即用型蛋白质分子量标准(高)使用说明书

即用型蛋白质分子量标准（高）Premixed Protein Marker (High)

使用说明书

Takara Code : DPP531A

浓度: 0.5 μg/μl

制品内容（约100次量）

Premixed Protein Marker (High) 500 μl

制品说明

Premixed Protein Marker (High) 是由加热变性好的五种不同分子量的蛋白质组成，它的分子量范围为：44.3 KDa～200 KDa。本制品使用时无需任何处理，可以直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝R－250染色后的各种蛋白质的条带强度均一。每微升本制品的蛋白量为0.5 μg，每次电泳取5 μl（for SDS-PAGE mini gel）。以每次使用5 μl计算时本制品约可使用100次。

保存条件: -20℃

使用注意

推荐使用7.5～10％的聚丙烯酰胺凝胶。浓度太高，高分子量的蛋白分离效果不好，有可能聚集于分离胶的上部。使用方法

1. 直接取5 μl本制品进行7.5％～10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳（for

SDS-PAGE mini gel）。

2.7.5%、10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经考马斯亮蓝R-250染

色后的结果如下。

V2012.01 KDa

200.0

116.0

97.2

66.4

44.3

200.0

116.0

97.2

66.4

44.3

KDa

7.5% 10%

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量 一、前言 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式:

蛋白质数据库

生物芯片北京国家工程研究中心 湖南中药现代化药物筛选分中心 暨湖南涵春生物有限公司 常用数据库名录 1、蛋白质数据库 PPI - JCB 蛋白质与蛋白质相互作用网络 ?Swiss-Prot - 蛋白质序列注释数据库 ?Kabat - 免疫蛋白质序列数据库 ?PMD - 蛋白质突变数据库 ?InterPro - 蛋白质结构域和功能位点 ?PROSITE - 蛋白质位点和模型 ?BLOCKS - 生物序列分析数据库 ?Pfam - 蛋白质家族数据库 [镜像： St. Louis (USA), Sanger Institute, UK, Karolinska Institutet (Sweden)] ?PRINTS - 蛋白质 Motif 数据库 ?ProDom - 蛋白质结构域数据库 (自动产生) ?PROTOMAP - Swiss-Prot蛋白质自动分类系统 ?SBASE - SBASE 结构域预测数据库 ?SMART - 模式结构研究工具 ?STRING - 相互作用的蛋白质和基因的研究工具

?TIGRFAMs - TIGR 蛋白质家族数据库 ?BIND - 生物分子相互作用数据库 ?DIP - 蛋白质相互作用数据库 ?MINT - 分子相互作用数据库 ?HPRD - 人类蛋白质查询数据库 ?IntAct - EBI 蛋白质相互作用数据库 ?GRID - 相互作用综合数据库 ?PPI - JCB 蛋白质与蛋白质相互作用网络 2、蛋白质三级结构数据库 ?PDB - 蛋白质数据银行 ?BioMagResBank - 蛋白质、氨基酸和核苷酸的核磁共振数据库?SWISS-MODEL Repository - 自动产生蛋白质模型的数据库 ?ModBase - 蛋白质结构模型数据库 ?CATH - 蛋白质结构分类数据库 ?SCOP - 蛋白质结构分类 [镜像: USA | Israel | Singapore | Australia] ?Molecules To Go - PDB数据库查询 ?BMM Domain Server - 生物分子模型数据库 ?ReLiBase - 受体/配体复合物数据库 [镜像： USA] ?TOPS - 蛋白质拓扑图 ?CCDC - 剑桥晶体数据中心 (剑桥结构数据库 (CSD))

蛋白质含量测定方法及其比较资料2

蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较

值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材

生物信息研究中常用蛋白质数据库的总结

生物信息研究中常用蛋白质数据库简述 内蒙古工业大学理学院呼和浩特孙利霞 2010.1.5 摘要：在后基因组时代生物信息学的研究当中，离不开各种生物信息学数据库。尤其在蛋白质从序列到功能的研究当中，目前各种行之有效的方法都是基于各种层次和结构的蛋白质数据库。随着计算机技术及网络技术的发展，目前的蛋白质数据库不论是所包含数据量还是功能都日新月异，新的数据库层出不穷。一个新手面对如此浩瀚的数据量往往无从下手。本文粗浅地为目前蛋白质数据库的使用勾画出一个轮廓，作为自己蛋白质研究入门的一个引导。 关键词：蛋白质；数据库 0 引言 随着科技的发展，个人的知识往往赶不上快速膨胀的信息量，人们为了解决这个问题，便创建了形形色色的数据库。蛋白质数据库是指：在蛋白质研究领域根据实际需要，对蛋白质序列、蛋白质结构以及文献等数据进行分析、整理、归纳、注释，构建出具有特殊生物学意义和专门用途的数据库。蛋白质数据库总体上可分为两大类：蛋白质序列数据库和蛋白质结构数据库，蛋白质序列数据库来自序列测定，结构数据库来自X-衍射和核磁共振结构测定（详见图1）。这些数据库是分子生物信息学的基本数据资源。上世纪90年代，我国从事蛋白质研究的学者使用的蛋白质数据库储存介质还是国外实验室发布的激光光盘[1]。信息的传播储存甚为不便。随着蛋白质研究的发展飞快，同时伴随着计算机和因特网发展，蛋白质数据库的储存传播方式也发生的巨大的变化。进入21世纪后，我们所用的各种蛋白质数据库都发展成为存储在网络服务器上，基于“服务器—客户机”的访问查询方式。伴随着计算机及物理测试技术的发展数据库的容量和功能成数量级膨胀。但是面对如此浩瀚的数据，新手往往感到无从下手，在需要时找不到自己需要的合适数据库。 本文从目前蛋白质数据库建立的的逻辑层次出发，系统地简绍了常用蛋白质数据的概况，它们的查询方法以及它们相互之间的联系。同时尽量不涉及数据库建设和维护方面的计算机和网络这些数据库底层的技术，为蛋白质研究的入门者及对蛋白质感兴趣的人员的一个引导。

蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法

蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法 一、目的： （1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。 （2）学习用标准蛋白质混合液制作Ve，Kav对1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。 二、原理： 凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图17-1。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。实际上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即： Vt=Vo+Vi+Vg Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体 积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此Vt—Vo等于Vi+Vg 。它们之间的关系可用图17-3表示。洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。 它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成： 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的

蛋白质相对分子质量的测定(SDS法)

蛋白质相对分子质量的测定 (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法) 一、实验原理 蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。 聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。 二、仪器及器材 垂直电泳槽及附件、直流稳压稳流电泳仪、移液器等。 三、试剂 1、凝胶贮备液：称取30g 丙烯酰胺（Acr）和0.8g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），蒸馏水溶解后定容至100mL，滤纸过滤贮存。 2、10% SDS：称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。 3、10%过硫酸胺（AP），用时现配。 4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）。 5、电极缓冲液：3.03g Tris、14.14g甘氨酸、1.0g SDS溶于水，混匀后用HCL调节pH至8.3，加蒸馏水至1 000ml。 6、样品溶解（缓冲）液：0.6gTris、5mL甘油（丙三醇）1.0g SDS溶于水，混匀后用HCL调节pH至8.0，再加0.1g溴酚蓝、2.5mL巯基乙醇，定容至100mL。 7、下层胶（分离胶）缓冲液：18.17g Tris、0.4gSDS溶于水，混匀后用1mol/L HCL 调节pH至8.8，加蒸馏水至100ml。 8、上层胶（浓缩胶）缓冲液：6.06g Tris、0.4gSDS溶于水，混匀后用1mol/L HCL 调节pH至6.8，加蒸馏水至100ml。 9、固定液：25%异丙醇，10%乙酸。 10、染色液：0.125g考马斯亮蓝R-250加固定液250ml。 11、脱色液：冰乙酸75ml、甲醇50ml，加水定容至1000ml。

蛋白常用数据库

搞蛋白质的童鞋们，甭要只查NCBI了~蛋白质相关数据库启蒙~ ★ 小木虫(金币+1):奖励一下，谢谢提供资源 qinhy:恭喜，您的帖子被版主审核为资源贴了，别人回复您的帖子对资源进行评价后，您就可以获得金币了理由:资源贴2011-11-26 16:56 本来是带图的，可是弄过来就变成米图了，附件里面一个是PDF版、一个是WORD版均是带图的，童鞋们看带图的可能比较方便点哦~ 基于蛋白质序列的蛋白质相互作用位点预测（闲谈版） 这个不是论文不是论文啊~~这个是应某某的要求帮他找的，所以都是用现成的免费的网站数据库做的预测分析。无论文为依托，无原理为根据，纯粹就是流连各大网站作个的闲谈。 1、用这些网站先查查你要研究的蛋白质的底细。 这些网站的数据库大多数是实验或者一些相关文献报道的数据的组成。 ★String http://string.embl.de/ 输入你要搜寻的蛋白，它就把这个蛋白相关的数据反映给你，分confidence、evidence的数据可信度参考，同时还具有actions选项，反应它们之间可能是激活/抑制的关系。按按+、-号可以扩大缩小关联蛋白的数量范围。 往下拉一点点就是数据,哈哈，我们都要看数据吃饭啊~~ 分析的数据源自Neighborhood、Fusion、Occurrence、Coexpression、Experiments Database、Textminin及Homology，表示点得证明有数据，根据各项数据给出综合评分。评分越高相互存在关系可能性越高。点击下方各项图标等详细看到各项数据内容。 设条件确定筛选范围。 ★DIP https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,/dip/Main.cgi 跟上面的大同小异的功能，装上它附带的软件可能操作性会好一点，不过我米有试过哦。倒是跟它有链接的几个数据库都很强大，大家可以点击看看。 ★BIND http://www.bind.ca 文献有介绍的网站，不过我不能理解为什么我注册就注不了……. 2、继续查，用这些网站将要研究的蛋白质的家庭背景，月收入也大起底。 这里的网站可能跟相互作用方面的关系不大，但是如果知道这些，可以对研究的蛋白有更深的了解。 ★PDB https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,/pdb/home/home.do 要查3D结构就往这里查~通常说的PDB号为文献号末4位。 ★PIR https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,/pirwww/index.shtml 在蛋白质方面如NCBI般强大的网站，去上面晃荡下吧，会有收获滴。 ★KEGG http://www.genome.jp/kegg/ 粉强大的一个网站，我只说说它的KEGG PA THW AY子项，能迅速掌握一个蛋白质的功能通路，对于小白的偶们来说，很有用，有木有。 3、正题正题，做完上面那些后，接着就是纯预测的成分。也因为如此，要找着这些网站是很悲催的一件事。就算你找着了，你不懂语言，不懂算法，到底结果的可靠性怎样，见人见智。 需要PDB号作分析： promate http://bioinfo.weizmann.ac.il/promate/

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

实验六报告： SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 1.研究背景及目的 根据自然界中普遍存在的电泳现象，以及实践应用的需求，科学家不断完善了电泳技术，从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义，比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病（肾小管损坏、多发性骨髓瘤等）。这种需要促进了相关技术的发明。具体过程见原理。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。 1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用[1] 。 通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成 带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。SDS与蛋白质分子结合，不仅 使蛋白质分子带上大量的负电荷，而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率 主要取于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。通过本次实验，学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法，进一步学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。 2.原理 由于技术的发展，理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值，但是实际操作过于繁琐，且生物大分子的数量级是KDa，实际中往往不需要特别精确。所以转向寻求其它方法，如果两种性质具有相关性，就会有相关理论基础和技术，发现分子量与迁移速率有关，于是寻找相关方面的技术。通过沉降平衡法测定分子量，但是需要很大的转速，且要考虑安全性和造价，于是舍弃；分子筛层析主要以分子量差异进行分离，可以用来测定分子量，但是需要很长的分离柱，分离速度较慢，还要测定OD值，操作麻烦，浪费时间，而且带 来的经济效益也不是很大；与此同时，电泳技术也发展起来，电泳相对时间较短，造价低，可操作性强。电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关，其中含有分子量，理论上就可行了，于是用电泳测定分子量。首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异，从数学上彻底消除电荷效应是不可能的，使带电量相同也不可能实现，只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。想到通过引入外来物形成复合物，定量引入，定量结合，且结合后分子间差异并未发生改变。关于引入负电还是引入正电的问题，蛋白大多为球状，若结合后仍未球状，静电结合不稳定；双亲性物质彻底结合后破坏空间结构，所以引入负电，结合稳定。于是开始筛选阴离子去污剂，在众多的物质试验中，发现十二烷基硫酸钠（SDS）具有很好的效果。SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合，所引入净电 荷量约为蛋白质本身静电荷 10倍的静电荷，从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物，该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷

蛋白质相互作用数据库和分析方法

蛋白质相互作用数据库和分析方法 1. 蛋白质相互作用的数据库 蛋白质相互作用数据库见下表所示： 数据库名 说明 网址 BIND 生物分子相互作用数据库 http://bind.ca/ DIP 蛋白质相互作用数据库 https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,/ IntAct 蛋白质相互作用数据库 https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,/intact/index.html InterDom 结构域相互作用数据库 https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,.sg/ MINT 生物分子相互作用数据库 http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ STRING 蛋白质相互作用网络数据库 http://string.embl.de/ HPRD 人类蛋白质参考数据库 https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,/ HPID 人类蛋白质相互作用数据库 http://wilab.inha.ac.kr/hpid/ MPPI 脯乳动物相互作用数据库 http://fantom21.gsc.riken.go.jp/PPI/ biogrid 蛋白和遗传相互作用数据，主要来自于酵母、线虫、果蝇和人 https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,/ PDZbase 包含PDZ 结构域的蛋白质相互作用数据库 https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,/services/pdz/start Reactome 生物学通路的辅助知识库 https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,/ 2. 蛋白质相互作用的预测方法 蛋白质相互作用的预测方法很非常多，以下作了简单的介绍 1) 系统发生谱 这个方法基于如下假定：功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似．可以推断它们在功能上是相关的。

第三讲：Uniprot蛋白数据库及其他蛋白质分析工具

第三讲 Uniprot蛋白数据库及其他蛋白质 分析工具
2013/03/19

Uniprot数据库
? Uniprot（Universal?protein?resource)是蛋白 质序列的联合数据库。
– SIB:?Swiss?Institute?of?Bioinformatics – EBI:?European?Bioinformatics?Institute – PIR:?Protein?Information?Resource – 2002年三家联合形成了Uniprot

Swiss‐Prot
? 1986年建立 ? 低冗余度 ? 功能导向 ? 由Swiss?Institute?of?Bioinformatics?和EBI共同 建立并维护

TrEMBL
? TrEMBL=Translation?from?EMBL ? EBI建立并维护 ? 是一个自动数据库 ? 冗余度高，可信度低

UniprotKB
? 部分经过专家注释的数据库 ? 具有很高的可信度 ? 包括两部分UniprotKB/Swiss‐Prot和 UniprotKB/TrEMBL ? UniprotKB/Swiss‐Prot包括539,165条序列 ? UniprotKB/TrEMBL包括29,769,971?条序列 ? 具有非冗余性

Uniparc
? 非冗余性 ? 给予序列的特异性，非同一物种的相同序 列被认为是同一个蛋白质 ? 每一条序列被給予一个特异的编号

高等生化实验报告：蛋白质分子量的测定

实验一蛋白质分子量的测定—凝胶层析法 一、原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体

积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi。 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi。 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好是有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求得；Vi可由g×Wr求得（g为干胶重量，单位为克；Wr为凝胶的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。 如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积Vo，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为Vo 时，出现洗脱峰。 凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那

整理(蛋白质序列数据库)

蛋白质序列数据库 我们可以根据基因组序列预测新基因，预测编码区域，并推测其产物（即蛋白质）的序列。因此，随着基因组序列的不断增长，蛋白质序列也在不断增加。 PIR 历史上，蛋白质数据库的出现先于核酸数据库。在1960年左右，Dayhoff和其同事们搜集了当时所有已知的氨基酸序列，编著了《蛋白质序列与结构图册》。从这本图册中的数据，演化为后来的蛋白质信息资源数据库PIR（Protein Information Resource）。 PIR是由美国生物医学基金会NBRF（National Biomedical Research Foundation）于1984年建立的，其目的是帮助研究者鉴别和解释蛋白质序列信息，研究分子进化、功能基因组，进行生物信息学分析。它是一个全面的、经过注释的、非冗余的蛋白质序列数据库。所有序列数据都经过整理，超过99%的序列已按蛋白质家族分类，一半以上还按蛋白质超家族进行了分类。PIR提供一个蛋白质序列数据库、相关数据库和辅助工具的集成系统，用户可以迅速查找、比较蛋白质序列，得到与蛋白质相关的众多信息。目前，PIR已经成为一个集成的生物信息数据源，支持基因组研究和蛋白质组研究。至2004年，PIR 有近30万个蛋白质的登录数据项，包括来自不同生物体的蛋白质序列。 除了蛋白质序列数据之外，PIR还包含以下信息： （1）蛋白质名称、蛋白质的分类、蛋白质的来源； （2）关于原始数据的参考文献； （3）蛋白质功能和蛋白质的一般特征，包括基因表达、翻译后处理、活化等； （4）序列中相关的位点、功能区域。 对于数据库中的每一个登录项，有与其它数据库的交叉索引，包括到GenBank、EMBL、DDBJ、GDB、MELINE等数据库的索引。PIR中一个具体的登录项如图4.4所示。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量

实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分 子量 实验数据： 标准蛋白质条带第一条第二条第三条第四条第五条 溴酚蓝前沿距离/cm 4.70 距离/cm 0.50 0.95 1.60 2.10 3.95 相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84 分子量Mr 97400 66200 43000 31000 14400 LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16 样品 1 2 3 溴酚蓝前沿/cm 4.90 4.80 4.60 样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70 相对迁移率mr 0.86 0.25 0.37 标准曲线： y=5.05-1.10x

结果： 样品 1 2 3 Mr 12706 59566 43954 mr 4.104 4.775 4.643 一. 实验目的和要求 1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 2 掌握垂直板电泳的操作方法。 3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。 二 .实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个： 1) 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 2) 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10～ 100mmol/L 3) 二硫键是否完全被还原

碱基与蛋白换算

碱基与蛋白换算 创建者: zizip 最后修改: 2010-6-4 23:05:47 状态: 公开 核酸数据 (Nucleic Acid Data) Kd是kilodaltons的缩写，既千道尔顿。是氨基酸的分子量单位。 Kbs是千碱基对的意思，是核酸的单位名称。 1个脱氧核糖核酸碱基的平均分子量为333 Daltons（道尔顿） 1个核糖核酸碱基的平均分子量为340 Daltons（道尔顿） DNA与表达蛋白之间分子量换算： 1 kb DNA = 333 amino acid ≈3.7 × 104 Da（道尔顿） 10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA 30,000 Da Protein≈ 810 bp DNA 50,000 Da Protein ≈1350 bp DNA 100,000 Da Protein ≈ 27 kb DNA 一个DNA碱基对（钠盐）的平均分子量= 650 道尔顿 1.0 A260 unit ds DNA = 50 μg/ml = 0.15 mM (in nucleotides) 1.0 A260 unit ss DNA = 33 μg/ml = 0.10 mM (in nucleotides) 1.0 A260 unit ss RNA = 40 μg/ml = 0.11 mM (in nucleotides) 双链DNA分子的分子量(道尔顿) = 碱基对数目×650 双链DNA分子的末端摩尔数= 2 ×DNA质量（克）/ DNA分子量（道尔顿）限制性内切酶酶切后的DNA末端摩尔数: a) 环状DNA分子: 2 × DNA摩尔数×位点数 b) 线性DNA分子: 2 × DNA摩尔数×位点数+ 2 × DNA摩尔数 1 μg 1000 bp DNA = 1.5 2 pmol = 9.1 × 1011 molecules 1 μg pUC18/19 DNA (2686 bp) = 0.57 pmol = 3.4 × 1011 molecules

蛋白质分子量的测定——凝胶层析法

实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。 二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由 Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi

5 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量

实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量 一、目的 了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。 SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。 三、试剂和器材 （一）试剂 1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶解后， 定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。 2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。 18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重蒸水定容 至100ml，4℃保存。 3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。 6gTris,少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。 4. 10%SDS，室温保存。 5. 两类样品缓冲液： 2倍还原缓冲液（2×reducing buffer） 0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml 甘油 2.0 ml 质量浓度10%SDS 4.0ml 质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml β-巯基乙醇 1.0 ml 总体积10 ml 6. 电极缓冲液，pH8.3。 Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。 7. 低分子量标准蛋白质（上海产）。 开封后溶于200μl重蒸水，加200μl 2倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20小管，-20℃保存。临用前沸水浴3～5min，其相对分子量（Mr）如下： 兔磷酸化酶B 97 400 牛血清白蛋白 66 200 兔肌动蛋白 43 000 牛碳酸酐酶 31 000 胰蛋白酶抑制剂 20 100 鸡蛋清溶菌酶 14 400 8. 质量浓度为10%过硫酸铵：（临用前配制） 9. 染色液： 0.25g考马斯亮蓝R250，加入40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸馏水定容至100ml，过滤。 10. 脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875 ml重蒸水混合。 11. 待测蛋白样品。 12. 1%琼脂糖（最好用电极液配） 13 TEMED

UniProt：蛋白质的全信息数据库

Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, Database issue D115-D119? 2004 Oxford University Press UniProt：蛋白质的全信息数据库 摘要 为了给科学界提供一个专门，集中，权威的蛋白质序列和功能的信息资源，瑞士－Prot，TrEMBL 和PIR蛋白质数据库已经合作组成了蛋白质的全信息数据库 (UniProt)。我们的目的是用广泛的对照和询问接口来提供一个全面的，分类完全的，丰富并且准确的蛋白质序列信息。中心数据库将有两个部分：符合熟悉的瑞士－Prot(完全手工操作入口)和TrEMBL(使用丰富的自动化的分类，注释和广泛的对照)。为方便序列查寻，UniProt也提供几个无冗余的序列数据库。 UniProt NREF(UniRef)数据库为高效率的搜寻提供适当的蛋白质的全信息数据库的代表性的子集。全面的UniProt 档案(UniParc)每天从很多公共来源数据库更新。 数据库那些UniProt接口可在线访问(https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,)或者以几个形式下载(ftp：//https://www.wendangku.net/doc/8a18341816.html,/pub)。我们鼓励科学界人士向UniProt 提供数据。 介绍 近来，瑞士-Prot + TrEMBL和PIR-PSD如同蛋白质数据库不同的序列信息覆盖面和注释优势共存。 2002年，在生物信息科学(SIB)的瑞士研究所和欧洲生物信息科学研究所的瑞士-Prot + TrEMBL 组 (EBI)和蛋白质信息资源(PIR)组织在乔治敦大学医学中心和国家生物医学的研究基金会联合协作。新联合的组织的主要任务是通过建立一个综合，详细分类，丰富并且准确注释蛋白质序列的优质的数据库和广泛序列对比和询问服务的到科学团体免费接口