invitrogen_TRIZOL_中文说明书

TRIZOL? Reagent

Cat. No. 15596-026 Size: 100 ml

Store at 2 to 8°C.

警告：在与皮肤接触及吞咽有毒。可导致烧伤。与皮肤接触后，应立即用洗涤剂和大量水冲洗。如感到身体不适，应就医（如需要，应出示本产品标签）。本产品含有苯酚（108-95-2）和其他成分（NJTSRN 80100437-5000P）。

已经证明TRIZOL 在室温下可稳定保存12个月。不过，我们建议在储存于2-8°C，以保证最佳性能。

描述：

TRIzol试剂（美国专利号，5346994）是即用型细胞和组织总RNA提取试剂。该试剂是一步法苯酚和异硫氰酸胍解决方案，是对Chomczynski和Sacchi开发的单步RNA提取法（1）的改善。在匀质化或溶解样品中，TRIzol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分离成水相和有机相。RNA存在于水相。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，样品中DNA和蛋白质可通过相继沉淀回收（2）。用乙醇沉淀可从中间相得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质（2）。与DNA的共纯化可能对不同样品得到的RNA的归一化有用。

此技术可完美应用于少量人类、动物、植物或细菌来源的组织（50-100毫克）和细胞（5×106），以及大量的组织（≥1 g）和细胞（>107）。该TRIzol试剂方法简单，允许大量样本同时处理。整个过程可在一小时内完成。用TRIZOL提取总RNA可避免蛋白质和DNA 污染。可用于Northern blot分析、斑点杂交、poly（A）+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。聚合酶链反应（PCR反应）中，当两条引物位于单个外显子时，推荐使用扩增级DNA酶I(Cat. No. 18068)处理分离出的RNA。

TRIzol试剂方便提取不同种类、不同分子大小的RNA。例如，从大鼠肝中提取RNA，

经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，高分子量RNA离散带其长度可高达7 kb和15 kb，(组成mRNA’s和hnRNA’s)，两个主要的核糖体RNA带在~5 kB（28 S）和~2 Kb（18 S）。低分子量RNA介于0.1和0.3 kB之间（tRNA，5S）。分离出的RNA用TE稀释，其A260/A280比值≥1.8。

防止RNA酶污染的注意事项

通过不当的技术操作，RNA酶可在任何提取程序中意外引入RNA的制备中。由于酶的活性难以抑制，所以必须防止其引入。进行RNA工作时，下列准则应予以遵守。

? 总是戴着手套。皮肤上通常包含的细菌和霉菌，可污染RNA的制备，同时也是RNA 酶的一个来源。良好的微生物操作技术可防止微生物污染。

? 使用无菌制品，专为RNA工作准备的一次性塑料器皿和自动吸管可以避免与共用设备的RNA酶交叉污染。例如，一个实验室正在使用的RNA探针可能用得上RNA酶A或RNA酶T1以减少过滤背景，其中任何非一次性物品（如自动吸管）可能是大量RNA酶的来源。

? TRIzol试剂的存在，可保护RNA酶对RNA的污染。下游样品处理要求非一次性的玻璃器皿或塑料器皿无RNA酶。玻璃物品可以在150 °C烘烤4小时，塑料制品，可浸泡10分钟的0.5 M NaOH溶液，然后用清水彻底冲洗，并高压蒸汽灭菌。

其他需要注意的事项：

? 用小于2毫升体积的TRIZOL试剂工作时，建议使用一次性透明聚丙烯管。

? 对于较大的体积，用玻璃（Corex）或聚丙烯管，并测试以确保该管装满TRIzol试剂和氯仿时可承受12,000×g的离心力，不要使用泄漏或有裂纹的管子。

? 离心前小心平衡管子的重量

? 玻璃管必须用封口膜密封，密封时封口膜要覆盖有螺丝处，聚丙烯管离心前必须盖好。RNA提取的指导：

警告：当使用TRIzol试剂工作时，应使用手套，并保护眼睛（屏蔽、安全护目镜）。避免与皮肤或衣服接触。使用化学通风橱。避免吸入蒸气。

除非特别注明，所有程序均在15 -30°C下进行，试剂也放置于15 -30°C。

需要的试剂为：

? 氯仿

? 异丙醇

? 75% 酒精(溶于DEPC处理的水中)

? 无RNase 的水或0.5% SDS溶液[RNase-free水的准备：把水加入到RNase-free的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC)至0.01% (v/v). 静置过夜，高压蒸汽灭菌。SDS溶液必须使用DEPC处理的水，并高压灭菌。]

1. 均质化(see notes 1-3)

a. 组织

均质50-100毫克组织样本需要1毫升的TRIzol试剂，使用特富龙玻璃?或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER? TISSUMIZER ?或相当的仪器）。均质时样本体积不应超过TRIzol试剂体积的10％。

b. 单层细胞

直接在培养皿中裂解细胞，3.5厘米直径的皿中加入TRIzol试剂1毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。TRIzol试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10平方厘米加入1毫升）。TRIzol试剂量不足可能会导致分离出的RNA有DNA的污染。

c. 悬浮细胞

离心沉淀细胞。在TRIzol试剂中重复吹打以裂解细胞。1毫升试剂用于5-10×106的动物、植物或酵母细胞，或1×107细菌细胞。使用TRIzol试剂前应避免洗涤细胞，因为这增加了mRNA降解的可能性。一些酵母和细菌细胞的裂解可能需要使用均质器。

可选: 一些样品可能需要额外的分离步骤，这些样品蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高，如肌肉、脂肪组织、以及部分植物块茎。同质化之后，2-8°C、12000 × g离心10分钟，移除不溶物。由此产生的沉淀含有细胞外膜结构、多糖、分子量高的DNA，而上清含有RNA。从脂肪组织等脂肪过多的样本收集的上层脂肪应弃去。在每种情况下，均应转移净化后的均质溶液到新管，加入氯仿进行下述相分离。

2. 相分离

15-30 °C孵育5分钟，以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。每1毫升的TRIzol试剂添加0.2毫升氯仿。小心盖好样品管。用手大力摇管15秒，15-30°C孵育2-3分钟。2-8°C，不超过12,000 ×g离心15分钟。离心后，混合物分离为红色下层（酚-氯仿相）、中间相以及上层的无色水相。RNA存在于水相。水相体积约为60％均质时使用的TRIzol试剂量。

3. RNA沉淀

水相转移到一个新管，并保存有机相（如希望分离DNA或蛋白质）。混合异丙醇以从水相中沉淀RNA。每1毫升用于初始的同质化的TRIzol试剂使用0.5毫升异丙醇。15到30℃孵育样品10分钟，2-8°C，不超过12,000 ×g离心10分钟。往往离心前RNA沉淀不可见，离心后在管侧面和底部形成一个凝胶样沉淀。

4. RNA洗涤

弃上清。用75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂使用至少1毫升75％的乙醇。涡旋混合。2-8°C，不超过7,500×g离心5分钟。

5. 重新溶解RNA

在该过程结束时，简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟）。不要真空离心干燥RNA。重要的是不要让RNA沉淀完全干燥，因为这将大大降低其溶解度。部分溶解RNA 样品，其A260/280比值<1.6。在无RNA酶的水中或0.5％SDS溶液中吹打几次溶解RNA，并在55-60°C孵育10分钟。（如RNA将用于之后的酶反应，应避免使用SDS。）RNA也可以用100％甲酰胺（去离子）再溶解并保存于-70℃（5）。

RNA Isolation Notes:

1. 从少量组织（1-10毫克）或细胞（102-104）分离RNA：加入800μl TRIZOL 到the tissue or cells.样品裂解后，加入氯仿，遵循上述步骤2进行相分离。在异丙醇沉淀的RNA之前，加入5-10微克无RNA酶的糖原（Cat. No 10814），以承载水相。为了降低粘度，加入氯仿前以2-26号针头剪切基因组DNA。糖原保留在水相，与RNA一起沉淀下来。浓度高达4 mg/mL的糖原既不抑制第一条链的合成，也不抑制PCR。

2. 同质化后，加入氯仿前，样品也可以存放在-60至-70℃至少一个月。RNA沉淀（步骤4，RNA洗涤）可以存储在75％乙醇中2-8℃至少一周，或在-5至-20 ° C至少一年。

3. 最大离心力只有2,600 × g的桌面型离心机也适合用于这些程序，只是在步骤2和3中，其离心时间应提高到30-60分钟。

DNA提取的指导:

如RNA分离方法所描述，完全除去水相后，位于中间相和苯酚相的DNA可被能分离。经沉淀和系列洗涤，DNA可溶解于8 mM氢氧化钠。使用TRIzol试剂可从组织和培养细胞完全回收DNA，可用于分析样品DNA含量（2）。同时提取的基因组DNA可用于每个基因组northern结果的归一化分析，而不是使用变动更大的总RNA或组织的重量。（根据来源，在进行其他程序之前，获得的DNA沉淀可能需要额外纯化（如酚提取））。

需要的试剂：

? 100%乙醇

? 0.1 M 柠檬酸钠in 10% 乙醇

? 75% 乙醇

? 8 mM NaOH

除非特别注明，所有程序均在15 -30°C下进行。

1. 沉淀DNA

移去水相后，用乙醇沉淀中间相和有机相中的DNA。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加0.3 毫升100%乙醇，颠倒混合。然后，15-30℃静置2-3分钟，2-8°C，不超过2,000×g 离心5分钟以沉淀DNA。

仔细移去水相，对于分离DNA的质量很重要。

2. DNA洗涤

移去苯酚-乙醇上清液（如需要，保存上清用于蛋白质分离）。用0.1M的柠檬酸钠溶液（溶于10%乙醇）洗两次沉淀的DNA。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加1 毫升溶液。每次清洗时，15-30℃静置30分钟DNA沉淀（间歇混匀），2-8°C，2, 000×g离心5分钟。洗涤2此后，用75％乙醇悬浮沉淀的DNA（每毫升TRIzol试剂加入75％乙醇1.5-2毫升），在15-30 °C静置10-20分钟（间歇混匀），然后2-8°C，2, 000×g离心5分钟。

对于包含> 200 μg DNA或大量非DNA物质的大沉淀，需要0.1M柠檬酸钠-10％乙醇溶液额外的洗涤。

3. 重溶DNA

打开离心管口，空气干燥DNA 5-15分钟。（不要离心干燥，因为溶解更难。）用8 mM氢氧化钠溶解DNA，至DNA浓度为0.2 – 0.3 μg/μl。通常添加300 – 600 μl of 8 mM NaOH to DNA isolated from 107 cells or 50 – 70 mg of tissue. 强烈推荐在弱碱中重悬，因为分离的DNA在水中或Tri缓冲液中不能重悬。8 mM NaOH 的pH值只有~9，一旦DNA溶解于其中，可以很容易的用TE或HEPES进行调节。在此期间，DNA（尤其是来自组织的DNA）中可能含有不溶性胶状物（膜碎片等等），>12,000 × g离心10分钟去除不溶物。将含DNA 的上清转移到一个新管。在8 mM NaOH 中溶解的DNA可储于4 °C过夜。如长期贮存，样品液应使用HEPES调整pH值至7-8（见表）并添加1 mM EDTA。一旦pH值调整后，DNA 就可以储存在4 °C或-20 °C。

溶于8 mM NaOH的DNA可在4℃保存数月，-20℃保存一年，-70℃未测定。

DNA定量与产量预测：

在8 mM NaOH中溶解的DNA，取出一部分与水混合，并测量其A260的值。用A260的值计算双链DNA含量。1 A260单位=50 μg双链DNA /mL。按照样本细胞数计算，每1×106人、大鼠或小鼠二倍体细胞可分别产生：7.1μg，6.5μg和5.8μg的DNA（3）。每mg肝和肾组织产生3-4 ug DNA，每mg骨骼肌、脑和胎盘可产生2-3 ug DNA；每106人、大鼠和小鼠来源的培养细胞可产生5-7 ug DNA。

应用

PCR扩增DNA ：

在8 mM NaOH中溶解DNA后，用HEPES调整pH值为8.4（见表）。添加0.1-1.0 μg DNA 样本至PCR反应混合物，执行标准PCR程序。

限制酶反应：

用HEPES调整DNA溶液的pH至希望的值（见表）。样本也可用1 mM EDTA，pH 7-pH 8.0进行透析。每μg DNA使用3-5个units的酶。对特殊的酶，使用酶制造商建议的条件，并让反应持续3-24小时。在一般实验中，80-90％的DNA可被消化。

溶解于8 mM NaOH的DNA样品的pH调整：

(1 ml 8 mM NaOH 使用以下量的0.1 M或1 M HEPES调整，不用酸)

DNA Isolation Notes:

1. 苯酚相和中间相可在2-8°C保存过夜。

2. 溶解于75%乙醇的样品可在2- 8°C下保存数月。

3. 溶解于8 mM NaOH 的样品可在2-8°C下保存过夜。为长期保存，应调整其pH to 7-8，并调整EDTA浓度至1 mM。

蛋白质分离指导：

用乙醇沉淀DNA（步骤1，DNA沉淀）后，蛋白质可从苯酚-乙醇上清中获得。由此产生的蛋白质可用于Western blotting分析（2）。

需要的试剂：

? 异丙醇

? 0.3 M 盐酸胍（溶于95%乙醇）

? 100%乙醇

? 1% SDS

1. 蛋白沉淀

酚-乙醇上清液（每毫升TRIzol试剂上清体积大约0.8毫升）中加入异丙醇可沉淀出蛋白质。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加1 .5毫升异丙醇。15-30 °C静置样品10分钟，然后2-8°C，12, 000×g离心10分钟以沉淀蛋白质。

2. 蛋白洗涤

弃去上清，用0.3 M盐酸胍溶液（溶于95%乙醇）洗涤蛋白质沉淀3次。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加2毫升洗涤液。每次洗涤中，15-30 °C静置蛋白沉淀20分钟，2-8°C，7,500×g离心5分钟。最后清洗后，加入2毫升乙醇，漩涡混匀蛋白沉淀。15-30 °C静置蛋

白沉淀20分钟，2-8°C，7, 500×g离心5分钟。

3. 重溶蛋白沉淀

真空干燥蛋白质沉淀5-10分钟。吹打溶于1％SDS。蛋白质沉淀的完全溶解可能需要在50 °C 孵育样品。2-8 °C，10,000×g离心10分钟，沉淀任何不溶物，并转移上清至新管。该样品可直接用于Western blotting或可储存在-5至-20℃以备将来使用。

Protein Isolation Notes:

1.用0.3 M盐酸胍溶液（溶于95%乙醇）或乙醇悬浮的蛋白质沉淀可在2-8°C保存至少一

个月，或-5至-20℃保存至少一年。

2.为更有效地回收蛋白，可采用下述替代方法：在2-8℃，更换3次0.1%SDS，透析苯酚-

乙醇上清。透析物10,000 × g离心10分钟。上清用于Western blotting。

3.如果SDS浓度足够低（<0.1％），蛋白质可用Bradford法量化，这样SDS它就不会对

结果有干扰。如没有出现洗涤剂-界面问题，就不应依赖A260/A280比值的测量（痕量的苯酚就可能导致蛋白质浓度被高估）。

问题与解答：

RNA ISOLATION

?每mg组织或1 × 106培养的细胞RNA产量的估计

肝脏和脾脏：6-10 μg

肾脏：3-4 μg

骨骼肌和脑：1-1.5 μg

胎盘：1-4 μg

上皮细胞(1×106个培养的细胞)：8-15 μg

成纤维细胞(1×106个培养的细胞)：5-7 μg

?产量低

样品均质化或裂解不完全。

最终的RNA沉淀没有被完全重溶。

?A260/A280比值<1.65

进行分光光度分析之前，RNA样品溶于水中而不是TE中。低离子强度和低pH值溶液可升高280 nm的吸光度（6，7）。

使用太小体积的试剂进行均质化。

均质化后，样品没有在RT放置5分钟。

水相中包含有苯酚相。

最终的RNA沉淀没有完全溶解。

?RNA降解

从动物身体取得组织后没有立即处理或进行冷冻。

用于分离的样品，或分离后的RNA保存在-5 to-20°C, 而不是-60 to -70°C。

用胰蛋白酶消化时细胞被破坏。

水溶液或管子不是RNase-free。

用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛，其pH低于3.5。

?DNA污染

使用太小体积的试剂进行均质化。

用于分离的样品含有有机溶剂(e.g., ethanol, DMSO)、强buffers、or碱性溶液。

? 蛋白多糖和多糖污染

经修改的下述RNA的沉淀步骤（步骤3）可从分离出的RNA中去除这些污染物。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加0.25 ml异丙醇到水相中，然后加入0.25 ml高盐沉淀液（0.8 M柠檬酸钠和1.2 M氯化钠）。混合溶液，离心，然后按照正常描述的程序进行分离。修改后，可有效沉淀RNA，并把多糖和糖蛋白保持在可溶状态。从含有很高多糖物质的植物样品中分离、纯化RNA，需要在初始匀浆后使用修改后方法进行沉淀，并额外离心（RNA分离程序note 2）。

DNA ISOLATION

?每mg组织或1 × 106培养的细胞DNA产量的估计

肝脏和肾脏：3-4 μg

骨骼肌、脑、胎盘：2-3 μg

培养的人、大鼠、小鼠细胞(1×106)：5-7 μg

成纤维细胞：5-7 μg

?产量低

样品没有完全均质化或裂解。

最终的DNA沉淀没有完全重溶。

?A260/280比值<1.70

进行分光光度分析之前，DNA样品溶于水中而不是TE中。

苯酚没有从DNA中有效去除。用溶于10%乙醇的0.1 M柠檬酸钠再洗涤DNA一次。?DNA 降解

从动物身体取得组织后没有立即处理或进行冷冻。

用于分离的样品，或分离后的RNA保存在-5 to-20°C, 而不是-60 to -70°C。

样品使用Polytron或其他高速均质器进行均质。

?RNA 污染

水相没有完全去除。

DNA沉淀没有用溶于10%乙醇的0.1 M柠檬酸钠进行有效洗涤。

?其他应用

进行PCR扩增之前，调整pH至8.4。

对于DNA的限制性内切酶消化，调整pH值为所需的值，，每μg DNA使用3-5个units 的酶。对特定的酶，在酶作用最佳条件下，反应3-24小时。通常80-90％的DNA会被消化。

PROTEIN ISOLATION

?产量低

样品没有完全均质化或裂解。

最终DNA沉淀没有完全重溶。

?蛋白质降解

从动物身体取得组织后没有立即处理或进行冷冻。

? PAGE电泳时条带变形

蛋白质沉淀没有有效洗涤。

References:

1. Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156.

2. Chomczynski, P. (1993) Biotechniques 15, 532.

3. Ausubel, F.M., et.al, eds. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York, p.A.1.5.

4. Simms, D., Cizdziel, P.E., Chomczynski, P. (1993) FOCUS? 15, 99.

5. Bracete, A.M., Fox, D.K., and Simms, D. (1998) FOCUS 20, 82).

6. Wilfinger, W., Mackey, K. and Chomczynski, P. (1997) BioTechniques 22, 474.

7. Fox, D.K. (1998) FOCUS 20, 37.

Teflon? is a registered trademark of E. I. Du Pont de Nemours & Co. TISSUMIZER? is a registered trademark of Tekmar Co.

TRIZOL ? is a registered trademark of Molecular Research Center, Inc.

*PCR is covered by a patent held by Hoffman LaRoche Corporation.