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水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究
水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

原核&真核表达载体构建

原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别:主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子,终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体,能在真核生物内表达; 带有原核表达元件的是原核载体,能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指:能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区。来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3~9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列,简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一,某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合,从而影响蛋白质的翻译。另外,真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后,才能产生一个完整的蛋白质。 3.终止子 在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列,且具有终止转录功能,这一序列称之为转录终止子,简称终止子(terminator)。转录终止过程包括:RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进,RNA的延伸也停止在终止信号上,完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具,其结构如下图。重组蛋白表达,我们首先要将基因插入到表达载体上,插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件,这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测,但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果,这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。 蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签,使用不同的宿主表达菌,测试不同的表达条件,筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等,这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1)促表达/促溶标签 2)信标标签

3)纯化标签 我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功,更要考虑蛋白怎么纯化出来,纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择,下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 4)酶切位点 以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍,各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释,科研工作者可根据具体实验设计方案,组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是,选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点,同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体,在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。 标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。 在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则,也就是所谓宿主细胞的N-端规则(N-end rule),这个要避免;同时,还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前,载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素: (1)复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 (2)抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+ (3)多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 (4)P/E 启动子/增强子 (5)Terms 终止信号 (6)加poly(A)信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点: 【1】构建DNA 重组体的目的,克隆扩增/基因表达,选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型:

(1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb 选质粒。 (2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。 (3)对原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。 综上所述,选用质粒(最常用)做载体的5点要求: (1)选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载 体); (2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个。 (3)必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地; (4)必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。 (5)满足自己的实验需求,是否需要包装病毒,是否需要加入荧光标记,是否需要加入标签蛋白,是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。 无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割,获得线性载体分子,以便于与

原核表达载体的重要调控元件

原核表达载体的重要调控元件 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区。来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s 亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 (1)Lac启动子:它来自大肠杆菌的乳糖操纵子,是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列,由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP 来激活启动子,促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白,该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物,使其构型改变,不能与O基因结合,从而解除这种阻遏,诱导转录发生。 (2)trp启动子:它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子,其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时,该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时,则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合,解除阻遏蛋白的活性,促使trp启动子转录。 (3)Tac启动子:Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子,受Lac阻遏蛋白的负调节,它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的-35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成,Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区,加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。

原核表达步骤

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件: (1)选择标志的编码序列; (2)可控转录的启动子; (3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点); (4)一个多限制酶切位点接头; (5)宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测,其中包括: 一、试剂准备 (1)LB培养基。 (2)1M IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的,用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 (一)获得目的基因 1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA 为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 (二)构建重组表达载体 1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 (三)获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

想和大家讨论讨论原核表达载体

【建议】想和大家讨论讨论原核表达载体 原核表达载体,如pet系列,型号从小到大,那么多,往往让新手选择起来不知所措。所以希望和大家讨论讨论到底他们是怎么演变的,每个的优缺点,是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。 希望下面的讨论分系列进行,如pet系列、pgex系列等 这篇文章是我从网上找的关于pet载体的介绍,只要你耐心的看完,相信能有个基本的了解关于pet载体及应用。更详细的内容请高手进行补充 pET,原核表达金标准(转) pET 载体中,目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下,并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大,提供了用于表达的新技术和选择,目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中,基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供,用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供,可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统,Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合,能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白,所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后,通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌(λ DE3 溶原菌)中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中,T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录,因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶,

原核表达步骤

1.将已经成功转有重组表达载体pET-28a-CYP83A1的表达菌 E. coli.BL21(DE3)在LB固体培养基(50μg/mL Kan)上划线接种培 2.挑取单菌落,接种于5mL的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中,37℃,180r/min振荡培养过夜。 3.取500μL过夜培养的菌液转接入100mL新的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中,37℃,190r/min振荡培养到菌液OD600 =0.6~0.8。 4.分组培养:实验组加入终浓度为1mmol/L的IPTG,对照组不加IPTG,37℃,190r/min诱导培养6h。 5.8000r/min离心2min,收集细菌,用1×PBS(0.01mol/L)缓冲液悬浮。 6.冰上超声波破碎,功率30w,工作5s,间歇5s,总时间2min。 7.4℃、12000r/min离心10min,分离上清与沉淀,取100μL上清与等体积的2×上样缓冲液混合;用200μL1×上样缓冲液悬浮沉淀,沸水浴5min后,对上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。

重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE分析 挑测序正确的单克隆接种到3mLLB(50μg·mL-1Kan)培养基中,振荡培养12h后,将菌液按1﹕100的比例加入到300mL LB(50μg·mL-1Kan)培养基中200r/min37℃振荡培养至OD600为0.5—0.6时,加入IPTG(使终浓度为1mmol·L-1)进行诱导表达,分别在37℃诱导4h,4℃保存备用。未加IPTG诱导的pET-28a-CsFOMT收集作为阴性对照。诱导全部完成后,各取50mL 菌液离心收集细菌,加入SDS上样缓冲液,悬浮混匀,100℃3min,12000r/min离心1min,取上清4℃保存备用。另取50mL菌液离心收集菌体后用1×PBS(PH7.4)将沉菌悬起,经过超声波细胞破碎(20mm的变幅杆,400W,超声2s,间隔5s,重复60次),10000r/min离心10min分离上清和沉淀,上清和沉淀样品中分别加入SDS上样缓冲液,混匀,沸水浴,取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE(5%浓缩胶,12%分离胶),然后分析蛋白表达结果

基因表达载体和重组质粒的区别

载体,质粒,基因表达载体3者有何不同? 载体是一种运输工具,细胞膜上的蛋白质也是一种载体,其识别很单一,也因此有了选择透过性。 质粒是一种小型环状DNA,广泛存在于微生物中,一般的基因工程中,质粒被用来当做目的基因的运载体,也是一种运输工具。 基因表达载体是目的基因和运载体连接后的产物。 基因表达载体和重组质粒的区别 基因表达载体的构建(即目的基因与运载体结合)是实施基因工程的第二步,也是基因工程的核心。 将目的基因与运载体结合的过程,实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体, 首先要用一定的限制酶切割质粒,使质粒出现一个缺口,露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同的黏性末端(部分限制性内切酶可切割出平末端,拥有相同效果)。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处,首先碱基互补配对结合,两个黏性末端吻合在一起,碱基之间形成氢键,再加入适量DNA连接酶,催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键,从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来,形成一个重组DNA分子。这个重组的DNA分子也叫重组质粒。 就是这样。简单的说,重组质粒是基因表达载体的一种。 生物学上marker是什么意思 从文字上说,标记(Marker),染色体上一个可以被识别的区域(比如限制性内切酶的酶切点,基因的位置等)。标记的遗传能够被检测出来。标记可以是染色体上有表达功能的部分(比如基因),也可以是没有编码蛋白质功能但遗传特性能够被检测出来的部分 从实验上说,marker有两种,一种是基因marker,一种是蛋白质marker。两种marker分别是进行琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE(蛋白质电泳)所用的标准参照物,用以指示目的基因或者蛋白的大小。 一般常称呼的marker都是指基因marker,即DNA marker DNA Marker 作为一种分子标记(Marker),构建分子图谱。分子标记克隆在质粒上,可以繁殖及保存。 DNA Marker 是分子量不同的DNA片段,主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时,加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。 现在常用的DNA MARKER有两种,一种是病毒等DNA经过酶切获得的,分子量大小有零有整,另外一种是固定数值的,比如100BP,200BP等。 两种MARKER都不难制作,对于第一种,稍微难一些,主要是要获得病毒等大的基因组片段,然后用适当的酶切,切割完全以后,就能得到相应的图谱。第二中实际上很简单,如果你手头有任何一个载体,而且它的序列完全清楚,那么可以采用PCR的方法获得一系列大小不同的片段,比如上游引物可以使用一个,然后用数数的方法确定下游100BP处的下游引物,扩增出的就是100BP的片段,200BP处的引物就是200BP的片段,依此类推,可以获得一系列不同大小的片段,扩增后,把它们放到一起,就获得了自制的MARKER了

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件: (1)选择标志的编码序列; (2)可控转录的启动子; (3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点); (4)一个多限制酶切位点接头; (5)宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测,其中包括: 一、试剂准备 (1)LB培养基。 (2)1M IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的,用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 (一)获得目的基因 1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA 为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 (二)构建重组表达载体 1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 (三)获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前,载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素: (1)复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 (2)抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+ (3)多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 (4)P/E 启动子/增强子 (5)Terms 终止信号 (6)加poly(A)信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点: 【1】构建DNA 重组体的目的,克隆扩增/基因表达,选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型: (1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb 选质粒。(2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。

(3)对原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。 综上所述,选用质粒(最常用)做载体的5点要求: (1)选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载 体); (2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个。 (3)必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地; (4)必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。(5)满足自己的实验需求,是否需要包装病毒,是否需要加入荧光标记,是否需要加入标签蛋白,是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。 无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割,获得线性载体分子,以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步:首先看Ori 的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) 第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。 (1)Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。 (2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。 (3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。 (4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活

原核表达操作步骤及注意事项

原核表达操作步骤及注意事项 时间:2010-03-03 14:05:01 来源:作者:点击:1046次 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点: 易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件: (1)选择标志的编码序列; (2)可控转录的启动子; (3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点); (4)一个多限制酶切位点接头; (5)宿主体自主复制的序列。 原核表达一般程序如下: 获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测 一、试剂准备 1、LB培养基。 2、100mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。 二、操作步骤 (一)获得目的基因 1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA 第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 (二)构建重组表达载体 1、载体酶切:将表达质粒用限制性切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

原核表达步骤总结

原核表达步骤 原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上,然后通过转化到 JM109或BL21等菌株中,诱导表达蛋白,然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是,目的基因已克隆到载体,并已转进入JM109菌株中。 1.鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达 (1)制样 1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基,加入0.7ul Amp(100mg/mL),37o C200r/min摇床培养,过夜活化。 2. 以1:50比例(200ul),将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中,加入10uLAmp(100mg/ml),37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h,期间取样监控菌液的OD值,控制菌液OD600在0.6-1.0之间,以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时,菌液浓度及达到标准,但是不同的基因对菌的影响不同,所以第一次实验时需要确定这个最佳时间) 3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照(CK),其余7ml菌液加入7ul IPTG(储存浓度为0.5mol/l),使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速,37o C摇床培养3h。 4. 以5000r/min离心2min收集菌体,倾倒上清,每个离心管收集3ml培养物。 5. 加入1ml dH2O,将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤,8000r/min 离心2min,倾倒上清。 6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。 (二)菌落SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量,一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡,确保将管底沉淀震散。 2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min(Marker也要加热)。样品凉后,12000r/min离心3min,取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul,marker 20ul。 (3)SDS-PAGE分析 1. 根据目的片段的大小,制作不同浓度的分离胶 蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%) 4-4020

原核表达步骤

实验方法与步骤 1 表达质粒的构建及测序分析 1.1 cofilin-1的片段的准备 1.1.1 引物设计 根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列,用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计,并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。引物如下: 引物名称序列 F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′ R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L,分装于Eppendorf管中,-20℃冰箱中保存备用。 1.1.2 cofilin-1片段PCR 1 反应体系: 2.5μl KOD polymerase(3’-5’核酸外 切酶活性) KOD polymerase buffer 5μl MgSO4 2.5μl DMSO(“万能溶剂”) 2.5μl dNTPMixture 5μl PrimerF(底物) 1.5μl PrimerR 1.5μl Template(模板)5μl ddH2O 25μl Total 50μl 2PCR反应条件:

①94℃预变性3min ②94℃退火30s ③65℃延伸40s ④68℃40s ⑤go to②30个循环 ⑥68℃5min ⑦4℃forever 3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测 (1)配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g,加入30ml 1×TAE电泳缓冲液(Tris-乙酸电泳缓冲液)中,用微波炉加热2min,待凝胶稍冷却,加入2μl EB(溴化乙锭,荧光染色剂)混匀后倾入凝胶铸槽中,插入梳子,并用玻璃棒驱除气泡,待凝胶完全凝结后拔除梳子。 (2)把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中,加样孔置于负极一侧,然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品+10μl loading buffer(上样缓冲液,可以显示两条带,前面的蓝色的条带是溴酚蓝,代表的片段大小是300bp,后面的有点绿色的条带是二甲苯青,代表的片段大小在4000bp左右),盖上电泳盖,以100V电压进行电泳。 (3)当Marker条带充分分开后即可停止电泳,将凝胶移至保鲜膜上,置于凝胶自动成像仪中分析。 4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物,用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收: (1)将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶,放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。 (2)称量凝胶块重量,以1g=1ml进行计算,加入适量体积的binding buffer,55-65℃加热至凝胶完全融化(约7~10min),每隔2~3min震荡一次。 (3)将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤(2)的溶液转移至Hibind DNA柱子中,10000×g离心1min,弃滤液。 (4)将柱子装回收集管中,加入300μl binding buffer,10000×g离心1min,

DREB基因的原核表达载体的构建及检测

DREB基因原核表达载体的构建及检测 李典鹏1霍凯丽1李政1陈丽萍1刘超2* (1.新疆农业大学草业与环境科学学院,新疆乌鲁木齐 830052; 2.新疆农业大学农学院,新疆乌鲁木齐 830052) 摘要:以从苜蓿基因组获取的DREB基因为目的基因,经过大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基的制备、大肠杆菌工程菌平板培养、PCR扩增目的基因片段、PCR产物回收与纯化、回收产物与PSURE-T载体连接、大肠杆菌液体培养、大肠杆菌感受态细胞制备及转化、筛选重组转化菌落以及通过TPTG的诱导等一系列实验,使DREB基因在原核生物体内表达,最后通过酶切及电泳检测分析,确定了由DREB基因编码翻译蛋白的正常表达,达到了DREB基因在原核体内表达的目的。 关键词:DREB;原核表达;大肠杆菌;PCR 0 引言 高等植物中脱水应答元件结合蛋白(Dehydration-responsive element binding protein,DREB)属于转录因子家族AP2/EREB亚族。在应答脱水、高盐和冷胁迫中具有重要的作用[1,2]。DREB参与了植物胁迫中有ABA 依赖和非ABA 依赖响应的2 种响应途径,研究发现DRE2 结合蛋白DBF1 和DBF2 可以与干旱响应基因的顺式作用元件特异性结合,并在ABA 依赖的小麦水分胁迫反应途径中调节与抗旱相关的rab17 基因的表达[3]提高转基因植物对干旱、高盐和冷胁迫的耐受性[4,5]。通过在模式植物中过表达DREB 基因,已经揭示了许多植物的DREB基因在逆境胁迫应答中的作用[6]。 大肠杆菌DH5α是目前原核细胞表达系统中应用最普遍的基因工程菌之一 [7]。大肠杆菌表达系统的发展历史可追溯到20 年前。科学家分别将酿酒酵母DNA 片段、粗糙链孢霉DNA 片段和哺乳动物cDNA 片段导入大肠杆菌,引起其表型的改变,证明了外源基因在大肠杆菌中可以使现有功能的活性表达[8]。与其他表达系统相比,大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等特点[9-10],是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具[11-12]。本实验通过对大肠杆菌DH5α构建DREB基因的表达载体的构建,为后续试验以及相关研究打下坚实基础。其次,通过对含有DREB基因的大肠杆进行工程培养,也为生物科学专业学生的实验学习提供较为稳定的菌种。 1材料与方法 1.1材料 供试原核表达载体为大肠杆菌菌株DH5α,由新疆农业大学农学院生物技术引论与实践课程组提供。

高效表达可溶性重组蛋白表达载体_pHisSUMO

3 讨论 构建真核表达载体首先要根据其用途和基本策略进行严密的实验设计,如果将目的片段和载体质粒分别双酶切后进行连接,会因酶切效果不理想导致缺失。因此本研究采取T 载体克隆的方法将目的片段连入P M D -19T 载体中,然后从P M D -19T 重组载体上酶切下目的片段再与同样经酶切处理的PcDNA3载体进行连接,这样就保证了重组质粒PcDNA3-h LY Z 构建的成功和准确,为研究h LY Z 基因的真核表达奠定了基础[6]。 对上述阳性克隆进行DNA 测序,结果表明扩增的5’和3’调控区与已发表的序列的同源性较高。该调控序列在牛、人和鼠的相应区域进行比较同源性均为97%~100%,说明该调控序列在人、牛和小白鼠上具有较高的保守性[7]。 对于构建特异表达载体来说,5’和3’UTR 的特异启动子和调控系列尤为重要。许多研究证实其酪蛋白基因5’端和3’端UTR 及启动子是乳腺特异表达的关键调控原件。另外,乳蛋白基因UTR 是构建乳腺生物反应器表达载体的核心生物元件[8]。目前已经用于转基因动物乳腺生物反应器的调控元件主要有:β-乳球蛋白基因、aS1和β-酪蛋白调控序列、乳清酸 蛋白基因调控序列和乳清白蛋白基因调控序列[9] 。近二十年的研究证明,以β-乳球蛋白和β-酪蛋白基因调控序列构建的乳腺生物反应器表达载体在绵羊、山羊和奶牛上获得高水平表达,而乳清酸蛋白基因调控序列指导的蛋白则在兔和猪等动物上有较高水平的表达,但各有优缺点[3]。国外研究报道表明酪蛋白是在乳腺的特异表达的蛋白质,是乳腺的主要 蛋白[10]。pC -h LY Z 载体的成功建立为研究酪蛋白基因5’端和3’端的调控序列的调控机理和调控特性提供了一个平台;并用上述牛乳腺特异表达载体表达药用蛋白,建立具有产业开发价值的牛乳腺高效表达技术体系和进一步制作转基因动物奠定了基础。 参考文献: [1]楼善贤,苗得林.溶菌酶的研究进展[J ].中国肿瘤临床,1994,21 (9):709. [2]荣晓花,凌沛学.溶菌酶的研究进展[J ].中国生化药物杂志,1999,20(6):319-320. [3]M aga E A ,Murray J D.M ammary gland expression of transgenes and the po 2tential for altering the properties of m ilk [J ].Biotechnol ,1995,13:1452-1456. [4]朱秋菊,孙怀昌.鸡输卵管暂态表达人溶菌酶的研究[J ].生物技术通讯,2006,6:11-12. [5]孙怀昌,于峰,苏建华,等.人溶菌酶基因治疗奶牛乳腺炎的初步研究[J ].畜牧兽医学报,2004,35(2):227-232. [6]李辉,王希彪.中国动物遗传育种研究进展[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005,08:111. [7]史瀛仙,季肖东,李光三,等.转基因小鼠的研究[J ].生物工程学报,1999,6(3):205-211. [8]李宁,昊常信,陈永福.牛aS1酪蛋白基因启动区的克隆和序列分析[J ].遗传,1997,19(1):4-8. [9]Liu J ,Lin A ,Zhou Y,et al.Expression control of beta -lac -toglobulin gene and iapplication[J ].Biotechnol I nform ation ,2001,3:23-27. [10]薛京伦,卢大儒.乳腺生物反应器的研究现状[J ].生物技术通报,1998,(3):17-20. 高效表达可溶性重组蛋白表达载体———pHisSUM O 李璐1 ,尹成凯2 ,李德山 23 (1.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,黑龙江哈尔滨150030;2.东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030) 摘要:目的:构建含有I L -1基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,验证pHisS UM O 表达载体的高效可溶性表达。方法:以质粒pM D18-T -I L -1为模板,利用PCR 获得I L -1基因克隆并将其与表达载体pET 、pTY B 、pHisS UM O 连接,重组质 粒经鉴定后转化到大肠杆菌DH5 α中,并检测其蛋白表达情况。结果:仅在pHisS UM O 表达系统获得了I L -1融合蛋白的高效可溶性表达。利用Ni -NT A 纯化后的融合蛋白经S UM O 蛋白酶Ⅰ切割,获得了纯度较高的成熟蛋白且不残留任何氨基酸残基。结论:实验证明pHisS UM O 表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量。 关键词:pHisS UM O ;高效表达载体;S UM O 蛋白酶 中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2009)03-0011-04 An Expression V ector for E fficient Expression of Soluble R ecombinant Proteins ———pH isSUMO LI Lu 1 ,YI N Cheng -kai 2 ,LI De -shan 23 (1.Life Science and Biotechnique Research Center ,N ortheast Agricutural University ,Harbin 150030,China ; 2.C ollege of Life Science ,N ortheast Agricutural University ,Harbin 150030,China ) Abstract :Objective :T o construct the prokary otic expression plasmid included I L -1gene and detect the result of expression ,to verify pHisS UM O for efficient expression of s oluble recombinant proteins.Method :Plasmid pM D18-T -I L -1was taken as the tem plate firstly ,I L -1gene was cloned by PCR and connected to the expression vector pET ,pTY B and pHisS UM O ,then the recombinant plasmid was identified and trans formed into E .coli DH5 αcom petence cell ,and the expressed protein w ould be detected.R esult :High yield of the fusion protein was only acquired in pHisS UM O expression system in s oluble form.The human I L -1with high purity was harvested without any additional amino acid residue ,after Ni -affinity chromatography purification and cleavage by S UM O protease Ⅰ.Conclusion :The data show that pHisS UM O expression system is help 2ful to enhance the s olubility and yield of interested proteins. K ey w ords :pHisS UM O ;high efficient expressive vector ;S UM O protease 收稿日期:2008-11-07;修回日期:2009-03-20基金项目:黑龙江省科技攻关重点项目资助(G B06C315) 作者简介:李璐(1975-),女,硕士,实验师,研究方向:生物制药学;3通讯作者:李德山(1950-),男,博士生导师,教授,从事生物制药学研究,Email :deshanli @https://www.wendangku.net/doc/8312582230.html, 。 目前,重组蛋白的表达主要是利用大肠杆菌,其具有使用安全、操作简便、周期短且不存在病毒致癌基因污染等优点,是重组蛋白药物研究和生产中使用最广泛的表达系统[1,2]。重组蛋白表达关键的问题是选用合适的表达载体,现已建立 的大肠杆菌表达系统有融合表达、非融合表达、分泌表达、带纯化标签的表达载体等,而融合表达载体又有pET 系列、pTY B 、pGE M 及pGEX 等。表达载体的类型虽多,但选择合适的、满足人们需求的表达载体却很难,如pET 系列载体虽然应用较广泛,但对有些蛋白的表达却不是很理想。而其它一些融合蛋白表达系统蛋白表达量虽然很高,但多数表达的目的蛋白可溶性较差。这就要求我们去寻找更多的高效稳定、可溶性较好的表达系统以满足不同类型基因的表达。 我们在表达I L -1的过程中,发现在大肠杆菌中难以获得高效稳定的可溶性表达,其原因可能在于该蛋白在大肠杆菌

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