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SD大鼠甲苯胺蓝染色步骤

SD大鼠甲苯胺蓝染色步骤
SD大鼠甲苯胺蓝染色步骤

SD大鼠甲苯胺蓝染色步骤

1、甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞表型

Ⅱ代软骨细胞以2x105/ml的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的24孔细胞培养板中,与原代培养条件相同,制作细胞爬片,常规培养48h后行甲苯胺蓝染色。

具体操作步骤如下:

(1)倾去培养液,PBS充分漂洗3次,加入10%的中性甲醛常温下固定30min。

(2)倾去10%的中性甲醛,PBS充分漂洗3次,加入70%的乙醇固定30min除去四价铵离子,以免影响染色。

(3)倾去70%的乙醇溶液,PBS充分漂洗3次,晾干,加入甲苯胺蓝乙醇液(甲苯胺蓝0.2g

溶于30%乙醇100m1)染色_20min。

(4)PBS充分漂洗3次,迅速用无水乙醇再漂洗1次。

(5)取出爬片,干燥后中性树脂封片,电子显微镜下观察、摄片。

2、型胶原免疫细胞化染色法鉴定软骨细胞表型

Ⅱ代软骨细胞以2×105/ml的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的24孔细胞培养板中,与原代培养条件相同,制作细胞爬片,常规培养48h后行免疫细胞化学法染色。实验过程严格遵照免疫细胞化学染色试剂盒说明书进行操作,PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照组。

具体操作步骤如下:

(1)倾去培养液,冰冷的PBS漂洗3x3min,加入4%多聚甲醛1ml室温固定15min。

(2)PBS清洗标本3x3min,每张标本滴加1滴新鲜配制的3%H202,室温下孵育10min。

(3)PBS清洗标本3x3min,每张标本滴加穿膜液0.5m](0.1%timton+o.1M Glycine)冰上孵育

30min。

(4)PBS清洗标本3x3min,每张标本滴加5mg/ml的动物非免疫封闭血清(BSA)0.5ml,室温

下封闭1h。

(5)滴加1:150稀释的兔抗大鼠II型胶原多克隆抗体50ul于封口膜上,使标本与一抗充分

接触,置于湿盒中4℃过夜。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照组。

(6)PBS清洗标本3x3min,加入二抗工作液,37℃孵育20min。

(7)PBS清洗标本3x3min,每张标本滴加1滴SABC试剂,37℃孵育20min后PBS(pH7.2~7.6) 清洗标本4x5min。

(8)DAB显色:取蒸馏水1ml,加入试剂盒中A、B、C试剂各一滴,混匀后滴加至标本。

室温下显色,显微镜下观察并控制反应时间(约5-30min)。

(9)蒸馏水漂洗,苏木素轻度复染,脱水。

(10)干燥后中性树脂封片,电子显微镜下观察、拍照。

豚鼠关节软骨细胞甲苯胺蓝染色鉴定

将F1代豚鼠关节软骨细胞以1×104/ml的浓度传代至孔底铺有圆形盖玻片的24孔板

中;正常培养,制作细胞爬片,镜下观察细胞状态,取细胞状态及数量适宜(2天左右)

的爬片染色。染色步骤如下:

1取出细胞爬片,用PBS缓冲液漂洗3次,每次3min,吸弃PBS,每张爬片滴加4%多聚甲醛100 ul,铺满爬片,室温固定3h。

2 PBS漂洗3次,每次3min后吸弃PBS,每张爬片滴加70%的乙醇100 ul室温固定20min。

3 PBS漂洗3次,每次3min后吸弃PBS,晾干后每张爬片滴加0.04%的甲苯胺蓝溶液50 ul,室温下处理20min,无水乙醇迅速漂洗1次,晾干封片,观察拍照记录。

II型胶原免疫组化染色鉴定

取F1代豚鼠关节软骨细胞以1×104/m1的浓度传代到铺圆形盖玻片的24孔板中。

常规培养,制作细胞爬片,每天镜下观察细胞生长情况,2天后取出爬片染色。染色

步骤如下:

1、用PBS缓冲液漂洗3遍,每次3min,吸弃PBS,每张爬片滴加新配制的4%多聚甲醛100ul,室温固定30min。

2、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS,每张爬片滴加100 ul新配的3%H202,室温下处理10min,以便阻断内源性过氧化物酶的活性。

3、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS,在爬片上滴加50 ul穿膜液后于冰上处理30min。

4、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS,在爬片上滴加5mg/ml的血清封闭剂(BSA)100 ul,室温下封闭1h。

5、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS,在爬片上滴加第一抗体(II型胶原抗体)50 ul,置于湿盒中4℃孵育过夜。

6、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS,在爬片上滴加50ul即用型第二抗体,室温下处理15min。

7、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS,在爬片上滴加DAB显色试剂(现配)100 ul,室温下处理5min。

8、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS,苏木素复染20s,蒸馏水充分清洗。细胞爬片用梯度酒精脱水后干燥,封片,观察拍照。

石蜡切片免疫组化染色步骤

石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理: 抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。为保证试验的正常进行,可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂,对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下: 1.1 APES:现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中,停留20~30秒钟,取出稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES,置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM:将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中,停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次,室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时,装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中,浸泡5分钟,60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化: 2.1 胰蛋白酶:一般使用浓度为0.05%~0.1%,消化时间为37℃、10~40分钟,主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶:一般使用浓度为0.4%,消化时间为37℃、30~180分钟,主要用于细胞间质抗原的显示,如:Laminin(层粘蛋白),Collagen IV(IV型胶原)等。 2.3 皂素(Saponin):一般使用浓度为2~的saponin溶液,消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复: 可根据实验室的具体条件,选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液,如TBS、PBS、重金属盐溶液等,但实验证明,以0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制,取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中,混匀,其pH值在6.0 0.1,如因蒸馏水本身造成的pH值偏差,请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,3%H2O2处理10分钟,蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟(注意:无论是使用医用或家用微波炉,请根据具体机型酌情设置条件,务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器,室温冷却10~20分钟(注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗,下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法:切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5~6分钟后),计时1~2分钟,然后将压力锅端离热源,冷水冲至室温后,取下气阀,打开锅盖,取出切片,蒸馏水洗后,PBS洗2分钟×3,下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟,然后端离电炉,室温冷却20~30分钟,蒸馏水冲洗,PBS洗,下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤: (以美国ZYMED公司SP试剂盒为例) 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,(如需采用抗原修复,可在此步后进行)。

革兰氏染色的实验原理

革兰氏染色的实验原理 ●G+细胞壁的网状结构致密,交联度高,用乙醇处理后,发生脱水作用,肽聚糖层孔径缩小,透性降低,故细菌仍保留初染时的紫色。 ●G-肽聚糖层较薄,交联度低,含较多类脂质,故用乙醇处理后,类脂质被溶解,细胞壁孔径变大,通透性增加,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,细胞被脱色,经沙黄复染呈红色。 涂片固定→结晶紫初染(碱性)→碘液媒染→乙醇(丙酮)脱色→番红复染(碱性)

◆◆◆原理: 当用结晶紫初染后,所有细菌都被染成初染剂的兰紫色,碘作为媒染剂,它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物,从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时,两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成,壁厚,类脂含量低,用酒精脱色时细胞壁脱水,使舦聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同,由于其细胞壁舦聚糖层较薄,类脂含量较高,,所以当脱色处理时,类脂质被酒精溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。 ◆◆实验步骤: 1、制片 涂片——干燥——固定 2、初染 滴加结晶紫染色1——2分钟,水洗; 3、媒染 用碘液冲去残水,并用碘液覆盖1分钟; 4、脱色 滴加95%酒精脱色,25-30秒,立即水洗; 5、复染 用番红液复染约2分钟,水洗; 6、镜检 干燥后,用油镜观察。 细菌:细菌是一种具有细胞壁的单细胞微生物,在适宜条件下,能进行无性二分裂繁殖,其形态和结构相对稳定。一般体积微小,通常需要借助光学显微镜才能看到,其测量单位用微米表示。

石蜡切片免疫组化染色实验操作流程

石蜡切片免疫组化染色实验操作流程_ 1.石蜡切片脱蜡至水: (石蜡切片染色前应置60℃1小时)。 ①二甲苯I、II,各30分钟。 ②梯度酒精:100%I、II,各10分钟;95%,5分钟;80%,5分钟;70%5分钟。 ③蒸馏水洗:5分钟,2次(置于摇床)。 2抗原修复: 根据待检测的抗原,选择适当的方法。 附: 抗原修复液(10mMpH 6.0枸橼酸钠缓冲液)的配制: ①储备液的配制: A液: 枸橼酸三钠-2H2O 29.41g+蒸馏水1000ml;B液: 枸橼酸21g +蒸馏水1000ml;②工作液的配制: A液82ml+ B液18ml+蒸馏水900ml 抗原修复的方法: 高压锅处理技术: 枸橼酸钠缓冲液(10mM,PH

6.0),淹没切片,盖上锅盖,高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却(可用自来水在高压锅外冲,以助冷却)。晾至室温抗原修复的注意事项: ①组织不能干。②选择抗原修复方法要因抗体而异。③该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④抗原修复后至DAB显色的过程中,均需用PBS缓冲液。 3.PBS:5分钟,2次(置于摇床) 4.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2,室温20分钟(避光)。 5.PBS水洗:5分钟,2次。 6.正常血清封闭: 从染片缸中取出切片,擦净切片背面水分及切片 正面组织周围的水分(保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清(与第二抗体同源动物血清)处理,37℃,15分钟。 附: 正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制): 按1:10比例,用PBS配制,每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量)计算。 7.滴加第一抗体: 用滤纸吸去血清,不洗,直接滴加第一抗体50μ,(也可置于4℃冰箱过夜)。 第二天片子晾至室温 8.PBS:5分钟,2次。 9.滴加聚合物增强剂(试剂A),37℃孵育30分钟, 0.01 M PBS洗涤三次,5分钟/次,振洗。

HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤

HE染色 1.取材 切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项: (1)取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 (2)切片材料应根据需要观察的部位进行选,尽可能不要损伤所需要的部分。 2.固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次,立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定,固定36小时。 注意事项: (1)一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。 (2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。 (3)固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1-2次新液。 (4)材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥(进口脱钙液) 镊子触质粒由硬变韧性为准。 (美):固定3-5天根据组织大小确定天数,越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。(20,30,30,60) (美):流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水,各30min 注意事项: (1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。 (2)在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。 (3)在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。 (4)在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。(5)如需过夜,应停留在80%酒精中。 (6)脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象 (美):80%的酒精×2小时 95%的酒精×2小时 100%的酒精×2小时×2 100%的酒精×1小时或者更长时间 5.透明(环保透明脱蜡液)中杉金桥 纯酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min(至透明为止)。 由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。

革兰氏染色法的步骤

革兰氏染色法的步骤 详细阐叙革兰氏染色法的步骤 浏览次数:174次悬赏分:0 |解决时间:2011-5-25 17:44 |提问者:肖箫 2011shaw 最佳答案 革兰氏染色 一、目的:在细胞发放之前,利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测,判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。 二、原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。 三、实验用品准备: 灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器 四、操作: 1 涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上,用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央,用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层,涂布面不宜过大。 2 干燥:将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。 3 固定:固定常常利用高温,手持载玻片的一端,标本向上,在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次,共约2-3秒种,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。 4 初染:在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴,使染色液覆盖涂片,染色约 1min。 5 水洗:斜置载玻片,在自来水龙头下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。 6 媒染:用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆盖涂片,染色约1min。

石蜡切片、HE、免疫组化步骤

石蜡切片、HE、免疫组化实验 一:取材及石蜡切片的制作(本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈) ①取材:小鼠脱颈处死后,应立即找到自己所需的组织器官,用一张滤纸将所需器官放在其上(可以加一些生理盐水在上面,防止干了),修去多余的脂肪、系膜等不要的组织,根据不同器官切成合适大小的形状(如小肠应切成1cm长度的长柱形)。将切好的组织装于冻存管中,加入4%的PFA(PFA的作用是保护蛋白,防止蛋白降解)固定过夜(固定时间不能超过24h,如果24h后不能完成脱水工作,可以先50%、70%酒精脱水后,置于4℃冰箱保存。) ①脱水(目的是为了使组织从水相置换到有机相)(根据不同的组织,脱水时间不同):将PFA中的组织取出,放入组织盒(组织盒子应尽量选择小格子,防止组织脱水过程中掉出来),一个组织盒可以放4~8个组织小块,切一张与格子大小合适的纸条一并装入,做好标签,防止后期辨认不出具体组织(只能用铅笔写,中性笔会被酒精脱去)。使用自动脱水机进行脱水,设定程序为:酒精50%、70%、80%、90%(各20min)、无水乙醇(30min/次,两次)、酒精二甲苯混合物(1:1)20min、二甲苯20min(两次)、二甲苯石蜡混合物(1:1)30min、石蜡①1h;脱水结束后,取出组织盒,置于石蜡①中1h(石蜡应提前融化,且不能凝固,放在70℃烘箱中)。 ①包埋:用4X6cm的小纸条根据小木块形状,叠成盒子(盒子最好四边叠平,不要左右不平,便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状,最好不要漏),取一个盒子,将融化的石蜡①倒入,在其快要凝固的时候,将组织按照所需的形状,摆正(如小肠切成的小柱子应立起来,便于后面切片的时候,可以切到所需的形状),再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定(为了包埋后识别组织,且不能将纸条放在蜡块中央,后期不好取出,会损坏刀片),倒蜡之前,可以将盒子放在铁皮或小铁块上(能够让石蜡更快凝固。),每次用镊子拿组织或摆正组织之前,先烧一下(能够更好摆正组织块,可以随时调整组织位置)。包埋过夜。 ①切片:将包埋好的蜡块取出,置于小木块上,用刀修成梯形(包埋时组织所在的底面现在变成正面,主要修这一面,蜡块厚的一面用烧过的刀块烫平,贴在小木块上,贴紧底面后,用刀片烫一下四边,使蜡块完全固定在小木块上,防止切片时掉落)(组织蜡块的梯形上下边一定要平行,梯形不用太大,也不能太

切片、免疫组化步骤

冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内(直径2cm),如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮内,大约 10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用,或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm,冰冻切片后如不染色,必须吹干,储存低温冰箱内,或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS洗,5分钟×3。 用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS洗,5分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤(滴加一抗开始)。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法(以SP试剂盒为例) 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS 冲洗,2分钟×3次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5. PBS冲洗,2分钟×3次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。 7. PBS冲洗,2分钟×3次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。 9. PBS冲洗,2分钟×3次。 10. 显色剂显色(DAB或AEC)。

微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色

微生实验报告 姓名: xx 专业年级:2011级生物技术 学号:1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷,能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低,当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷,所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电何,能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时,细菌所带正电荷增加,因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物,又称复合染料,如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法,简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质,增加了细胞壁的通透性,使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔

径缩小,通透性降低,草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉,因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种: 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂: 草酸铵结晶紫染液,卢哥氏碘液,95%酒精,番红复染液,复红染液,吕氏美蓝染液,显微镜擦拭液(乙醚: 乙醇=7:3),xx柏油。 3、器材: 废液缸,洗瓶,载玻片,接种环,酒精灯,擦镜纸,双层瓶,显微镜。 四、实验方法 (一)简单染色 1.涂片: 取干净载玻片一片,在载玻片的左右各加一滴生理盐水,按无菌操作法取菌涂片,左边涂金黄色葡萄球菌,右边涂大肠杆菌,做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片,将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片,注意取菌不要太多。 2.晾干: 让涂片自然晾干。 3.固定:

石蜡切片免疫组化步骤

石蜡切片免疫组化步骤 1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。 2.脱蜡和水化:二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min) 4.抗原修复:柠檬酸钠缓冲液95度,10分钟. (枸橼酸三钠3g 枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右,然后用NaOH或HCI调pH值6.0,最后定容在1000ml) 5. PBS浸洗2次各5min 6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度,避光)。肝组织过氧化物酶含量高。需增加浓度或增长时间。蒸馏水洗2minx3次 8.pbs-曲拉通通透(pv法不需要) 9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。(pv法不需要) 9.滴加一抗4℃过夜 10.PBS浸洗3次各5min 11.滴加二抗室温或37℃孵育30min 12.PBS洗3次各5min 15.DAB显色5~20min,自来水充分涮洗 16.苏木素复染2~3min,自来水充分涮洗 17.氨水反蓝,过蓝可用盐酸酒精分化2s,自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝,自来水里加几滴稀氨水,就行了,返蓝时间5分钟左右,就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水+三四滴的氢氧化铵; 18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min) 19.封片:中性树脂,加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡),自然晾干 二、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前,应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上,然后按以下流程进行: 二甲苯Ⅰ(1h)、二甲苯Ⅱ(30min)、100%酒精(30min)、95%酒精(15min)、70%酒精(15min)、50%酒精(15min)、蒸馏水(15min) 2、3%H2O2,室温封闭5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。 3、甩去H2O2,蒸馏水洗2min×3次。 4、抗原热修复:将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中(耐高温),进入微波炉内,容器内液体温度达到95~100℃后断电,连续三次。 5、PBS冲洗5min×3次。 6、5%BSA封闭液20min,甩去。 7、用0.1mol/L PBS稀释一抗100倍,滴加后4℃过夜。 8、PBS冲洗2min×3次,滴加二抗37℃20min,PBS冲洗2min×3次,滴加SABC 37℃20min,PBS冲洗5min×4次,显色剂显色。 9、自来水冲洗,封片,观察。 注意:如果需要做双标记法,则在操作完步骤8后,重复步骤3~8即可

微生物的革兰氏染色实验报告

微生物的革兰氏染色 一、实验目的: 1、学习并初步掌握革兰氏染色法; 2、了解革兰氏染色的原理; 3、巩固显微镜的使用。 二、实验原理: 革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法。染色步骤分为四个部分: 1、初染:加入碱性染料结晶紫固定细菌图片; 2、媒染:加入碘液,碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物; 3、脱色:利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色; 4、复染:复红配成碳酸复红作为复染剂。 成分占细胞壁干重的% 革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌肽聚糖含量很高(50~90)含量很低(~10) 磷壁酸含量较高(<50)无 类脂质一般无(<2)含量较高(~20) 蛋白质无含量较高G-和G+细胞壁的比较: 1、阳性(G+)菌细胞壁特点:细胞壁厚,只有一层,主要由肽聚糖构成,肽聚糖含量高,结构紧密,脂类含量低。当乙醇脱色时,细胞壁肽聚糖层孔径变小,通透性降低,结晶紫和碘的复合物被保留在细胞壁内,复染后仍显紫色(如芽孢杆菌)。 2、阴性(G-)菌细胞壁特点:细胞壁薄,由两层构成,内壁层和外壁层,细胞壁中脂类中脂类物质含量较高,肽聚糖含量较低,网状结构交联程度低,乙醇脱色时溶解了脂类物质,通透性增强,结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来,因此,革兰氏阴性菌细胞被脱色,当复染时,脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色(例如大肠杆菌)。 三、实验步骤: 1、取一个载玻片,将其洗净并沿一个方向擦拭干净,直至液体不再其上收缩为止;将接种环整平,用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌,按常规方法图片,应涂大,不宜过厚。 2、将涂片用火焰固定,不宜烤得太狠,否则菌种呈假阳性。 3、滴加1滴结晶紫染液,染色1min,水洗。 4、滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗 5、滴加脱色乙醇,脱色30~40s,不宜脱色太狠,否则菌种呈假阴性。 6、水洗,滴加番红复染液,复染1min,水洗,晾干 7、镜检并拍照。 四、注意事项: 1、选用活跃生长期菌种染色,老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。 2、涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。 3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够造成假阳性,脱色过度造成假阴性。实验结果与讨论: 1、结果: 高倍镜下观察的菌体图像:

免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)

免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法 一、原理及应用 免疫组化,简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。 二、操作步骤: (1)将石蜡组织切片置于65°C恒温箱,烤片1h左右。 (2)脱蜡:二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精(由高到低)各5min。 (3)1×PBS 洗涤3次,每次 5min。 (4)0.5% Triton X-100通透(PBS配制),目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内,这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。当然了,如果检测的是膜抗原无需通透,忽略该步骤。 (4)抗原修复:使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复,微波炉微波高火 3min,之后转成低火 15-30min。 注:福尔马林或多聚甲醛固定,会导致蛋白交联,而解交联的过程称为抗原修复。所以冰冻切片不需要抗原修复!!抗原修复方法有多种,一般包括两大类:酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。微波法最为常用。(5)1×PBS 洗涤3次,每次5min。 (6)3% H2O2,室温孵育30min,目的是灭活内源性过氧化物酶。

(7)1×PBS 洗涤3次,每次5min。 (8)使用1% BSA 进行室温封闭30min,用于封闭非特异性抗原表位。 (9)根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗,4°C 湿盒中静置过夜孵育。 (10)次日取出切片,室温下复温30min。 (11)1×PBS 洗涤3次,每次5min。 (12)按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。 (13)DAB 显色:DAB 显色液按说明书配制,使用时滴加到血管组织上,显微镜下观察并计时,待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。(14)苏木素染细胞核:苏木素染液5-10min(根据苏木素染液使用时间的长短,来调整染色时间)→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。(15)脱水:梯度酒精(由低到高)各5min → 二甲苯I 10min→ 二甲苯 II 10min。 (16)中性树胶封片。 三、免疫组化结果分析原则及具体方法 (1)必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 (2)抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上; CK应定位在细胞浆内; PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内; EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色,一概不能视为阳性。

免疫组化HE染色步骤

免疫组化H E染色步骤 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020

骨组织石蜡切片制作 步骤: 1.固定:切取骨缺损出的骨组织,用PBS冲洗,放入4%多聚甲醛缓冲 液内固定12—24h。 2.脱钙:将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水:将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次,再用50%的酒精冲洗2次,常规脱水,70%酒精(60min),80%酒精(40min),95%酒精(30min),100%酒精1(25min),100%酒精II(25min)。 4.透明:二甲苯I(35min),二甲苯II(35min)。 5.包埋:将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时,石蜡II1小时。 6.切片:包埋后的组织块经修理后,用切片机切成4um的石蜡带,将组织石蜡块在50℃温水中展片,然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片:将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤: 1.脱蜡:将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1 (10min)二甲苯2(10min)。 2.水化:100%酒精1(2min)100%酒精(2min)95%酒精(2min) 80%酒精(2min)70%酒精(2min)。 冲洗3次,每次5min.。

4.抗原修复:将组织片置的柠檬酸缓冲液()中煮沸15min,自然冷 却至室温。 冲洗3次,每次5min。 6.阻断:3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 冲洗3次,每次5min。 8.滴加1抗(GFP1:100稀释,4℃过夜) 冲洗3次,每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1,37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次,每次5min。 11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2,37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次,每次5min。 显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水,透明,封片,镜检。 组织切片HE染色 步骤 1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1,二甲苯II进行脱蜡各 10min。 2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2min,PBS冲洗2次,每次5min。

革兰氏染色实验

革兰氏染色实验 革兰氏染色(Gram Staining)是用来鉴别细菌的一种方法:这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同,可将细菌分成两类,即革兰氏阳性(Gram Positive)与革兰氏阴性(Gram Negative)。(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明)。 未经染色之细菌,由于其与周围环境折光率差别甚小,故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比,可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征,而用以分类鉴定。 阳性紫色,阴性红色 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌: 革兰氏阳性菌:葡萄球菌属(主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等)、链球菌属(肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等)、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等,其中,金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌。

革兰氏阴性菌:埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属(绿脓杆 菌等)、莫拉菌属(卡他莫拉菌等)、奈瑟菌属(淋球菌、脑膜炎 双球菌等)、不动杆菌属(鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等)、克 雷伯菌属(主要是肺炎克雷伯杆菌)、沙门氏菌属、志贺氏菌属(痢 疾杆菌等)、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜 血杆菌属(杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等)、产气杆菌属、霍 乱弧菌、阴沟肠杆菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中 占了大约65%,且大多菌株容易对抗菌药物耐药,产生“新德里金 属酶”(NDM-1)的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌(主要是大肠 杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌)。 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌,它们能产生外毒素使人致病,而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌,它们产生内毒素,靠内毒素使人致病。 细胞形态和结构 细胞的基本结构包括细胞壁和原生质体两部分。原生质体位于细胞壁内,包括细胞膜(细胞质膜)、细胞质、核质和内含物。另外细胞还含有有些特殊结构,主要有荚膜、芽孢、鞭毛和菌毛等4种。 1.细胞壁

免疫组化超详细步骤

免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020

免疫组化 一实验目的:分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使的(、酶、、)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和),对其进行定位、定性及定量的研究,称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备:切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液,36毫升应用B液,加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠(三水合柠檬酸三钠)配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液,41毫升应用B液。 苏木素染液配方:苏木素2g,无水乙醇250毫升,硫酸铝蒸馏水750毫升,碘酸钠,冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇,再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合,加入碘酸钠,最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤: 1组织常规石蜡切片厚度3-5um,防脱片捞片后晾干,放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟; ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟;(洗二甲苯) ⑶95%乙醇3分钟; ⑷85%乙醇3分钟; 3自来水漂洗3分钟,洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法:压力锅中加入,抗原修复液约1000ml,切片插入塑料架上,放入压力锅,盖上锅盖(此时不扣上压力阀)1600W预热至沸腾,扣上压力阀1300W,待高压锅阀门喷气开始计时,修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温,室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中,浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2,室温放置4分钟。(需要盖盖子)自来水洗2分钟,PBS缓冲液洗涤2分钟。

2021年革兰氏染色实验步骤

革兰氏染色 欧阳光明(2021.03.07) 一.实验流程: 1、取载玻片用纱布擦干,载玻片的一面用marker笔画一个小圈(用来大致确定菌液滴的位置)。涂菌的部位在火焰上烤一下,除去油脂。 2、涂片: 液体培养基:左手持菌液试管,在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖;右手持接种环在火焰中烧灼灭菌,等冷却后从试管中沾取菌液一环,在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜,最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基:先在载玻片上滴一滴无菌水,再用接种环取少量菌体,涂在载玻片上,使其薄而均匀。 3、晾干:让涂片在空气中自然干燥。 4、固定:让菌膜朝上,通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)。 5、染色:将固定过的涂片放报纸上,滴加草酸铵结晶紫液,染1min。 6、水洗:用水缓慢冲洗涂片上的染色液,用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 7、媒染:滴加1滴碘液,染1min,水洗。 8、脱色:吸去残留水,连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液

无紫色,立即水洗。 9、复染:滴加蕃红复染3-5min,水洗。至此,革兰氏染色结束。 二.染色结果:革兰氏阳性菌都呈紫色,革兰氏阴性菌都呈红色。 备注: 1.革兰氏阳性菌:葡萄球菌属(主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等)、链球菌属(肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等)、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等,其中,金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌。 2.革兰氏阴性菌:埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属(绿脓杆菌等)、莫拉菌属(卡他莫拉菌等)、奈瑟菌属(淋球菌、脑膜炎双球菌等)、不动杆菌属(鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等)、克雷伯菌属(主要是肺炎克雷伯杆菌)、沙门氏菌属、志贺氏菌属(痢疾杆菌等)、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属(杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等)、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。

实验二 革兰氏染色法

实验二革兰氏染色法 【实验目的】 1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3.巩固显微镜油镜的使用方法。 【实验仪器、材料】 1.菌种:大肠杆菌,金黄色葡萄球菌菌液。 2.染色剂:革兰氏染色试剂盒(结晶紫染色液、碘液、脱色液(95%乙醇)、复红染液)。 3.仪器及其他物品: 显微镜、香柏油、无水乙醇、载玻片、擦镜纸、滤纸、酒精灯、试管架、废液缸、记号笔、接种环、镊子、打火机等。 【实验内容】 革兰氏染色法 一、染色标本制备 1.涂片取一张洁净的载玻片,滴加少许生理盐水,用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环,与生理盐水研磨均匀,做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。(事先在载玻片的反面滴加菌液的相应位置做好标记) 2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥。(温度不宜过高) 3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于染料着色,常

用加热法,即将细菌涂片膜向上,通过火焰3次,以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 二、染色 l.初染滴加结晶紫覆盖菌膜,染lmin,自来水缓缓冲洗,甩去积水。 2.媒染滴加卢氏碘液,染lmin,水洗,甩去积水。 3.脱色滴加95%乙醇数滴,20s~30s,见紫色脱下立即用水冲洗,甩去积水。 4.复染滴加石炭酸复红液,染lmin,水洗,甩去积水,标本片用滤纸吸干。 三、镜检 待染色片充分干燥后,用油镜观察。 【实验结果】 葡萄球菌呈葡萄状排列,呈紫色,为革兰氏阳性菌; 大肠杆菌为散在的短小杆菌,呈红色,为革兰氏阴性菌。 注:绘图展示染色结果 【结果分析、讨论(结论与评价)】 注:分析你的染色结果是否正确?如果不正确,请分析原因。

革兰氏染色的机理和步骤

1.革兰氏染色的机理和步骤 机理:G+、G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性,抗脱色能力的差异。主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。 G+的CW:肽聚糖层厚,脂质含量低。乙醇脱色时CW脱水,孔径减少,透性降低,不易脱色,呈初染得蓝紫色。 G-的CW:肽聚糖层薄,脂质含量高。乙醇脱色时,类脂被乙醇溶解,透性升高,细胞被复染显红色。 步骤:①涂片:在干净的载玻片上滴一滴水,用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。 ②固定:将玻片靠近酒精灯火焰,蒸干水分,但不要烤焦。 ③初染:用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。 ④媒染: 以碘液媒染1min,水洗,吸干水分。(细胞内形成结晶紫与碘的复合物,增强相互作用) ⑤脱色(关键步骤):以95%的乙醇脱色30s,应适当振荡均匀,是乙醇脱色完全。 ⑥水洗,吸干。 ⑦复染:??(第2张)复染30s,水洗吸干。 ⑧干燥镜检。 2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。 芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差,以及皮层的离子强度很高,这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分,其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水,正是这种

失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。 3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应,并说明如何能够维持微培PH稳定。 答:培养过程中,由于营养物质被分解利用,代谢产物的形成与积累,会导致PH变化。 (第2张中的图) 还与培养基的C/N比有关,C/N高,经培养基后PH显著下降,C/N 低,经培养基后PH明显上升。 PH调节:①加入缓冲剂--------常用:一氢二氢磷酸盐,K2HPO4 呈碱性,KH2PO4 酸性,只在一定的PH范围内调节(6.4--7.2) ②大量产酸的菌株,加CaCO3调节,CaCO3难溶于水,不会使培养液的PH过度增加,但可不断中和微生物产的酸。 ③培养液中存在天然的缓冲系统,如AA,肽,Pr均属两性电解质,也起缓冲的作用。 ④过酸:治标------加NaOH、Na2CO3中和,治本-----加适量氮源:NaNO3、Pr、NH3·H2O;增加通风量。 ⑤过碱:治标-----H2SO4、HCl中和,治本----加适量碳源:G类,脂类;减小通风量。 3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株? 抗生素法(青霉素法):适用于细菌。原理:青霉素抑制肽聚糖链间的交联,组织了合成完整的CW,野生型B处于正常生长繁殖,所以对青霉素敏感,可被抑制或杀死;营缺B在基本培养基上休眠状态

免疫组化超详细步骤

免疫组化 一实验目的:分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等 四实验设备:切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液 应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液,36毫升应用B液,加8.5gNaCl。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液 应用液B 柠檬酸三钠(三水合柠檬酸三钠) 29.01g 配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液,41毫升应用B液。 苏木素染液配方:苏木素2g,无水乙醇250毫升,硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升,碘酸钠0.2g,冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇,再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合,加入碘酸钠,最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras 1:50-1:500 H-Ras 1:50-1:500 K-Ras 1:20-1:200 六实验步骤: 1组织常规石蜡切片厚度3-5um,防脱片捞片后晾干,放入72℃烤箱烤片2小时。 2 切片脱蜡水化程序

革兰氏染色法的过程及原理

革兰氏染色法的过程及原理 一,过程 1 .涂片 将培养的不同菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),干燥、固定。固定时通过火焰l 一2 次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。 2 .染色 ( 1 )初染加草酸铰结晶紫一滴,约一分钟,水洗。 ( 2 )媒染滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。 ( 3 )脱色将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用95 %酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20 一30 秒钟,立即用水冲净酒精。 ( 4 )复染用番红液染1 一2 分钟,水洗。 ( 5 )镜检干燥后,置油镜观察.革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比。 二,原理 革兰氏染色法(Gram stain )不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示:染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌:而脱色,不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。 青霉素作用机制 干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似,可与后者竞争转肽酶,阻碍你粘肽的形成,造成细胞壁的缺损,使细菌失去细胞壁的渗透屏障,对细菌起到杀灭作用。 溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用 溶菌酶作用机制:是一种能水解致病菌种黏 多糖的碱性酶,只要通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的 B-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分 解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物流 出而使细菌溶解,溶菌酶还可以和带负电荷 的病毒蛋白直接结合,与DNA,RNA,脱辅

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