实验新人必读(六)：外泌体实验研究的正确打开姿势!
实验新人必读（六）：外泌体实验研究的正确打开姿势！
导语最近，外泌体在科研界以迅雷不及掩耳之势火了起来，国自然中标量那是翻着倍的蹭蹭往上涨。然而目前外泌体的研究仍处于初级阶段，首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法，其次对其他囊泡与外泌体的区别仍不能做出清楚的判断。
外泌体的藏身之处正所谓高手在民间，欲一睹高人风采，就必先找到高人隐身之处。通常外泌体藏身于细胞上清、血液、尿液、脑脊液和其他体液。血液血液离心后有两种形式：血清和血浆，但不少小伙伴对它们傻傻分不清楚。前者是不经抗凝处理的血液会自动在一系列凝血因子的作用下
发生凝集，离心后的上层液体；后者是经抗凝剂处理后，离心出去血细胞所得液体。两者虽然一母同胞，但显然血浆比血清更有内涵，其包含一些纤维蛋白原以及大量的外泌体，因而血浆也更受广大研究者的青睐。
Tips:1）血样抗凝剂花样繁多，科研汪们一不小心就会跌的鼻青脸肿。肝素除了会抑制PCR外，还可与外泌体结合阻止细胞摄取外泌体；双嘧达莫（CTAD）则会阻止血小板的激活并抑制其释放外泌体；EDTA可能会干扰PCR反应（尽管其程度小于肝素），但是还是优于其他选择。
2）抽血时动作要轻柔迅速，并记录准确的抽血时间。因为
外泌体在抽血后30分钟内是稳定的，时间过长血小板会因
种种物理因素而被激活并释放外泌体，导致外泌体数量增加。尿液尿液中的外泌体性质稳定且RNA含量高于尿液中的细胞内的RNA。而收集尿液时，应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液，并注意避免细菌污染。受试者的亲属（性别相同、年龄相仿）可作为对照。同时也要注意对饮食的控制。脑脊
液脑脊液中的外泌体含量虽然较其他体液如血液少，但可
作为神经系统疾病的潜在生物标志物。采集脑脊液时避免受到血液污染，一般由于健康对照脑脊液获取困难，往往以其他神经异常的患者为对照。外泌体的通缉之法既然已经找到了外泌体的藏身之处，接下来就是请高手出山了。正常情况下外泌体是有侠义之风的，默默无闻的传递信号分子，以激活下游信号通路，帮助其他细胞各司其职。比如树突状细胞源性的外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。然而一旦细胞变坏了，其分泌的外泌体也就成了恐怖份子，像肿瘤细胞分泌的外泌体小哥就作恶多端，在机体中掀起了一片腥风血雨，引得科研界中的各路人马纷纷亮出自家法宝对其进行缉拿通缉。秘笈一：超速离心法此秘笈普遍被科研
者所接受，通常与蔗糖密度梯度结合，使相对低密度的外泌体漂浮起来。然而，此法比较耗时耗力，一般需要8-30h，一次仅能处理6个样品，且产率较低，不适用于如血浆和血清等粘性生物液体。然而却可以获得高纯度的外泌体，并且
这种方法在过去10年里已经被很多实验室成功应用于外泌体的分离。秘笈二：按照尺寸大小分离外泌体BiooScientific的ExoMir试剂盒通过两步超滤法就成功分离纯化外泌体。第一个微型过滤器基本上能去除所有细胞、血小板和细胞碎片，第二个微型过滤器可用正压力来获取所有直径大于30nm的囊泡。该方法以HPLC（高效液相层析）为基础的方法有可能获得高纯度的外泌体，但是这个过程需要专用设备。秘笈三：外泌体沉淀聚乙二醇（PEGs）通常被用于病毒和其他小颗粒的沉淀。基于此，System Biosciences 提供的ExoQuick试剂在被加入体液中后，离心即可沉淀外泌体。同时，Life Technologies也开发了五种Total Exosome Isolation试剂，能使低溶解度的成分（如外泌体）析出，然后通过低速离心收集外泌体。秘笈四：基于亲和力获得外泌体外泌体相关抗原的抗体（如抗CD63、CD9、Alix、CD81、CD82、annexin、EpCAM和Rab5抗体）可以用作分离外泌体的特异性标记，用包被此类物质的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，可达到外泌体吸附分离的目的。该方法可保证外泌体形态的完整性，且特异性高、操作简单，但非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不利于下一步实验，且不适合大量样本。
秘笈五：qEV法该方法是利用Size Exclusion Chromatography(SEC)的原理对外泌体进行分离纯化的分
离柱，在不损伤外泌体活性的情况下，有效去除样品中杂质蛋白和脂类。如此可获得高纯度的外泌体，且快速简单，成本低廉。适合于细胞上清、血液、尿液等体液的外泌体分离。一般建议与qNano测量法联合使用，qNano可利用“可控电阻脉冲传感技术”对外泌体的浓度和尺寸进行快速准确的测量，因此qEV+qNano被视为快速准确的分离和测定外泌体的最佳解决方案。外泌体的分析研究既然已经捕获了“做坏事”的外泌体，就该拷问它所携带的货物中哪些是与某种疾病息息相关的。一般而言，外泌体里含有蛋白质和非编码RNA。因而，其分析研究可分为以下几类。首先要外泌体进行鉴定，通常研究者可用透射电镜观察外泌体的结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球型），再结合免疫标记就可清楚的分析特定指标在外泌体表达的部位。为了让大家对外泌体有着一个更直观的感受，先奉上一个经典的外泌体电镜图，由图中可看到很多略小于100nm的具有清晰膜的茶托样结构，小图中则显示附在膜结构表面的免疫胶体金。对外泌体验明正身之后，就可以在蛋白水平和核酸水平对其进行深入分析。
1.蛋白水平的分析
（1）SDS-PAGE：通过SDS-PAGE电泳可以分析得到的外泌体中蛋白的含量及种类。
（2）Western-Blot：通过Western-Blot可以检测外泌体中
特定的蛋白表达情况。
（3）2-DE等蛋白组学分析：可以了解外泌体中不同蛋白的表达、数量情况
2.基因水平的分析
（1）Real-Time PCR：通过PCR可以分析需要研究的指标的表达量。
（2）转录组分析：通过测序或者芯片，分析Exosome不同基因的转录水平。
（3）miRNA ：通过测序或者芯片，检测与Exosome相关的miRNA的表达情况，研究特定的miRNA。
（4）lncRNA分析：通过测序或者芯片，检测与Exosome 相关的lncRNA的表达情况，研究特定的lncRNA与Exosome共同调控某种疾病的关系。
Tips:
1）由于外泌体内含有大量小片段RNA，测序时会测到许多非miRNA的小片段RNA，造成有效数据不足。一般建议使用芯片的方法检测外泌体miRNA。
2）lncRNA表达丰度较低，在外泌体中丰度更低，对于低丰度基因，芯片测准确性远远大于测序。所以建议使用基因芯片的方法检测外泌体lncRNA。
3）为了获取漂亮的测序或芯片结果，外泌体的含量是关键。不同样本提取外泌体得率不同，根据经验：3ml以上的血浆
血清可得到约30-50ng的RNA；30ml以上细胞上清可得到约70-100ng以上的RNA；其他类型的体液与其性质有关，建议都以30mL以上。
细胞外泌体提取方法
外泌体提取详细步骤及方法 1、差速离心 差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。该方法包括几个步骤，包括低速离心去除细胞和凋亡碎片；更高速离心以消除更大的囊泡；最后高速离心沉淀外泌体： 300×g离心10分钟，取上清。 2000×g离心10分钟，取上清。 10，000×g离心30分钟，取上清。100，000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100，000×g离心90分钟。 2、密度梯度离心 该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体。但是，合适的离心时间非常重要，否则如果它们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。 3、尺寸排阻色谱 尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量实现分离大分子。该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。此外，可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的结构。目前，SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。不过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。 4、过滤 超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体，也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体：不过，该方法由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。 5、基于聚合物的沉淀技术 基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合，在4℃温育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。用
实验练习八 结构体编程
实验八结构体编程 实验目的 1．掌握结构体类型变量的定义和使用。 2．掌握结构体类型数组的概念和使用。 3．掌握结构体指针及链表的概念，初步学会对链表进行操作，学会在函数之间传送链表的方法。 4．理解共用体的概念与使用。 实验内容 1、结构体类型的变量及数组 （1）利用指向结构体的指针，遍历结构体数组，寻找第一个名字首字母是‘M’的学生，参考代码如下：
2、结构体链表 （1）建立一个创建单链表的函数 （2）在单链表中查找一个会员 定义一个函数find。该函数能在head指向的链表中，查找一个名字和s所指字符串完全一样的会员，并返回其地址。若未找到，则返回NULL。代码如下： struct CStudent * find(struct CStudent *head, char *s){ struct CStudent *p=head; while( p!=NULL && strcmp(p->name, s)!=0 ) p=p->next; return p; } 而在主调函数中可以按如下的方式来调用find函数：
p=find(head, "Sun"); if(p==NULL) printf("没找到\n"); 完整的参考代码如下： （3）设计一个函数，在链表的当前节点之后插入一个节点。 该函数的功能是在链表的当前节点插入一个节点，当前节点还有要插入的数据以函数的形式参数传给函数。 函数原型 data *Insert_link((data *op_list, int value); 其中data数据类型定义如下： //Link list struct typedef struct data{ int value; struct data *next;
外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取 上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。 2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小 时而不进行抗凝。此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3,000×g离心10分钟。将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。 3、 为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。 外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机 50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表 3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1） 注意：所有离心均应在4℃下进行。 1.用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在2,000×g，4℃下离心30分钟。 2.将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案1，步骤3注释）。在12,000×g，4℃下离心45分钟。 3.小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积，可参见表3.22.1中的管）。在110,000×g，4℃下离心2小时。 4.将沉淀重悬于1ml PBS中，并将其在其中一个管中汇集。用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。 5.通过0.22-μm过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。 6.在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。 7.将沉淀重悬于1ml PBS中，然后用PBS填充管。在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。 8.将沉淀重悬于50至200μlPBS中。在-80℃下储存长达1年。
C语言结构体实验报告
《高级语言程序设计》实验报告实验序号：8 实验项目名称：结构体
附源程序清单： 1. #include
for(i=1;i<=5;i++) stu[i].aver_score=((stu[i].score[1]+stu[i].score[2]+stu[i].score[3])/3); printf("平均成绩:"); for(i=1;i<6;i++) printf("第%d个同学的平均成绩%f:\n",i,stu[i].aver_score); printf("\n"); }; void max() { int i,k=0; float temp=stu[1].aver_score; for(i=2;i<=5;i++) if(stu[i].aver_score>temp) {temp=stu[i] .aver_score;k=i;}; printf("成绩最好的同学:\n"); printf("%d %s %s %4.2f %4.2f %4.2f %4.2f\n", stu[k].num,stu[k].name,stu[k].classname,stu[k].score[1],stu[k].score[2],stu[k].score[3],stu[k].aver _score); }; void main() { input(); averagescore(); max(); } 2.#include
exosomes外泌体实验方案
外泌体分离提纯草案 By 朱旭峰 一、以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清） 1.1细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比 1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。（sigma） 1.2快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地 细胞和残渣。超速离心于120,000_g (Sorvall WXULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃.2 小时 1.3用1mL 冷的PBS 重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g (Sorvall WXULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃.2 小时 1.4再用100μL 冷的PBS 重悬后转移到低粘附的管中 1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL 的样品置于卡上，用Direct Detect?(Millipore) 2材料 a)细胞培养液 b)蛋白酶抑制（Sigma） c)过滤筛(Millipore) d)冷的PBS e)低粘附的管 f)Direct Detect?(Millipore) 二、以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆） 1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂 (Sigma) 1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟4℃ 1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g 30分钟于4℃来去 除较大的囊泡、 1.4此阶段的样品可以 1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时4℃ 1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).， 1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬 1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏 2.材料
提取锂的方法总结
提取锂的方法总结 矿石提锂的方法主要有硫酸法、硫酸盐法、石灰烧结法、氯化焙烧法，纯碱压煮法等，现综述如下： （一）、硫酸法 硫酸法从锂辉石中提取碳酸锂是当前比较成熟的矿石提锂工艺，其工艺流程如图1-1所示。此方法先将天然锂辉石在950-1100℃焙烧，使其由单斜晶系的α-锂辉石转变成四方晶系的β-锂辉石，由于晶型转变，矿物的物理化学性质也随着晶体结构的变化而产生明显变化，化学活性增加,能与酸碱发生各种反应。然后将硫酸与β-锂辉石在250-300℃下焙烧，通过硫酸化焙烧发生置换反应，即可生成可溶性硫酸锂和不溶性脉石，反应方程式如下： β-Li2O·Al2O3·4SiO2+H2SO4=Li2SO4+H2O·Al2O3·4SiO2 以上即为硫酸法从锂辉石中提取碳酸锂的工艺原理。 由文献：田千秋，陈白珍，陈亚，马立文，石西昌.锂辉石硫酸焙烧及浸出工艺研究. 稀有金属，2011，35(1)：118-123.得到具体操作步骤如下： ①焙烧，称取一定质量的锂辉石放于回转窑中1000-1100℃焙烧30min； ②冷却磨细，将其磨细到200目以下； ③酸化焙烧，硫酸（93%-98%）用量为理论用量的140%，焙烧温度250℃，焙烧时间为30min； ④水浸，将酸化熟料用去离子水进行搅拌浸出，浸出最佳条件为：常
温反应15min，液固比为； ⑤分离，浸出结束后加入C aCO3迅速中和至pH 左右，使部分铁铝进入渣中，过滤得到浸出液；浸出液通过净化后即可用于碳酸锂的提取。 图1-1 （二）硫酸盐法 硫酸盐法是用硫酸钾与天然锂辉石烧结，使矿石中的锂转变为硫
酸锂，通过熟料溶出即可使锂从矿石中进入溶液。在处理锂辉石时，烧结过程中不仅伴随着α-锂辉石的晶型转变，同时也存在着离子交换反应。实际上，该反应是α-锂辉石先转换成结构较疏松且易于反应的β-锂辉石,然后发生离子交换反应的。在加热烧结过程中，总的化学反应是： α-Li2O·Al2O3·4SiO2+K2SO4=Li2SO4+K2O·Al2O3·4SiO2 该反应是可逆的，为了使反应更加充分地向右进行，在工艺上需加入过量的K2SO4，然而由于K2SO4价格贵，故常常采用以Na2SO4部分替代K2SO4。但如果全部用Na2SO4代替K2SO4，可能生成“锂辉石玻璃”严重影响后续浸出工序，所以只能以Na2SO4部分替代K2SO4。硫酸盐法不仅可以处理硅酸盐矿，而且也可以处理憐酸盐矿。 此方法的优点是它具有通用性，几乎能分解所有的含锂矿石。缺点是若不用Na2SO4替代部分K2SO4，即消耗大量的钾盐，最终导致生产成本较高、产品也常被钾污染。 由文献：张婉思，王远明，李擎.硫酸盐法从锂云母中制取碳酸锂的工艺路线研究. 化学世界，2010，34-36.得到具体操作步骤如下：①焙烧，焙烧阶段的优化条件为：温度940℃，时间120 min，配比 锂云母：K2SO4：Na2SO4：CaO=20：：:； ②浸出，第一步：水浸。将焙烧产物按液固比3：1溶于水中，搅拌 半小时，然后静置抽滤。对滤渣进行三级浸取，将滤液合并； 第二步：酸浸。由于水浸使得80%的Li、80%的Na、30%的钾进入溶液中，需要进一步酸浸，以提高Li的浸出率，浸出操作同上，
实验5结构体与文件处理
实验5结构体与文件处理（上机调试运行） 1．已知学生的记录由学号和学习成绩构成，N名学生的数据已存入结构体数组a中，请编写函数fun,函数的功能是：找出成绩最高的学生记录，通过形参指针传回主函数（只有一个最高分）。 2．学生的记录由学号和成绩组成，N名学生的数据已在主函数中放入结构体数组s中，请编写函数fun,功能是：按照分数的高低排列学生的记录，高分在前。并将数据存入文件中。 3．给定程序的功能：从键盘输入若干行文本（每行不超过80个字符），写的文件myfile4.txt中，用-1作为字符串输入结束的标志，然后将文件的内容读出显示在屏幕上。文件的读写分别由自定义函数ReadText和WriteText 实现。 二．实验目的 1.掌握结构体的概念及其数据结构 2.有效应用结构体进行二维表格编程 3.掌握C语言中文件的概念及其数据结构 4.熟悉文件的读写操作 实验4 运用指针类型及函数编程练习 一．实验要求 本实验包含三个程序 1．fun函数的功能是：统计一个无符号整数中各位数字值为0的个数，通过形参传回主函数。并把该整数中各位上最大的数字值作为函数值返回。例如，若输入30800，则零的个数为3，各位上数字值最大的是8。 2．fun函数的功能：用指针的形式比较两个字符串的的长度，将长的那个字符串的首地址作为函数值返回。 3．给定函数fun的功能是：为一个偶数寻找两个素数，这两个素数之和等于该偶数，并将这两个素数通过形参指针传回主函数。偶数在主函数中定义。 二．实验目的 1.掌握指针的概念及其运算 2.掌握以指针作为形参的函数调用及用函数返回一个指针 3.掌握指针与字符串之间的运算关系
外泌体捕获分离
外泌体，带来革命变革的小不点（三）——外泌体捕获分离 外泌体天然存在于体液中，在包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中广泛分布，而且，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体；但是，想要研究这个分布广泛的小不点可不是一件容易的事情，其中，最为困难的就是从体液或者细胞培养基中分离出高纯度的外泌体。今天，小优专题给您带来的就是外泌体研究的最关键步骤——外泌体捕获与分离这一部分的技术讲解与解决方案。 外泌体分离的传统方法为差速超速离心法和密度梯度超速离心法等，差速超速离心法是目前外泌体提取最常用的方法。简单来说是将细胞培养液或体液等样本依次在300 g、2 000 g、10 000 g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100 000 g离心得到外泌体。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，质量不好，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。另一种常用的外泌体分离方法为密度梯度离心法，将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法。用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无毒，在高浓度时粘度不高且易将pH调至中性。实验中常用蔗糖密度梯度离心法，在离心法的基础上，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5 M 和0.25 M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100 000 g离心16 h，外泌体会沉降到等密度区(1.10~1.18 g/ml)。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，产量少。而且，这两种传统方法都需要用到超速离心机，设备昂贵，耗时长，一次最多只能做6个样品，效率低，并且需要大量的样品才能得到足够多的外泌体。 接下来小优就为您带来优宁维为您提供的高效外泌体捕获与分离技术，帮您远离枯燥乏味的超速离心，快速高效制备高质量的外泌体。话不多说，亮技术，上产品：首先闪亮登场的是简单的一步法分离外泌体，实验原理如下图： 一步法分离外泌体原理示意图 该技术的优势有节省时间，小体积样本适用（可从100 μl血浆中分离出足量外泌体），无需超速离心和其他预富集方式，试剂方便储存于运输（4℃保存）等。 除了一步法分离外泌体的技术外，小优还为您提供免疫捕获法，包括免疫微球产品与免疫预制板产品。首先我们来看免疫微球捕获分离外泌体的技术原理：
实验九结构体
实验九结构体、共用体与枚举类型 实验时间：年月日 【实验目的】 1、掌握结构体类型、共用体类型和结构体类型变量的定义方法； 2、掌握结构体类型变量成员赋值和引用方法； 3、学会使用结构体数组； 4、掌握共用体和枚举类型数据的使用。 【实验内容】 1、结构体类型的定义； 2、结构体变量的定义、赋值与使用； 3、结构体数组与结构体指针的定义与使用； 4、共用体类型的定义，共用体变量的定义与使用； 5、枚举类型的定义与使用； 6、链表与动态内存分配； 7、自定义类型的使用。 【实验步骤】 一、在E或F盘上建立以自己的学号命名的文件夹。 二、上机验证与分析题 1、写出程序ex9_1.c运行的结果。 /*文件名ex9_1.c*/ #include
/*文件名ex9_2.c*/ #include "stdio.h" void main() { int z; union data { int x; int y; }a; a.x=3; a.y=6; z=a.x+a.y; printf("z=%d\n",z); } 3、阅读程序ex9_3.c，预测结果并上机验证。 /*文件名ex9_3.c*/ #include
C语言实验八结构体上机报告
《标准C语言程序设计》上机报告实验八结构体程序设计 专业：电子信息工程 班级：电信1301 学号：U201313480 姓名：秦行 完成日期：2014/6/9
一、实验目的： 1、掌握结构体类型的说明和结构体变量的定义； 2、掌握结构体变量成员的引用和对结构体变量的初始化； 3、掌握结构体数组及结构体指针变量的定义及使用。 4、理解并掌握结构体在函数间的传递； 5、进一步掌握复杂程序编译、连接和调试的技巧。 二、实验内容及要求（鼓励一题多解） ——以下均要求不得使用全局变量： 1 （1）、正确定义该表格内容要求的数据类型； （2）、分别输入各成员项数据，并打印输出（为简便起见，假设只有3名考生）。#include
{ struct student tester[N]; int i; for(i=0;i
细胞培养基的Exosome提取方案
细胞培养基上清提取外泌体 外泌体产生细胞（Exosome源细胞）的选取： 293T细胞：常用于基因改造外泌体； Mouse immature dendritic cells（imDCs）：小鼠未成熟的树突细胞，常用于小鼠in vivo 体内反应使用，产生的外泌体引起的免疫反应极小； Mouse lymphoma cell line（EL-4）：小鼠淋巴细胞； 各类癌细胞系：常用于研究各个癌产生的外泌体本身特性研究: …… 不同实验的需求不同， Exosome源细胞的细胞选择不同，例如：需要基因改造就选择较容易感染的293T，体内实验就要避免机体的免疫反应，要充分了解实验要求和各个细胞系背景。 Exosome源细胞用量： 以293T为例，2个15cm盘=4.5个10cm 盘=4*107 cells，最终的Exosome 20ul/20ul 可用于体内原位癌3*104/1ul注射给药，15ul/50ul 可用于105 受体细胞培养加药。 P S: 王红阳方法1ug Exosome=5*106 cells，原位癌注射用量5ug，105细胞培养用量1ug。我约莫算了一下，差不多。楼上的方法不要定量，更简单方便，以楼上为主。 以293T细胞为例制备Exosome： 1.2盘10cm 盘在60-70%进行病毒感染，1盘感染GFP（control病毒），1盘感染plv-cs 2.0-myc-PD1，病毒感染后16-18h后换液； 2.36-48h后进行传代：准备10盘10cm盘，每盘加入15ml Exosome-free的10%血清的DMEM，放入37°C培养箱备用。取出2感染好的2盘细胞，迅速用5ml PBS/遍洗涤3遍，加入1ml胰酶，摇匀使每个细胞都孵育胰酶，37°C静置消化1min，加入4ml Exosome-free 的10%血清的DMEM静置，获得5ml细胞悬液，加入到准备好的10盘10cm盘中，获得5盘GFP、5盘plv-cs2.0-myc-PD1稳转293T 细胞系，37°C培养48h； 3.取4根灭菌处理过的50ml管，收集细胞培养基，分装成37.5ml GFP、plv-cs2.0-myc-PD1各两管，进行三步法离心： ?4°C离心200-300g，5min去细胞，分别小心吸取上清34ml入新的灭菌50ml 管； ?4°C离心12,000-16,000g，45min去碎片，分别吸取31ml上清入新的灭菌50ml 管，0.22um滤膜（Millipore）过滤，最后62ml左右汇入一管Beckman快速密 封管Beckman Quick seal tubes； ?Beckman 70Ti 转子4°C超离100,000-110,000g，90-120min，弃上清，用50ul PBS重悬exoxome。 3’.收取上清，进行三步法离心：200-300g 5min去细胞；12,000-16,000g 45min去碎片，0.22um滤膜过滤，用100kDa的超滤管（Millipore）将上清浓缩至200ul，加入15ml PBS 浓缩至50ul。 4.取 1、3、5、15ul/50ul 的Exosome 加入105受体细胞中，培养48h，观察或检测目的基因、药物的摄入情况。（GFP观察荧光，RNA用RT-PCR，蛋白用WB）。
如何分离纯化、鉴定外泌体(借鉴材料)
如何分离纯化、鉴定外泌体 外泌体相关研究逐渐从小众走向大众，受到越来越多的关注，涌现了一大批的外泌体课题。但大家还是感觉外泌体研究好难啊！为什么呢？首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法。今天就来给大家聊一聊如何搞定外泌体研究中的第一步。 一、分离 超速离心法: 超速离心法是外泌体分离最常见的技术之一。据不完全统计，约有1/2的研究者会选择该种方式分离外泌体。该方法由几个离心步骤组成，可分步去除细胞、细胞碎片和大囊泡，沉淀外泌体（如图所示）。但该种方法用于血浆和血清等粘性生物液体时效率较低，且重复离心操作有可能对外泌体造成损害，从而降低其质量。 如将超速离心配合蔗糖溶液进行梯度密度离心可得到纯度更高的外泌体，是公认可以得到最高纯度的分离方法。但此法对离心时间非常敏感，一般需要8-30h，产率较低，同样不适用于血浆和血清等粘性生物液体中外泌体的分离，因此难以广泛普及。 聚合物沉淀法: 第二大主流的外泌体分离技术就是基于聚合物的沉淀法了，最常见的聚合物是聚乙二醇（PEG）。通常将含有聚合物的沉淀溶液与生物体液混合，4℃温育，低速离心，沉淀外泌体（如图所示）。目前已有成熟的PEG-base商业试剂盒，比如图中的ExoQuick?（System Biosciences）。这类试剂盒使用容易和快速，不需要额外的设备，且随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。沉淀法的主要缺点是分离物中会有少量的聚合物存在。不过大家不用担心，一般来说这些物质不会干扰下游分析，使用商业试剂盒提取外泌体也受到越来越多杂志的认可。
二、鉴定 外泌体的鉴定是继分离后又一个困扰研究者的问题。如果大家看过外泌体研究相关的文献，就肯定对一张图印象深刻。 不错，想发外泌体文章，光找到高效率的分离方法还不够，要过的第二关就是证明你分离得到的就是外泌体。鉴定方式不外乎就是下面这三种：1. 形态学（电镜）；2. 粒子大小（径粒分析）；以及3. 标志蛋白（WB）。综合来说，透射电镜可以清楚的看到外泌体的大小、形态等，属于鉴定方法中的金标准，其他两种方式则常常作为辅助使用。
C语言实验八
实验8 结构体、共用体与枚举类型 一、实验目的和要求 1．掌握枚举类型的基本使用方法。 2．掌握共用体的概念和应用。 3．掌握结构体变量及结构体数组的定义和使用。 4．掌握简单链表的基本使用方法。 二、实验内容和步骤 1．有5个学生，每个学生的数据包括学号、姓名、性别、4门课的成绩，从键盘输入5个学生的数据，要求输出4门课的平均成绩，以及平均成绩最高的学生信息（包括学号、姓名、性别、4门课的成绩、平均分数）。 同时要求用in函数输入5个学生数据；用aver函数求平均分；用max函数找出平均成绩最高的学生数据；学生的数据在out函数中输出。 2．输入和运行以下程序。 #include
外泌体提取试剂盒解决方案
外泌体是大多数细胞分泌的40 - 150nm的膜泡，存在于细胞培养基、血浆、血清、唾液、尿液、羊水和恶性腹水等生物液体中。越来越多的证据表明，这些囊泡充当细胞信使，将信息 传递给身体内的细胞和组织。外泌体包含细胞特异性蛋白、脂质和RNA，它们被运输到其他细胞，并改变其他细胞的功能或生理作用。这些外泌体可能在介导对感染性病原体和肿瘤的 适应性免疫反应、组织修复、神经通讯和病原蛋白转移方面发挥作用。 如何提取各种样本类型中的外泌体呢？艾美捷科技作为专业的生命科学领域解决方案供应商，为您推荐Norgen Biotek品牌的外泌体提取试剂盒： 1.血浆/血清外泌体提取试剂盒：（Plasma/Serum Exosome Purification Midi Kit；57500）。 使用血浆/血清外泌体提取试剂盒从1 mL和10 mL血浆中纯化的完整外泌体，使用NanoSight?LM10仪器观察如下图：
【血浆/血清外泌体提取试剂盒-各品牌横向对比】
Norgen的试剂盒分离出55 nm外泌体，回收率为每毫升血浆9.64 x 1013颗粒。另外与其他两种竞争对手相比，从1mL血浆中纯化的外泌体覆盖50nm-150nm的更宽尺寸范围，血浆浓度更高。 2.尿液外泌体提取试剂盒（Urine Exosome Purification Midi Kit；57800）： 图4使用尿液外泌体提取试剂盒从10 mL尿液中纯化的完整外泌体与使用超速离心发相比，使用NanoSight?LM10仪器观察如下图：
经过Norgen的试剂盒纯化的外泌体大小从65nm到195nm，总回收率为7.63×108个颗粒/ mL。【尿液外泌体提取试剂盒-各品牌横向对比】
大鼠血清外泌体不同提取方法的比较
广东化工 https://www.wendangku.net/doc/8a7871218.html, 2019年第2期第46卷总第388期 -23 - 大鼠血清外泌体不同提取方法的比较 罗哲斯，钟成勇，秦转，李艳文，毛建文* *［收稿日期］2018-11-28 ［基金项目］广东省高等学校“千百十工程”人才培养项目(2015cxqx214) ［作者简介］罗哲斯(1992-),女，广东清远人，硕士研究生，主要研究方向为分子药理学。 *为通讯作者：毛建文，男，湖南人，博士，教授，主要从事离子通道蛋白与疾病及外泌体功能的研究。 (广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州510006) ［摘 要］目的：比较大鼠血清外泌体的不同提取方法，优化PEG 聚沉法。方法：分别采用差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法及优化 后的PEG 聚沉法提取分离血清外泌体。通过Western Blotting 检测外泌体标记蛋白：透射电镜观察形态。结果：Western Blotting 检测出外泌体 的标记蛋白：电镜下观察到差速超速离心法和优化后的PEG 聚沉法提取的外泌体粒径在100 nm 左右，呈双层膜结构，试剂盒法和PEG 聚沉法 提取的外泌体形态大小不一，杂质偏多。结论：优化后的PEG 聚沉法能成功提取血清外泌体，此方法操作简便、耗时短、成本低，是可靠且有 效的外泌体提取方法。 ［关键词］血清；外泌体；PEG ；差速超速离心；试剂盒［中图分类号］TQ ［文献标识码］A ［文章编号］1007-1865(2019)02-0023-02 Comparison and Optimization of Different Methods for the Extraction of Rat Serum-derived Exosomes Luo Zhesi, Zhong Chengyong, Qin Zhuan, Li Yanwen, Mao Jianwen * (School of Life Sciences and Biopharmaceuticals, GuangdongPharmaceuticalUniversity, Guangzhou 510006, China) Abstract: Objective: To compare different extraction methods of rat serum-derived exosomes and optimize PEG coagulation to obtain more efficient and practical extraction techniques. Methods: Serum exosomes were extracted and separated by differential ultracentrifugation method, kit method, PEG coagulation method and optimized PEG coagulation method. The exosomal marker proteins were detected by Western blotting; the morphology was observed by transmission electron microscope.Results: The expression of exosome labeled protein HSP70, CD63 and TSG101 in exosomes protein obtained by all four extraction methods could detected by Western blotting. The exosomes extracted by differential ultracentrifugation method and optimized PEG coagulation method show a particle size of about 100 nm and a double-layer membrane structure under transmission electron microscope. The exosomes extracted by the kit method and PEG coagulation method were impurities and not uniform in size. Conclusion: The optimized PEG coagulation method was successfully used to extract and separate rat serum-derived exosomes. Compared with the existing methods, this method has the advantages of easy operation, short time-consuming, low-cost and effective. Keywords: Serum ； exosomes ； PEG ； differential ultracentrifugation ； Exo Quick 1前言 外泌体是指包含了多种mRNA 、miRNA 和蛋白质的微小囊 泡，直径在30?150nm 之间，呈茶托形或一侧凹陷的半球形结构。 1987年，Johnstone 将其命名为"exosome"⑴。其主要来源于细 胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜 融合后释放到胞外基质中［2】。Tucci M 等人研究发现，转移性黑素 瘤患者的血清中能提取到黑色素瘤细胞分泌的外泌体，并检测岀 所患转移性黑色素瘤是否对化疗药物敏感⑶。与此类似,Repiska G 等人发现，从孕妇血清中提取的外泌体能检测到胎儿的DNA 【4】。 由此可见，血清外泌体能够参与到病理生理过程中。 目前我们对血清外泌体的研究尚处于初级阶段，要想实现最 终的临床上的指导应用，还有许多亟待解决的难题。其中，从成 分复杂的血清中获得结构完整，形态大小均一，并保留其生物学 特性的外泌体，是目前的一个重难点⑸。现阶段外泌体的提取方 法主要有：超速离心法、密度梯度离心法、色谱法、过滤离心和 试剂盒提取法等。本文就将差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚 沉法和优化后的PEG 聚沉法用于血清外泌体的提取并进行比较， 期望获得简便快捷和性价比高的提取方式。 2实验材料与方法 2.1试剂及仪器 PEG 6000(E125BA0029)购自生工生物工程股份有限公司； Total Exosome Isolation (00520032)购自 Invitrogen 公司；CD63 抗 体(BA1584)和TSG101抗体(PB0550)购自武汉博士德生物工程有 限公司，HSP70抗体(AH728)购自上海碧云天生物技术有限公司； L-100XP 低温超速离心机购自美国Beckman 公司；透射电镜 (H7650)购自日本Hitachi 公司。2.2实验方法 2.2.1差速超速离心法提取外泌体 取1 mL 大鼠血清，加入19 mL PBS, 300 g, 4 °C 离心10 min 。 取上清转移到新的离心管中，2000 g, 4 °C 离心10 mine 取上清 转移至新的离心管，10000 g, 4 °C 离心30 min ；取上清置于超离 管中，100000 g, 4 °C 离心70 min,去上清，加入20 mL PBS 重 悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。2.2.2试剂盒法提取外泌体 按照Total Exosome Isolation (00520032)试剂盒说明书进行提 取。 2.2.3 PEG 聚沉法提取外泌体 16 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 超纯水配制成 8%PEG 6000(2X)溶液；10 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 痼纯水配制 成 5%PEG6000(2X)溶液。 取ImL 大鼠血清,2000g,4 °C 离心30 min 。取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。去除上清，用PBS 重悬后加入5%PEG6000(2X), 4匸静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h,底部沉淀即外泌体。 2.2.4 PEG 聚沉法经超速离心法优化提取外泌体 取1 mL 大鼠血清，2000 g,4 °C 离心30 min 。取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。去除上清，用20 mL PBS 重悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。 2.2.5提取外泌体总蛋白及免疫印迹 裂解上述外泌体并提取其总蛋白，以等样蛋白浓度跑10%丙 烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭 2 h, 4 °C 孵育HSP70、CD63和TSG101 —抗过夜，加入相应二 抗室温孵育lh 后，于蛋白成像系统中进行曝光成像，拍摄图片。 2.2.6形态学分析 取上述外泌体于铜网上，负染后在透射电镜下观察其形态。 3结果 3.1外泌体标记蛋白HSP70、CD63、TSG101表达的检测 差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法、经超速离心法优 化的PEG 聚沉法所提的外泌体中均检测到外泌体标记蛋白 HSP70、CD63和TSG101的表达，四种方法没有明显差别，见图 lo