC、混合模式或是其他的离子作用模式，缓冲液的浓度就有影响了，这时使用上述两种不同方法配出来的缓冲液很可能得到不同的谱图。所以在这些情况下不管使用哪一种方法配制的缓冲液，都要把配制具体方法记录下来，确保以后的分析人员在重复实验时可以得到相同的分析结果。 错误的方法是将缓冲液与有机溶剂（如甲醇或者乙腈）混合后再进行pH滴定。要知道当把有机溶剂加入到水溶液中后，pH计会测出与加入有机溶剂前不同的数据，而且实验室的温度对滴定含有有机溶剂的缓冲液影响也大，我就有遇到使用这种方法配出的缓冲液，在夏天开发出来的方法，在冬天就没法重复，就是因为实验室温控不好而导致冬夏温差大，结果冬天和夏天利用这方法配制的缓冲液就有明显的差异。 当我们描述一个液相分析方法的缓冲液成分和pH时，习惯把其中的pH对应缓冲液中的水相部分的pH，而忽略加入有机溶剂后缓冲液的pH的变化。加入有机溶剂后，pH的值是会改变，但是如果我们每次都是以相同的方法配制的话，每次的改变都应该是相同的。DDT #1就是提醒我们一定要避免滴定含有有机溶剂的缓冲液。 DDT #2：避免在多个方法上使用同一支柱子 当两个不同的方法需要使用规格和描述完全相同的色谱柱时，避免使用同一支柱子，建议每个方法单独使用一支色谱柱。或许有人好奇在不同的方法上使用同一支柱子到底有什么不好呢？虽然看上去一柱多用挺方便和经济，但是我们迟早会发现前一个方法中的杂质，辅料或是较晚出峰的分析物很可能会在第二个方法中出现，甚至在使用同一支柱子以不同方法分析同一种分析物时，也可能会有

高效液相色谱法习题答案

第二十章高效液相色谱法 思考题和习题 1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测 不同点： 2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？ 采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。 目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。 3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？ 正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。 反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。 4．简述反相键合相色谱法的分离机制。 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。 反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。对于反相色谱的分离机制 目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制可用疏溶剂理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的"分子毛"，这种"分子毛'有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用，将会从水中被＂挤＂出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用，其结果使组分分子在固定相得到保留。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减小保留值，此即解缔过程，显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越

高效液相色谱法检验方法

生效日期20140101 负责姓名职位签名/日期 起草何瑞清QC 审核梁天静QC主管 批准张小伶质量部经理 分发部门： 部门份数部门份数QC室1 1 目的 建立高效液相色谱法检验程序 2 范围 本程序适用于高效液相色谱法检验标准操作 3 职责 3.1QC人员：严格按本程序操作 3.2QC主管：严格按本程序检查 4 内容 4.1 定义及概述 4.1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一 定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压 输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流 动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪 或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。 由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有 分离性能高，分析速度快的特点。 4.1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的 药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分

子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反 应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于 正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相 或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合 硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子 交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 4.1.3 仪器的组成和一般要求： 4.1.3.1 仪器的组成：高压输液泵、色谱柱、检测器、积分仪、打印机。 4.1.3.2 对仪器的一般要求： ——所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱 的填充剂和流动相的组分按各品种项下的规 定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学健合硅 胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用， 辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶 也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色 谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色 谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为 紫外吸收检测器。 ——在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符 合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。（紫外 分光光度法项下对溶剂的要求：用1cm石英吸 收池盛溶剂，以空气为空白（即空白光路中不 置任何物质），测定其吸收度。溶剂和吸收池 所吸收度，在220～240nm范围内不得超过 0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在 251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以 上时不得超过0.05。）

高效液相色谱方法的建立

高效液相色谱方法的建立 高效液相色谱法的应用远远广于气相色谱法。它广泛用于合成化学、石油化学、生命科学、临床化学、药物研究、环境监测、食品检验及法学检验等领域。它应用如此广泛，那么问题来了，我们在选择液相色谱法时该如何建立方法? 如何建立一个HPLC的方法? 能够开发一个新方法对于HPLC的初学者来说有很大吸引力，但是新手往往会感觉无法下手，其实完全不是那么一回事，只要你有一台双泵或者四元泵的HPLC，看了本文，就可以上手去做了。 首先我们要保证的一个根本原则是：我们要做出来的是一个有稳定，明显的分离，并且在检测器的响应明显，有定量理论基础的方法。 这句话中的“稳定”、“明显”是必要条件，有一点不达标方法就没意义。 然后，对于新手来说，最好遵守这样一个小原则：我们从不新建，我们只是套用。

一、在食品分析中的应用 1.食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸(邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等)、有机胺、矿物质等; 2.食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂(合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等)、抗氧化剂等; 食品污染物分析：霉菌毒素(黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等)、微量元素、多环芳烃等。

二、在环境分析中的应用 环芳烃(特别是稠环芳烃)、农药(如氨基甲酸脂类，反相色谱)残留等。 三、在生命科学中的应用 HPLC技术目前已成为生物化学家和医学家在分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具。其在生化领域的应用主要集中于两个方面： 1.低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。 2.高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶(各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等)的纯化、分离和测定。 过去对这些生物大分子的分离主要依赖于等速电泳、经典离子交换色谱等技术，但都有一定的局限性，远远不能满足生物化学研究的需要。因为在生化领域中经常要求从复杂的混合物基质，如培养基、发酵液、体液、组织中对感性趣的物质进行有效而又特异的分离，通常要求检测限达ng级或pg级，或pmol，fmol，并要求重复性好、快速、自动检测;制备分离、回收率高且不失活。在这些方面，HPLC具有明显的优势。 四、在医学检验中的应用 体液中代谢物测定;药代动力学研究;临床药物监测： 1.合成药物：抗生素、抗忧郁药物(冬眠灵、氯丙咪嗪、安定、利眠宁、苯巴比妥等)、黄胺类药等。

色谱分析和其他分析方法的对比

.1.气相色谱与光谱、质谱法比较 气相色谱法的最大优点是易分离。分析多组份混合物，光谱(红外，紫外光谱)、质谱法就不及色谱法。而且一般来说色谱法的灵敏度与质谱接近，比光谱要高，造价却比光谱、质谱仪都低。色谱法的缺点主要是难以对未知物分析定性，如果没有已知的纯样品或已知纯样品的色谱图，就很难判断某一色谱峰究竟代表何物。而质谱则既能分析多组份混合物，且可测定出未知物的分子沮。用光谱法可以测出分子中含有那些官能团。这些都是气相色谱法所不及的。所以把色谱与质谱、光谱结合起来联用，就可以解决未知物的分析问题，发挥更大的作用，成为目前解决复杂混合物强有力的先进手段之一。这种结合包括收集色谱分离后的单组份或窄馏份，用光谱、质谱定性。色谱一质谱联用，色谱一光谱联用等。国内利用毛细管色谱一质谱联用仪成功地解决了一些油品的组份分析。不论从速度或效果看，都是十分理想的。比如最好的鉴别仪器是在线微波水分仪等等。 2．近红外光谱分析法 与常规分析技术不同，近红外光谱是一种间接分析技术，必须通过建立校正模型（标定模型）来实现对未知样品的定性或定量分析。具体的分析过程主要包括以下几个步骤：一是选择有代表性的样品并测量其近红外光谱；二是采用标准或认可的参考方法测定所关心的组分或性质数据；三是将测量的光谱和基础数据，用适当的化学计量方法建立校正模型；四是未知样品组分或性质的测定。由近红外光谱分析技术的工作过程可见，现代近红外光谱分析技术包括了近红外光谱仪、化学计量学软件和应用模型三部分。三者的有机结合才能满足快速分析的技术要求，是缺一不可的。 与传统分析技术相比，近红外光谱分析技术具有诸多优点，它能在几分钟内，仅通过对被测样品完成一次近红外光谱的采集测量，即可完成其多项性能指标的测定（最多可达十余项指标）。光谱测量时不需要对分析样品进行前处理；分析过程中不消耗其它材料或破坏样品；分析重现性好、成本低。对于经常的质量监控是十分经济且快速的，但对于偶然做一两次的分析或分散性样品的分析则不太适用。因为建立近红外光谱方法之前必须投入一定的人力、物力和财力才能得到一个准确的校正模型。 近红外光谱主要是反映C-H、O-H、N-H、S-H等化学键的信息，因此分析范围几乎可覆盖所有的有机化合物和混合物。加之其独有的诸多优点，决定了它应用领域的广阔，使其在国民经济发展的许多行业中都能发挥积极作用，并逐渐扮演着不可或缺的角色。主要的应用领域包括：石油及石油化工、基本有机化工、精细化工、冶金、生命科学、制药、医学临床、农业、食品、饮料、烟草、纺织、造纸、化妆品、质量监督、环境保护、高校及科研院所等。在石化领域可测定油品的辛烷值、族组成、十六烷值、闪点、冰点、凝固点、馏程、MTBE含量等；在农业领域可以测定谷物的蛋白质、糖、脂肪、纤维、水分含量等；在医药领域可以测定药品中有效成分，组成和含量；亦可进行样品的种类鉴别，如酒类和香水的真假辨别，环保废弃物的分检等。 3. 一、近红外光谱技术的发展过程：近红外区域按ASTM定义是指780~2526 nm范围内的电磁波，是人类最早发现的非可见光区域。50年代中后期，近红外光谱漫反射分析技术开始广泛应用于农副产品的测定。 进入60年代中后期，随着（中）红外光谱技术的发展及其在化合物结构表征中所起的巨大作用，人们淡漠了近红外光谱在分析测试中的应用。直至80年代后期，近红外光谱才真正为人们所注意，这在很大程度上归功于化学计量学方法的应用，再加上过去中红外光谱技术积累的经验，使近红外光谱技术迅速得以推广。

色谱分析法

在离子色谱中检测器为电导检测器,以电解质溶液作为流动相,为了消除强电解质背景对电导检测器的干扰,通常除了分析柱外,还增加一根抑制柱,这种双柱型离子色谱法称为化学抑制型离子色谱法. 但是如果选用低电导的流动相(如1×10-4~ 5 ×10-4M的苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐),则由于背景电导较低,不干扰样品的检测,这时候不必加抑制柱,只使用分析柱,称为非抑制型离子色谱法. 例如为了分离阴离子,常使用NaOH溶液为流动相,钠离子的干扰非常严重,这时可在分析柱后加一根抑制柱,其中装填高容量H+型阳离子交换树脂,通过离子交换,使NaOH转化为电导值很小的H2O,从而消除了背景电导的影响. 何为化学抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理 薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属于固－液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法。 薄层色谱法（TLC）是将样品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，利用不同组分迁移的速度不同，使样品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。 固定相：吸附剂流动相：展开剂分离原理：吸附、解吸附 特点：设备简单、操作方便专属性强、展开剂灵活多变、 色谱图直观和容易辨认具分离和分析双重功能 “三高、一快、一广”高灵敏度、高选择性、高效能 分析速度快应用广 分类（根据作为固定相的支持物不同）： ?薄层吸附层析（吸附剂） ?薄层分配层析（纤维素） ?薄层离子交换层析（离子交换剂） ?薄层凝胶层析（分子筛凝胶） 一般实验室中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即比移值（Rf）是化合物的物理常数，其大小与化合物的极性有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。 色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。 可用于精制样品，适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐

谈谈液相色谱方法开发

谈谈液相色谱方法开发 这次和大家探讨一些关于HPLC方法学开发的问题。当然，这是很久以前的思路，在今天看来是比较幼稚的，但是，如果能够给大家一点哪怕一点点启示也是好的。当然文章有很多缺陷，也希望大家批评。 高效液相色谱在极性的角度可以分成正相色谱分析和反相色谱分析。反相色谱分析一般使用水-甲醇-乙腈体系，一般选用C8，C10，C18 柱子，主要使用C18键合相柱子。非极性物质一般用氯仿-正己烷体系。因为qingqingcao没有做过正相HPLC分离，所以，我们主要关注反相HPLC分析。 色谱柱的选择 当然，选用的色谱柱一般就是C18柱。长度呢？如果分析的物质复杂，那么可以选取长一些的，比如250mm╳4.6mm╳5μm。保证其分离度。如果物质不是很复杂，那么选取150mm╳4.6mm╳5μm的色谱柱，可以有效地缩短分析时间。 检测器的选择 紫外检测器是最通用的检测器之一，所以，本文均以紫外检测器做说明。对于需要分析的物质，做全波长扫描，由于物质的不同官能团，他们会在不同的地方有吸收。通过综合选取大家都有吸收的波长。选择波长需要有权衡。同时也可以用一些特殊的波长，避免杂质的吸收，也可以提升测试准确度。或者使用双波长的方法。 流动相的选择 对于选取流动相，首先实验一下样品的溶解度。样品在水中，甲醇，乙腈中溶解程度。如果，很容易溶解在水中，这就告诉我们，流动相选取，可能有机相要少些，比方说测试维生素C，其极性很强，流动相中有机相比例不能多。（为了保护色谱柱，有机相比例一般不少于8% ）

如果，样品不太容易溶解在水中，那么有机相的比例应高些，比方像维生素E，就可以用90% -95% 的甲醇体系。 其次是样品的酸碱度。我们知道，C18色谱柱流动相pH在2-8 之间。太酸，太碱都可能损坏色谱柱。流动相pH值对于分离有一定作用，所以，酸性物质，一般流动相酸一些，碱性物质可能碱一些。 对于几种物质的分离。如果不是太多的物质，用等度方法会比较好。流动相一般开始选用20mM磷酸缓冲盐-乙腈体系。（pH一定，流速一定）。因为乙腈洗脱好，而且粘度低。 通过水相-有机相的比例的改变，观察各色谱峰的分离情况。这样可以运用无限夹逼法找到最合适的值。比方说，35：65（ACN：磷酸盐）达到分离，但是还是有部分叠加，那么就微调即可。当然还要考虑到分析时间问题。不要为了完全分离而牺牲了分析时间。所以，在色谱分析，有一个k值（容量因子）。κ∈（2，20） 如果真的无法改变，那么可以试着微调pH值，来分离。当然，由于乙腈毒性强，所以通过一定计算，用甲醇同等地接替乙腈。 如果有些物质很靠近死体积，那么需要考虑添加0.02mM离子对试剂，加强物质的保留能力。 流速 一般液相流速在0.8-1.4ml/min。首选1.0ml/min 柱温 柱温不影响色谱的分离，但是，相对稳定的温度，可以使得保留时间稳定。 进样量 手动进样，只有进样环。一般也就是20μL。自动进样的选择很多。但是，最好不要超过