DNA甲基化异常与肿瘤耐药
Hereditas (Beijing) 2014年5月, 36(5): 411―419 https://www.wendangku.net/doc/8213041804.html,
综 述
收稿日期: 2013-10-22; 修回日期: 2014-02-23
基金项目:国家自然科学基金项目(编号：81172091)和江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(编号：CXZZ13_0561)资助
作者简介:司鑫鑫, 博士研究生, 研究方向：肿瘤耐药与表观遗传。E-mail: sixinxin@https://www.wendangku.net/doc/8213041804.html,
通讯作者:孙玉洁, 教授, 博士生导师, 研究方向：肿瘤耐药与表观遗传。E-mail: yujiesun@https://www.wendangku.net/doc/8213041804.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0411 网络出版时间: 2014-3-3 12:41:51
URL: https://www.wendangku.net/doc/8213041804.html,/kcms/detail/11.1913.R.20140303.1241.003.html
DNA 甲基化异常与肿瘤耐药
司鑫鑫, 孙玉洁
江苏省人类功能基因组学重点实验室, 南京医科大学基础医学院细胞生物学系, 南京210029
摘要: 肿瘤耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因, 其产生机制复杂多样, 是多种因素共同作用的结果。近年来,
表观遗传改变在肿瘤耐药中的作用日益受到关注。DNA 甲基化是一种重要的表观遗传修饰, 在调节基因表达和维持基因组稳定性中扮演着重要角色。原发性或获得性耐药的肿瘤细胞大多伴随DNA 异常甲基化, 越来越多的证据显示, DNA 甲基化异常是肿瘤细胞耐药表型产生的重要机制。文章就DNA 甲基化异常与肿瘤细胞耐药的关系及相关作用机制进行了综述。
关键词: 肿瘤耐药; DNA 甲基化; 基因组稳定性; 基因表达
Aberrant DNA methylation and drug resistance of tumor cells
Xinxin Si, Yujie Sun
Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province , Department of Cell Biology , School of Basic Medical Sciences , Nan-jing Medical University , Nanjing 210029, China
Abstract: Drug resistance is one of the major obstacles limiting the success of cancer chemotherapy. The underlying mechanisms are complex. In recent years, the contribution of epigenetic changes to drug resistance has drawn increasing attention. DNA methylation is an important epigenetic modification that plays an important role in regulating gene expres-sion and maintaining genome stability. Primary or acquired resistance of tumor cells is usually accompanied by aberrant DNA methylation. Accumulating evidence has shown that aberrant DNA methylation is involved in drug resistance of tu-mor cells. In this review, we briefly review the relationship between DNA methylation and drug resistance of tumor cells as well as the underlying mechanisms.
Keywords: cancer drug resistance; DNA methylation; genome stability; gene expression
恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病, 化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一。尽管随着新药的问世和医疗水平的提高, 肿瘤治疗水平得到极大提高, 但肿瘤耐药依然是临床肿瘤治疗的主要障碍之一,
其机制复杂多样, 是多种因素共同参与的结果[1,2], 如细胞抗凋亡能力增强、DNA 损伤修复能力异常、ATP 依赖性药物转运泵表达上调、药物代谢改变等, 这其中涉及一系列基因表达调控的异常。越来越多
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的证据显示, DNA甲基化异常是肿瘤细胞耐药表型产生的重要机制。认识DNA甲基化改变在肿瘤耐药性形成过程中的作用, 对于更好地认识肿瘤耐药的产生机制, 进而有效预防和逆转耐药表型具有重要的意义。
1 特定基因的甲基化异常与肿瘤耐药
化疗药物通过引起DNA损伤、抑制增殖、促进细胞凋亡等多种途径杀死肿瘤细胞, 如：铂类药物可引起DNA链间或链内交联, 造成DNA断裂, 抑制DNA和RNA合成, 抑制细胞有丝分裂; 喜树碱类化疗药物可抑制拓扑异构酶Ⅰ, 阻止DNA解旋, 造成DNA损伤, 诱导细胞凋亡; 植物类药物如长春新碱、紫杉醇等, 可与微管结合影响其稳定性, 使有丝分裂停滞。肿瘤细胞内上述相关通路中的基因启动子甲基化水平异常所致表达改变均可能影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
1.1 DNA损伤修复基因的异常甲基化与肿瘤耐药
烷化剂、铂类等多种化疗药物能破坏DNA结构引起DNA损伤, 带有DNA损伤的细胞必须在细胞周期中暂停, 以便得到及时修复。DNA损伤修复是恢复DNA正常序列结构和维持遗传信息相对稳定的细胞反应, 包括错配修复、切除修复、双链断裂修复等。DNA损伤修复能力的改变是多种化疗药物耐药的重要分子基础。
DNA错配修复系统在肿瘤细胞中常表现为功能异常。错配修复系统的失活, 除了在多种肿瘤的发生过程中发挥重要作用, 也是导致恶性肿瘤耐药的一个重要因素。错配修复系统失活使细胞监测DNA损伤的能力下降, 因而不能激活凋亡反应; 基因突变率升高, 基因组不稳定性增加, 直接或间接地促进肿瘤耐药表型的形成[3,4]。DNA甲基化升高可以导致错配修复基因失活, 加强肿瘤细胞耐药性。例如：在顺铂耐药的卵巢癌细胞中, 编码DNA错配修复酶的hMLH1基因启动子的甲基化水平升高, 基因表达水平下降; 用甲基转移酶抑制剂处理该细胞, 可恢复hMLH1表达, 并能部分恢复耐药细胞对顺铂的敏感性[5,6]。比较临床卵巢癌患者在化疗前和复发时的血浆hMLH1启动子甲基化水平, 发现25%的患者在化疗前无hMLH1甲基化而复发时hMLH1发生甲基化并伴有微卫星不稳定性[7]。
乳腺癌易感基因BRCA1被认为是基因组的看护者, 在DNA损伤修复、细胞周期调控等过程中发挥重要作用[8]。当细胞内发生DNA双链断裂, H2AX 快速磷酸化, 将BRCA1募集到DNA损伤位点, 与Rad51、BRCA2、Rad50/Mre11/p95等相互作用, 对损伤DNA进行修复[9,10]。有研究报道, BRCA1的DNA损伤修复功能参与了肿瘤耐药。在MCF7的顺铂耐药细胞中BRCA1高表达, DNA修复能力明显增强; 用siRNA下调耐药细胞中BRCA1表达水平, 顺铂处理所产生的DNA损伤不能被及时修复, 凋亡增多, 细胞对顺铂的耐药性下降[11]。临床研究也发现, 乳腺癌和卵巢癌患者的BRCA1表达水平可作为化疗药物的选择依据, BRCA1功能缺失的肿瘤细胞对DNA靶向的化疗药物及纺锤体毒性药物更敏感[12]。启动子区甲基化异常是造成BRCA1表达改变的主要原因之一[13]。BRCA1基因启动子区的甲基化水平和卵巢癌患者对铂类化疗的敏感性呈正相关[14]。1.2 凋亡相关基因的异常甲基化与肿瘤耐药
多数化疗药物可通过诱导细胞凋亡来杀死肿瘤细胞, 反之, 肿瘤细胞也可通过逃逸或拮抗凋亡获得生存[15]。凋亡酶激活因子-1(APAF1)是一种促凋亡基因, 在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用。APAF1阴性的黑色素瘤细胞对各种化疗药物均有不同程度的耐受, 用DNA甲基转移酶抑制剂处理, 可恢复其表达, 肿瘤细胞对化疗的敏感性也随之升高[16,17]。CASP8也是一种促凋亡基因, 是死亡受体介导的凋亡途径中的关键启动子。研究发现, 在多种肿瘤细胞中CASP8基因的启动子均被甲基化, DNA甲基转移酶抑制剂处理可逆转CASP8的高甲基化, 提高肿瘤细胞对多种化疗药物如阿霉素、依托泊苷、顺铂等的敏感性[18]。Chaopatchayakul等[19]检测了化疗敏感和耐受的宫颈癌患者样本中一系列凋亡基因的甲基化水平, 发现化疗耐受组患者的死亡相关蛋白激酶基因(DAPK)和肿瘤坏死因子受体超家族成员(FAS)的甲基化水平更高。DAPK和FAS 基因的高甲基化导致其表达沉默, 使肿瘤细胞可以逃逸化疗药物引起的凋亡反应从而获得生存。肿瘤细胞内凋亡信号通路上相关基因的甲基化异常可引起凋亡反应能力的改变, 治疗前及治疗过程中监测这些基因的甲基化水平, 可为优化肿瘤患者化疗方案及预后评估提供重要依据。
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1.3药物转运及药物代谢基因的异常甲基化与肿
瘤耐药
ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)转运蛋白是ATP依赖性药物外排泵, 利用ATP作为能源跨膜转运许多物质, 如离子、氨基酸、蛋白质、糖类、磷脂和药物等, 其表达或功能异常是肿瘤细胞产生多药耐药的重要机制。目前已知人类基因组共包含48个具有转录活性的ABC转运子基因, 其中与多药耐药相关的主要有MDR1(ABCB1)、MRPs(ABCC家族)、BCRP(ABCG2)等[20]。药物转运基因启动子的低甲基化可以促进这些基因的表达, 增强细胞泵出药物的能力, 降低肿瘤细胞内的药物浓度, 削弱药物的细胞毒性[20]。临床资料显示, 膀胱癌病人化疗后MDR1的表达比化疗前升高3.5~5.7倍, 89%的复发病人MDR1高表达, 且MDR1的表达水平与基因启动子甲基化水平呈显著负相关[21]。Kusaba等[22]用长春新碱和阿霉素处理鳞状细胞癌KB3-1诱导得到长春新碱耐药细胞KB/VJ300和阿霉素耐药细胞KB-C1, 发现与敏感细胞相比, 两株耐药细胞中MDR1基因启动子甲基化水平下降, 其表达显著升高。ABCG2是另一个与耐药有关的转运蛋白。ABCG2高甲基化的肿瘤细胞对其底物化疗药物如米托蒽醌、拓扑替康等敏感, 而ABCG2低甲基化的肿瘤细胞对这些化疗药耐受[23]。Bram等[24]发现用柳氮磺吡啶和拓扑替康处理白血病细胞和卵巢癌细胞12~24 h可诱导ABCG2基因启动子的完全去甲基化, 使ABCG2转录升高235倍从而获得ABCG2依赖性的耐药表型, 这表明化疗药处理后ABCG2的表观激活是肿瘤细胞耐药性产生的早期事件。其他一些研究也都发现类似结果[25], 即化疗药物处理可引起肿瘤细胞内ABC家族基因的启动子甲基化水平下降从而表达升高, 获得更强的药物泵出能力, 产生化疗耐药。
药物进入体内, 会经过一系列复杂的过程, 包括药物的吸收、分布、代谢、排泄等。多数药物经过代谢后药理作用减弱或消失, 少数药物经过代谢变为活性形式发挥治疗作用。药物代谢酶(Cytochrome P450 proteins, CYP)的表达紊乱或活性变化, 是引起肿瘤耐药的重要因素。长春碱类化疗药物经CYP3A4代谢后为无毒性形式, 在大肠癌细胞LS174T中诱导CYP3A4表达后, 可明显增强细胞对长春花碱的耐受性[26]。另外, CYP3A可以通过减弱紫杉醇的药理活性, 使大肠癌细胞耐受[27]。CYP基因在不同情况下(如肿瘤、吸烟等)甲基化水平会发生改变[28,29], 但耐药肿瘤细胞中CYP基因的异常表达是否由启动子甲基化改变所致, 则需要进一步的研究证实。
1.4 肿瘤干细胞标志基因的异常甲基化与肿瘤耐药
肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在一群比例很小但具有自我更新能力和无限增殖潜能的细胞, 即肿瘤干细胞, 它们不仅是肿瘤发生的始动细胞, 而且可能是导致肿瘤耐药的主要原因[30, 31]。已知干性因子OCT4、SOX2等在肿瘤干细胞形成和干性维持过程中发挥重要作用[32~35], 且这些基因的表达都受甲基化调控[36,37], 提示干细胞标志基因的甲基化水平改变可能会影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。Wang等[38]发现耐药的肝癌组织中OCT4转录水平明显升高; 在敏感细胞内过表达或在耐药细胞内干扰OCT4表达, 可相应增强或降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。进一步实验发现, 耐药肿瘤细胞内OCT4启动子甲基化水平下降导致了OCT4转录水平的升高。这些结果提示, DNA甲基化水平异常可能通过影响肿瘤干细胞形成或维持进而改变化疗敏感性。
总之, 细胞的多种生物学机制是否正常有效地发挥作用, 决定了细胞对外界环境包括药物的反应性。肿瘤细胞在其形成过程以及接受药物处理过程中发生的表观遗传学改变, 在很大程度上赋予部分肿瘤细胞特定的生存优势, 形成耐药表型。与肿瘤耐药相关的一些异常甲基化改变见表1。
2 全基因组甲基化水平异常与肿瘤耐药
耐药的肿瘤细胞内除了发生某些特定基因的甲基化水平异常, 同时还会发生全基因组甲基化水平的异常。Nyce等[42]选用多种化疗药物处理肺癌细胞HTB-54和横纹肌肉瘤细胞CCI-136, 发现依托泊苷、阿霉素、长春新碱、顺铂、5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤等可使HTB-54和CCI-136的全基因组甲基化水平明显升高。Kastl等[43]用多西紫杉醇诱导MDA- MB-231和MCF7细胞得到两株多西紫杉醇耐药细胞, 检测发现MCF7耐药细胞中全基因组甲基化水平升高, 而MDA-MB-231耐药细胞中略下降。
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(Beijing) 2014第36卷表1与肿瘤耐药相关的异常甲基化
功能基因耐药中的甲基化改变肿瘤类型
损伤修复hMLH1[5,6]升高卵巢癌BRCA1[14]下降卵巢癌FANCF[39]升高卵巢癌细胞
凋亡反应
APAF1[16,17]升高黑色素瘤细胞
CASP8[18]升高黑色素瘤细胞、脑胶质瘤细胞、白血病细胞等多种肿瘤细胞CASP8AP2[40]升高胃癌细胞、卵巢癌细胞等多种肿瘤细胞
DAPK[19]升高宫颈癌
FAS[19]升高宫颈癌
药物转运及药物代谢MDR1[21]下降膀胱癌
ABCG2[24]下降白血病细胞、卵巢癌细胞
肿瘤干细胞标志基因OCT4[38]下降肝癌细胞其他WTH3[41]升高乳腺癌细胞
Segura-Pacheco等[44]在MCF7的阿霉素耐药细胞中也检测到全基因组甲基化水平升高, 降低全基因组甲基化水平可部分恢复耐药细胞对阿霉素的敏感性。本实验室也观察到类似现象, 与敏感细胞相比, MDA-MB-231的紫杉醇耐药细胞中全基因组甲基化水平下降; 而在MCF7的紫杉醇耐药细胞中全基因组甲基化水平升高[45]。
化疗药物引起基因组DNA甲基化水平改变的机制尚不清楚。Nyce等[42]认为化疗药物会引起全基因组甲基化水平升高可能是因为这些药物能引起复制叉停滞, DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)与新合成的DNA作用时间延长, 更多的胞嘧啶发生甲基化, 其研究结果也证实了上述推测。
DNA甲基转移酶的表达改变也能直接影响全基因组甲基化水平。DNA甲基转移酶的表达受多种转录因子调控, 如雌激素受体(Estrogen receptor alpha, ERα)。Cui等[46]发现, ERα可增强DNMT3b基因的转录活性。用10-8M的雌激素处理子宫内膜癌细胞可上调DNMT3b的表达, 细胞的DNA从头甲基化能力增强; 用ERα抑制剂预处理, 可抑制雌激素引起的DNMT3b过表达, 表明雌激素激活DNMT3b是ERα依赖性的。本实验室研究结果发现, ERα可增强DNMT1基因启动子的活性[45]。ERα在很多耐药的肿瘤细胞中表达异常, ERα表达或活性的改变会引起其靶基因DNMT1和DNMT3b的表达异常, 进而影响全基因组甲基化水平。由此可以推测, 任意一种影响ERα的表达或活性的药物均可能影响细胞内全基因组甲基化水平, 进而影响细胞对药物的反应性。
全基因组甲基化水平的升高或下降都会影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。全基因组异常高甲基化对肿瘤耐药的作用机制目前还没有很好的阐述, 可能通过沉默特定基因进而干扰DNA损伤修复、细胞凋亡和细胞周期等关键信号通路促进肿瘤耐药。全基因组异常低甲基化可造成基因组不稳定[47~49], 促进耐药亚群细胞的产生, 作用机制尚不很清楚, 可能通过以下两方面：(1)激活反转座元件：分散在真核生物基因组中的大量逆转座子是引起基因组不稳定的重要因素, 可引起基因序列缺失、扩增、易位等[50~52]。LINE-1是一种自主性逆转座子, 在人类基因组中广泛分布, 能编码ORF1和ORF2两种蛋白, 其中ORF2具有核酸内切酶活性, 可以导致DNA双链断裂以及基因组不稳定。在大多数情况下, LINE-1启动子因高度甲基化而处于沉默状态, 但在某些特殊情况下LINE-1启动子可发生去甲基化而被激活;
(2)中心粒周围异染色质去凝集, 形成可以重组的染色质构象[53]：异染色质中的组蛋白去乙酰化和DNA高度甲基化使其处于高度压缩致密状态, 当基因组DNA去甲基化, 异染色质区结构松散, 基因组不稳定性升高[54,55]。目前认为全基因组异常低甲基化会促进基因组不稳定, 但有趣的是, 本课题组在全基因组甲基化升高的MCF7耐药细胞中也发现了拷贝数变异显著增加, 显示基因组不稳定性升高。显然, 全基因组甲基化水平应处在一个稳态范围内,
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过高或过低都将削弱基因组稳定性。
基因组不稳定性是一种以遗传改变频率升高为特点的细胞状态, 包括突变、重复或缺失、易位、异倍体等[56]。在许多肿瘤中, 如乳腺癌、大肠癌、肺癌, 基因组不稳定性与原发性耐药、获得性耐药以及肿瘤的不良预后相关[57~59]。肿瘤细胞的基因组不稳定有利于细胞在面对外界不利的生存压力时产生适应性改变从而存活, 并且这种改变是可以遗传的。恶性细胞的演化本质上都符合达尔文进化规律, 基因组不稳定性和肿瘤所处微环境的选择压力, 使肿瘤细胞处在不断的进化演变中[60]。基因组不稳定所产生的肿瘤异质性是肿瘤进化所需的原材料, 而选择压力则是加速这一过程的推动力。化疗药物的存在对肿瘤细胞群体是一种强烈的选择压力, 这种选择压力会加快进化速度, 将本来存在的适应性克隆筛选富集出来(原发性耐药), 或者诱导产生新的适应性改变(获得性耐药)。
全基因组DNA甲基化异常与特定基因甲基化异常在肿瘤耐药性形成过程中并不是相互排斥、相互独立, 而是相辅相成、相互影响。重复序列LINE-1约占人类基因组的20%[61], 其甲基化水平可在相当程度上代表全基因组甲基化水平[62,63]。LINE-1可位于基因间也可位于基因内, 据统计, 有超过2000个活性LINE-1位于基因内[64]。位于基因内部的LINE-1被认为是一种顺式调控元件, 其调节基因表达的主要机制之一是LINE-1自身表观修饰的改变[61]。位于基因启动子区的LINE-1甲基化水平的变化, 可影响基因启动子活性进而调节其表达。特定基因的甲基化异常是整体基因组甲基化水平异常的部分体现, 全基因组甲基化异常也会影响特定基因的甲基化水平。
肿瘤细胞中的DNA甲基化模式发生改变, 这些改变不仅在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用, 也是导致肿瘤耐药的重要因素。如, 错配修复基因hMLH1的异常高甲基化被认为在微卫星不稳定性结直肠癌的形成过程中发挥重要作用, 是其癌变过程中的早期事件[65]; hMLH1异常甲基化也是导致肿瘤耐药的重要因素, 错配修复系统失活使肿瘤细胞监测DNA损伤的能力下降, 不能激活凋亡反应, 对化疗药物耐受性增强[7, 66]。促凋亡基因APAF-1异常高甲基化所致细胞凋亡能力下降, 是促进肿瘤形成和肿瘤耐药的重要分子机制[17]。然而, 肿瘤发生过程中产生的DNA甲基化改变与耐药过程中发生的DNA甲基化改变不可能完全相同, 是由于这两种过程所涉及的细胞生物学改变和分子机制不尽相同, 导致其改变的表观遗传修饰必有差异。例如, BRCA1是一个具有多重功能的蛋白, 在DNA损伤修复、转录调控中的功能最为显著。BRCA1基因启动子的高甲基化导致其表达下降, 与乳腺癌和卵巢癌的发生密切相关[13,67], 而BRCA1基因启动子的低甲基化改变与肿瘤耐药密切相关, BRCA1甲基化程度越低, 表达越高, 细胞损伤修复能力越强, 对铂类化疗药物的耐受性越好[14]。因此鉴定肿瘤发生发展过程及肿瘤耐药过程中的DNA异常甲基化改变, 具有重要的理论意义和临床应用潜力。
3 对克服肿瘤耐药的提示
DNA甲基化是一种可逆的表观修饰, 认识和探讨DNA甲基化与肿瘤耐药的关系及机制, 为临床上控制肿瘤耐药提供了新的可能性。一种可能是利用一些靶向DNA甲基转移酶的小分子化合物调节甲基转移酶活性, 改变基因启动子的甲基化状态从而逆转耐药。例如：地西他滨是一种胞嘧啶脱氧核糖类似物, 能整合到DNA分子中, 与DNA甲基转移酶形成加合物抑制其活性。除了在临床骨髓增生异常综合征和白血病的治疗中取得了很好的疗效[68,69] , 地西他滨还可以降低hMLH1基因启动子甲基化水平, 恢复细胞错配修复功能, 从而逆转卵巢癌细胞A2780/cp70对DDP的耐药[5]。美国食品和药品管理局已于2007年批准地西他滨用于临床试验, 同期批准使用的还有维达扎, 一种胞嘧啶核糖类似物[70]。另一种控制肿瘤耐药的可能途径是抑制或降低DNA甲基转移酶的表达水平。已知DNA甲基转移酶的表达受多种转录因子调控, 如雌激素受体ERα可调节DNMT1和DNMT3b的转录水平[45, 46], 因此可利用ERα拮抗剂间接调控基因组DNA 甲基化水平, 如能特异性下调ERα表达的氟维司群[71]。关于ERα及其拮抗剂氟维司群在乳腺癌耐药中的作用已有一些研究, ERα与基因组甲基化改变及耐药的关系和机制值得进一步探讨。
通过靶向DNA甲基转移酶逆转肿瘤耐药因特异性差而受到很大局限性, 在用于临床治疗时会产
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生较大的毒副作用。因此寻找特异性改变DNA甲基化的方法显得尤为重要。最新研究发现, 某些长链非编码RNA能与DNMT1蛋白相互作用, 改变靶基因的DNA甲基化水平[72]。CEBPA基因可以转录一种不含polyA的额外编码的RNA(extra-coding CEBPA, ecCEBPA), 这种RNA在细胞核内富集, 不被翻译。当DNMT1靠近CEBPA基因启动子时, ecCEBPA能与DNMT1蛋白相互作用, 阻止DNMT1与启动子的结合, 防止CEBPA基因被甲基化, 上调其转录水平。这种相互作用不只局限于CEBPA基因, 在细胞内存在很多这种与DNMT1相互作用的不含polyA的RNA, 能调节特定基因的甲基化水平。暂不考虑ecRNA如何产生或用于临床治疗的可操作性如何, 它的出现意味着特异性改变靶基因的甲基化水平成为可能。
4结语与展望
DNA甲基化异常在肿瘤耐药性形成过程中发挥着重要作用。鉴于DNA甲基化可能影响不同的基因, 产生完全相反的效应, 因此, 利用DNA甲基化机制逆转肿瘤耐药面临着巨大挑战, 即确定具有生物标志物性质的甲基化模式。这意味着必须确定哪些或哪一组基因, 或什么程度的基因组甲基化改变是特定肿瘤细胞耐药的驱动力, 哪些甲基化变化仅仅是伴随出现的现象, 这将帮助确定哪些患者适合表观遗传治疗, 这一目标需要遗传学研究和临床医生的联手努力方可达成。
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(责任编委: 朱卫国)
DNA甲基化异常与肿瘤耐药
作者：司鑫鑫， 孙玉洁， Xinxin Si， Yujie Sun
作者单位：江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京医科大学基础医学院细胞生物学系，南京210029
刊名：
遗传
英文刊名：Hereditas
年，卷(期)：2014(5)
被引用次数：1次
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引证文献(1条)
1.杜雪飞,白云鹏,姜敏,王怡瑞,黄永清中国NSCL/P人群GWAS初筛的29个SNP在宁夏人群的验证[期刊论文]-宁夏医科大学学报 2015(8)引用本文格式：司鑫鑫.孙玉洁.Xinxin Si.Yujie Sun DNA甲基化异常与肿瘤耐药[期刊论文]-遗传 2014(5)
DNA甲基化和肿瘤的关系
DNA 甲基化与肿瘤 一、DNA甲基化与基因表达 5-甲基胞嘧啶是天然存在的修饰碱基，甲基化的 mCpG ，在DNA 双链中对称出现。哺乳类动物基因组约60 %的表达基因5′端启动子存在未被甲基化的CpG岛,而启动子区域外的CpG岛大都为 mCpG。正常情况下，非活化的X染色体、印迹基因等的启动子区域的CpG岛为甲基化状态，而看家基因的 CpG岛则是去甲基化状态。 DNA 甲基化状态与基因表达呈负相关。其调控作用主要在转录水平抑制基因表达。 DNA甲基化的检测方法 经过亚硫酸盐处理后的DNA中胞嘧啶（C）转变为胸腺嘧啶（T）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C 未转变为T，而无甲基化的CpG二核苷酸则发生这种转变，由此可以推断DNA是否发生甲基化。TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGG CCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTAT TGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAGTTATTTAG GAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAA GTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAA AGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTA GTATTTTGGGAGGTCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGG AGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAAT
DNA 甲基化抑制基因转录的分子机制 ①DNA 双螺旋结构的大沟为DNA 与多种转录因子的作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大沟，抑制转录因子的结合而抑制转录。②mCpG 激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、 Mi2等，通过阻遏蛋白因子的作用抑制转录。③DNA甲基化与组蛋白乙酰化的研究发现，组蛋白H3、H4 的赖氨酸去乙酰化后带负电荷,与带正电荷的DNA 结合更紧密,不利于转录过程中的聚合物解聚，从而抑制基因转录。甲基化的CpG 结合蛋白(MeCPs) 与DNA 的mCpG结合,并与组氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成复合物共同抑制转录。 二、DNA甲基化与肿瘤 以往的研究认为癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突变、缺失导致的DNA 序列改变。在肿瘤研究中，检测到许多肿瘤的重要基因并未发生突变、缺失，基因表达的异常主要通过DNA 甲基化实现。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态，可导致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿瘤细胞的一个重要特征。 DNA 甲基化状态的改变导致基因结构和功能的异常，与肿瘤发生的关系是近年来研究的热点。 DNA甲基化的异常与基因突变、缺失等基因组异常也有密切的关系
植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式
植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。基因间和基因内重组导致了变异，也导致了新特异性抗病基因的产生。另外，与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择。同样，类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化。随着抗病基因的进化，抗病反应也呈现出多样化，代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。 几种抗病基因进化模式得到提出。重复拷贝对创造新的抗病基因起着重要的作用。抗病基因的复制与随后序列的差异性能创造或扩大基因家族中另一基因簇。不对等重组与基因转化（基因内）创造了基因数量上的多样性。基因外重组与基因转化能创造新的特异性抗病基因。而有的这些重组事件发生在高保守区域上。LRR区域的多态性为识别、配位及防卫大量病原物提供了进化优势。转座元件插入到某些抗病基因座中造成基因断裂或染色体重排，加速了抗病基因的进化。基因座内的过多重组将导致抗病基因特异性丧失，而寄主植物与病原物不断相互作用——双方相互施加压力并不断适应与反适应于选择压力，进行着协同进化，那么抗病基因就必须维持着序列的特异性。实际上，抗病基因的进化是基因变异与基因序列保守性之间的平衡。在抗病基因不断进化的推动下，抗病基因控制下的抗病反应表现出多样化（如过敏性反应、非过敏性反应、系统过敏性反应以及极度抗病等），不同类型的抗病反应代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。有关与抗病基因的进化研究还存在一定困难，涂礼莉等人借助其他物种已获得的信息，利用生物信息学的方法来研究海岛棉抗病基因的抗病机制及抗病基因进化。这种研究方法可能也适用于其他农作物，可以说对抗病机制的研究、抗病基因的转育及抗病基因进化的研究具有重要的意义。 近年来抗性基因研究的突破性进展、抗性基因的克隆和序列分析所揭示的其编码蛋白的组 成、拓扑学和亚细胞定位等特征,为揭开抗性基因的作用特点提供了线索。一般来讲,基因克 隆的策略可分为两种:正向遗传学途径和反向遗传学途径。前者以欲克隆的基因所表现的功 能为基础,通过鉴定其产物或某种表型的突变进行,如功能克隆( Functional Cloning) 和表 型克隆( Phenotype Cloning) ;后者则着眼于基因本身特定序列或者在基因组中的特定位 置进行,如定位克隆( Positional Cloning) 和序列克隆( Sequence Cloning) 。
植物与病原菌互作和抗病性的分子机制
中国农业科学 1999,32(增刊):94～102 Scientia A gricultrua Sinica 植物与病原菌互作和抗病性的分子机制3 刘胜毅1 许泽永1 何礼远2 (1中国农业科学院油料作物研究所,武汉 430062;2中国农业科学院植物保护研究所) 提要 概述了近几年在寄主植物抗病基因与防卫反应基因、病原菌毒性基因、寄主抗病性机制和抗病基因工程策略等方面取得的主要进展,重点分析了抗病反应的一般过程、毒性基因 产物胞外水解酶和毒素的作用与关系、作物抗毒素基因工程策略。 关键词 植物;抗病基因;防卫基因;毒性基因;基因工程策略 早在40年代末50年代初,F lo r(1947;1955)在对亚麻和亚麻锈菌互作的遗传规律研究中,提出了基因对基因假说(gene2fo r2gene hypo thesis)〔4,5〕,这标志着对植物与病原菌互作的认识深入到了基因水平,从而为应用分子生物学手段研究植物抗病性奠定了基础。本文概要地综述近几年在寄主植物抗病基因、病原菌致病基因、寄主抗病机制等方面取得的主要进展,并试图侧重分析概括抗病反应的一般过程及毒素的作用与基因工程策略。 1 抗病相关基因 根据基因的作用性质,可把抗病反应过程中起作用的基因分为两类:抗病基因和防卫反应基因。抗病基因是决定寄主植物对病原菌的专化性识别,并激发抗病反应的基因。即按F lo r的基因对基因理论,它与病原菌的无毒基因互补;按Keen(1990)提出的用来解释基因对基因理论分子机制的配体2受体模型〔6〕,它的产物是抗病反应信号传导链的起始组分,即信息链的前端,当它与病原菌的无毒基因直接或间接编码产物互补结合后,启动信号传导激发植物的抗病反应。防卫反应基因是一类在抗病机制中最终起作用的基因,它们的编码产物直接或间接地作用于病原。除此之外,抗病基因和防卫反应基因的区别还有:(1)抗病基因编码产物具有特异性,而防卫反应基因编码产物具有普遍性,即不同的寄主植物中有一套类似的防卫反应基因,如植保素合成链中的酶基因、病程相关(PR)蛋白基因、植物细胞壁成分合成酶基因等。(2)抗病基因产物是植物防卫反应基因表达的直接或间接调节因子。防卫反应基因一般是受病原菌诱导表达的,编码产物比较容易分离的一类基因,而抗病基因是组成型表达的,编码产物不容易分离的一类基因。因此在基因克隆、基因编码产物的结构和功能分析等方面的研究工作中,防卫反应基因均早于抗病基因。所以植物防卫基因既有普遍性,又有特殊性。除有一部分是相似的外,还有一部分是不同的,如对真菌、细菌毒素的解毒基因,因毒素不同而不同。而人工赋予植物的解毒基因则可能更加不同,有动物源的,也有微生物源的。 1.1 抗病基因 接收病原菌信号,启动植物抗病反应信号转导的是植物抗病基因的编码产物,这是分子植物病理学研究寄主植物的重点和难点。自1992年应用转座子标签法分离出第一个抗病基 收稿日期 1999207215
DNA甲基化
DNA甲基化概述 在哺乳动物基因组中，甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达。在发育过程中，DNA甲基化的模式在基因组中发生变化，这是DNA从头甲基化和去甲基化的动态过程的结果。 DNA甲基化是被一个甲基转移酶家族所催化，转移S腺苷甲硫氨酸(SAM)的一个甲基到第五个碳胞嘧啶残基形成5mc , Dnmt3a和Dnmt3b可以建立一个新的DNA甲基化模式来去修饰DNA，被称为从头甲基化。另一方面，Dnmt1在DNA复制过程中起作用，将亲代DNA链上的甲基化模式复制到新合成的子链上。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。当细胞到达终末分化时，Dnmt的表达大大降低。这似乎表明有丝分裂后细胞的DNA甲基化模式是稳定的。 大部分DNA的甲基化发生在鸟嘌呤核苷酸或CpG位点之前的胞嘧啶上。总的来说，哺乳动物基因组中CpG位点的减少可能是由于5 - mc可脱氨成胸腺嘧啶的诱变潜力。剩余的CpG位点分布在整个基因组中，除了CpG岛外，它们都被严重甲基化。DNA甲基化对沉默逆转录病毒分子、调节组织特异性基因表达、基因印记和X染色体失活至关重要。不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。 一、DNA甲基化的位置 1.1 基因间区 大约45%的哺乳动物基因组由转座因子和病毒因子组成，这些因子被大量甲基化而沉默。这些元素中的绝大多数是通过DNA甲基化或随着时间的推移由于5mC的破坏而产生的突变而失活的。如果表达，这些元素是潜在的有害的，因为它们的复制和插入可以导致基因损坏和DNA突变。胞内颗粒(IAP)是小鼠基因组中最具侵袭性的逆转录病毒之一。在整个生命过程中，IAP在配子形成、发育和成年阶段都被高度甲基化。甚至在胚胎内部，当基因组其余部分相对低甲基化时，Dnmtl维持对IAP元件的抑制。当Dnmtl被基因突变耗尽，导致广泛的低甲基化时，IAP元素被表达。这表明，在基因间区，DNA甲基化的主要作用之一是抑制潜在有害基因元素的表达。 1.2 CpG岛 CpG岛是大约1000个碱基对长度的DNA延伸，它们的CpG密度比基因组的其他部分高，但通常不会甲基化。大多数基因启动子，大约70%，在CpG岛。特别是，管家基因的启动子常常嵌入到CpG岛。CpG岛，尤其是那些与启动子相关的基因在小鼠和人类之间高度保守。在整个进化过程中，CpG岛屿的位置和保存意味着这些区域具有重要的功能。 CpG岛通过调控染色质结构和转录因子的结合来促进基因表达。DNA有规律地包裹在组蛋白周围，形成被称为核小体的小段。DNA与组蛋白的联系越紧密，对基因表达的宽容程度就越低。CpG岛的一个共同特征是，它们比其他DNA片段包含更少的核团。与CpG 岛相关的少数核小体常含有组蛋白，其修饰涉及增强基因表达。尽管约50%的CpG岛包含已知的转录起始位点，但CpG岛往往缺乏常见的启动子元件，如TATA boxes 。由于许多转录因子结合位点富含GC, CpG岛可能会增强对转录起始位点的结合。CpG岛虽然缺乏共同的启动子元件，但却能增强DNA的可达性，促进转录因子的结合。 CpG岛的甲基化导致了稳定的基因表达沉默。在配子发生和胚胎早期发育期间，CpG 岛经历了差异甲基化。通过CpG岛调控基因表达的甲基化能力对建立很重要。印迹基因仅由两个遗传亲本染色体中的一个表达，它们的表达由遗传亲本决定。除了印迹基因外，CpG
植物抗病基因研究进展
植物抗病基因研究进展 摘要:植物抗病基因的研究是目前植物病理学科的热点及难点之一。近年来，通过基因工程技术培育抗病毒植物已经成为抵抗植物病毒的有效手段。本文简要讨论了近年来植物抗病毒基因工程的方法策略, 并对植物抗病基因工程的研究取得的成绩、存在的问题及展望进行了简介。 关键词植物病毒、抗病基因、基因工程、前景 一、植物抗病基因工程原理 植物抗病基因工程指的是用基因工程（遗传转化）的手段提高植物的抗病能力，以此获得转基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括：抗病及其他相关基因的分离和克隆、与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒、用不同的转化方法向受体植物导入重组质粒、筛选转化因子并鉴定转基因植株。此外，还有一种可以获得抗病转基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA 直接导入受体植物，从后代中筛选具有抗病能力的个体，经过稳定转化得到转基因抗病植株。 植物病毒每年给世界各地的农作物生产造成严重损失，每年全世界的农作物因病毒侵害的损失数百亿美元，传统的防治方法已远远无法满足现代农业的生产要求。病毒侵染之所以复杂，在于一方面病毒的高突变率所致的植物抗病品种抗性丧失速度远高于常规植物抗病育种速度；另一方面病毒在隐症野生植物中的储存；第三，无亲缘关系的病毒复合侵染以及病毒侵染的持久性，特别是以线虫和真菌传播的植物病毒能在土壤中存活许多年。因此，在适宜病毒介体生长的温度条件下，大面积连作缺乏抗病基因的植物，造成的经济损失会更高。Hamilton[1]于 20 世纪 80 年代初首先提出了基因工程保护的设想，在转基因植物中表达病毒基因组序列可能是防御病毒侵染的途径之一。近 20 多年来，基因工程的发展，为防治病毒病开辟了新途径。 二、利用非病毒来源的基因策略 1.植物自身基因介导的病毒抗性 一些植物在病毒侵染的时会启动主动防御机制，最普遍最常见的主动防御机制就是通常所说的过敏反应，也就是那些最初被病原侵染点周围的细胞发生程序性死亡最终在病原最初侵染点周围形成坏死斑。如番茄中的 Tm-1 或 Tm-2 和Tm-22基因，马铃薯的 Rx，Ry，烟草中的 N 基因等等[2]。这类基因通常称为 R 基因。根据其抗性水平的不同还分为：真实免疫指病毒复制完全不能发生、阈下侵染指病毒的复制仅局限于受侵染的细胞。不管 R 基因是在模式植物还是在
植物抗病、抗虫及抗除草剂基因与基因工程
植物抗病、抗虫及抗除草剂基因与基因工程 张永强 （西南大学植物保护学院， 重庆 400716） 摘 要：病虫草害历来是植物保护工作的重中之重，农药为病虫草害防治立下了汗马功劳。近来由于大量使用、滥用农药给环境带来了巨大的负面影响。20世纪70年代兴起的基因工程为这一问题的解决带来了新的途径。本文就植物抗病基因分类、最新报道的相关基因；抗虫基因的来源、最新报道的抗虫基因及试验结果；抗除草剂基因以及基因工程技术在现代农业中的应用予以综述。 关键词：植物抗病；植物抗虫；抗除草剂；基因工程 农药伴随人类改造自然，征服自然已经有100多年的历史，在促进农业发展和对人类发展做出卓越贡献的同时，也不可避免的带来许多负面影响，如：对非靶标生物的毒害、对环境的污染、对生态系统的破坏以及病虫草抗药性的产生等。特别是化学农药对动物和人类健康的影响，已经成为全人类普遍关心和急需解决的全球性问题。诞生在20世纪70年代的基因工程技术为这些问题的解决提供了一条新的途径。进入20世纪90年代具有实用价值的转基因生物品种因其诸多的优势，逐渐被人们所接受，而迅速走向商品化和产业化。 1 植物抗病基因与基因工程 植物受病原菌侵染时，会诱导相关的基因产生一系列参与植物防御反应的拮抗物质，阻止病害的传播和病原菌的进一步侵入。将这些参与植物防御反应的相关基因导入植物，使其在植物体内表达，可以提高植物的抗病能力。植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。基因间和基因内重组导致了变异，也导致了新特异性抗病基因的产生；另外，与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择；同样，类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化（庄军等，2004）。 1.1 植物抗病基因的分类 植物中许多抗病基因已被克隆，根据抗病蛋白（R蛋白）将抗病基因（R基因）分为以下几类。第一类，玉米抗圆斑病的基因Hml，其编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的HC 毒素，代表着抗病基因中与病原物亲和性因子作用的一类基因。 第二类，番茄抗细菌叶斑病的基因pto，其编码蛋白Pto是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。AvrPto 蛋白是病原菌假单胞杆菌Pseudomonas进入植物细胞中通过Ⅲ型分泌系统分泌的，现已证实Pto激酶噜噗结构域中204位苏氨酸决定着Pto对AvrPto的特异性识别。具有自动磷酸化能力的Pto激酶与AvrPto相互作用从而产生了过敏性反应。 第三类抗病基因所编码的蛋白显示出与细胞间信号转导蛋白具有结构相似性。这些蛋白所共有的基元是富含亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeat，LRR），一般由24个氨基酸残基组成，其共同蛋白序列是LXXLXXLXXLXLXXNXLSGXIPXX（氨基酸的单字符号，X代表任何一种氨基酸）。这一类型基因的共同结构是LRR-TM，它们编码的蛋白包括胞外N端LRR 重复区、膜锚定蛋白和胞质内C末端部分（如图1所示）。 第四类是水稻抗白叶枯病Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo的基因xa27。这一基因所编码的Xa21蛋白具有3个受体激酶特征的主要结构域：胞外LRRs结构、跨膜结构域及胞内激
DNA甲基化的总结
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下,将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域,在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系,例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女性侵袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默,基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8],都会导致细胞癌变。 甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一。由于宿主细胞基因组DNA中不 同位点的甲基化程度存在某种平衡，并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征，破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号，使新整合的DNA 序列发生不同程度的甲基化，甲基化基因序列则通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MeCP2)的结合而抑制转录的顺利进行Ⅲo。在拟南芥中发现了DNA甲基化可以导致基因沉默汹埘]。在基因沉默过程中，外源或内源性信号引起部分DNA序列中CpG的甲基化，甲基化CpG结合域蛋白2(MeCP2)结合到甲基化的胞嘧啶上聚集HDACs使组蛋白去乙酰化，该蛋白与去乙酰化的组蛋白通过聚集更多的DNA 甲基转移酶来加强沉默信号，从而引起基因沉默H?。 ?。DNA甲基化对染色质结构和基因表达的作用很可能是通过一组蛋白介导的，这些蛋白可能含有共同的高度保守的甲基化的CpG结合结构域(MBD)L45 J。DNA甲基化在基因印记、x染色体失活、某些疾病的发生发展中发挥重要作用。其直接作用机制可能是CpG岛甲基化干扰了一些转录因子(transcription factor，TF)与基因调控区的结合，使甲基从DNA分子大沟中突出，从而阻止转录 因子与基因相互作用。间接机制可能是由于甲基化DNA与甲基化DNA结合蛋白结合或DNA甲基化改变染色质结构，这2种情况都间接阻碍TF与DNA结合从而抑制转录m1。DNA甲基化一般是通过转录抑制机制来调节特定基因的，具体的机制可能有：5一MeC伸入DNA双螺旋大沟，影响转录因子的结合；序列特异的甲基化DNA结合蛋白(MDBP一1，MDBP一2)与甲基化的启动子序列特异性结合而抑制转录因子与靶序列的结合；甲基化CpG结合蛋白(MeCPl，MeCP2)与甲基化的二核苷酸CpG结合，发挥类似转录抑制蛋白的作用H“。一般DNA甲基化会通过干扰转录因子与识别位点结合和招募组蛋白乙酰转移酶(histon acefltransfeI"SeS，HATs)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)形成辅助阻遏复合体，使基因沉默而抑制其表达，而去甲基化则使沉默的基因重新激活Ⅲ卜 ＤＮＡ甲基化尤其是基因启动子区ＣｐＧ岛的高甲基化，会导致基因表达的下降或沉默。甲基化抑制基因的表达目前认为要有两个方面，一方面甲基化引起的基因结构改变可直接阻碍一些转录因子与其结合位的结合；另一方面可能与一些甲基化
DNA甲基化研究综述
DNA甲基化研究综述 The summarize of the research on DNA methylation 郭文媛 （生物技术 1353227） 摘要：DNA 甲基化是真核生物表观遗传学中一种重要的基因表达调控方式，是一种酶催化的修饰过程。其是在DNA 甲基转移酶催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶的5 位碳原子上，使之转变成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。在人类和其他哺乳动物中，此修饰过程通常发生在5'-CpG-'二核苷酸的胞嘧啶上。大量相关研究表明，DNA 甲基化与人类疾病密切相关。 Abstract:DNA methylation is an important epigenetic regulation of gene expression in eukaryotes．It is a kind of enzyme catalysis modification process: refers to the chemical modification process of DNA methyltransferase catalysis，the transfer of methyl groups onto cytosine carbon atom 5，making them into 5-methyl cytosine．In humans and other mammals，the modification process usually occurs in 5＇CpG -＇dinucleotide cytosine．A large number of relevant studies have shown that DNA methylation is closely related to human diseases． 关键词: DNA 甲基化; 甲基转移酶;表观遗传学; CpG 岛; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b; 基因沉默; DNA甲基化结合蛋白; 人类表观基因组计划 Key words:DNA methylation; Methyltransferase; Epigenetics; CpG island; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b ; Gene Silencing ;MBD; human epigenomeproject 表观遗传学研究的是不改变DNA 的一级结构而改变表型的一种基因表达调控机制，主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色体重构、RNA 干扰等。 DNA甲基化是重要的表观遗传修饰之一，在大多数真核生物中广泛存在。DNA 甲基化水平受到环境、疾病、年龄和性别等因素的影响，处于动态的变化过程中。不同的细胞、组织或个体之间，甚至同一细胞或个体的不同发育时期，其DNA 甲基化状态和程度都可能存有差异。 2003 年10 月，人类表观基因组计划委员会正式宣布投资和启动人类表观基因组计划( human epigenomeproject，HEP) 。HEP 的主要目标是研究人类所有基因在主要组织以及200 多种细胞中正常和疾病状态下的甲基化模式，并在基因组水平绘制不同组织正常和疾病状态时的甲基化变异位点图谱[4]，本文结合2013年至今DNA甲基化研究文献，综述了DNA甲基化分布特点和与疾病关系等方面的研究情况。 1.DNA甲基化 1.1DNA甲基化与DNA去甲基化 DNA 甲基化是表观遗传( Epigenetic) 的一种重要表现方式，指在DNA 甲基转移酶( DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s －腺苷甲硫氨酸( SAM) 为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。 DNA 去甲基化也被称为DNA 甲基化丢失(lossof DNA methylation), 即甲基基团从胞嘧 啶上消失的过程。包含主动去甲基化与被动去甲基化2 种模式。 1.2DNA甲基化分布 DNA 甲基化在生物体内的分布并不是随机的，而是呈现一定的规律性。
植物抗病基因研究进展
植物抗病基因研究进展 摘要：植物抗病基因在植物抗病过程中起重要作用。综述了植物抗病基因的克隆方法，结构特点，作用机制以及未来的发展前景。 关键词：R-基因；克隆方法；结构特点；作用机制 Advance on Plant Resistance Gene Research Abstract：R gene played an important role in defending the disease. This paper reviewed the gene cloning，structure characteristic，function mechanism and the foreground of R gene. Key words：R gene，gene cloning，structure characteristic，function mechanism R基因在植物的病害防御过程中起着非常重要的作用。植物时刻受到周围各种潜在病原菌的侵染。一旦病原菌侵入植物表皮，将遇到R基因和avr基因的互作，即植物的非寄主抗病性[1]。随之所产生的现象包括局部细胞坏死(过敏性细胞死亡)，木质素和胼胝质形成，以及所有与抑制病原菌生长和病害发生相关的抗菌物质产生。病原菌还有可能通过不同的途径赋予植物长期的系统抗性诱导系统免疫，使植物能抵抗其他相似病原菌的侵染[2]。随着分子生物学的发展，更多的植物抗病基因克隆方法及作用机制逐渐为人们所发现，也有更多的植物抗病基因的功能得到了证实。 1 R基因的克隆方法 1) 表型基因克隆法：利用表现型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。表型克隆在策略上试图将表型基因与结构基因表达的特征联系起来，从而分离特定的与表型相关的基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就能直接分离该基因。 2) 转座子标签技术：转座子标签技术是比较经典的方法，是将转座子或T-DNA插入到欲分离基因的内部，基因发生突变而被标识，然后利用插入2个和小麦(Triticum aestivum)1 个(表1)[5]。 尽管R基因之间的序列同源性很低，但是这些R基因编码的蛋白也具有一些相似的结构特征，根据这些结构特征，已经克隆的R基因可以分为5个大类：
DNA甲基化详解
提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA 和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC 区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为
植物基因工程
一从现代农业到基因工程 (一)粮食安全现状 1、食物总量供给已成为全球的焦点之一： 从2000年开始，全球出现了当年粮食生产量比消费量低的情况，2003年全世界粮食的消费量超过生产量0.93亿吨，世界粮食储备也降低到30年来的最低水平。 1999年以来，我国粮食连续四年减产。1999-2002年，我国粮食总产量累计减少800亿公斤左右。自2000年以来，我国粮食年消费需求大致在4.8-4.9亿吨之间，产需缺口约400亿公斤。 (二)农业发展的一个主要矛盾——科技支撑能力不强 农业生产的规模化、专业化和多样化对科技提出了更高的要求，大幅度提高农业劳动生产率需要通过先进适用技术的广泛应用，而目前我国科技进步贡献率只有45%左右，与发达国家的70-80%有很大的差距。 一个农业劳动力养活的人口数： 美国：70人； 日本：约25人； 中国：4-5人。 农业发展的根本出路是现代农业，而其核心支撑条件是现代农业科技的进步。 (三)现代农业的内涵 现代农业是以现代工业和科学技术为基础，重视加强农业基础设施建设，充分汲取中国传统农业的精华，根据国内外市场需要和WTO规则，建立起采用现代科学技术、运用现代工业装备、推行现代管理理念和方法的农业综合体系(引自卢良恕院士)。 (四)建设农业科技创新体系是现代农业的一个根本任务 国家级农业科研工作应具有较强的关键性、全局性、基础性、战略性和前瞻性的特点，为加快现代农业建设提供科技支撑。省级有关农业的科研机构应逐步实行联合，重点开展应用研究和开发研究(也可根据需要适当开展应用基础研究)，重视科技成果转化，更好地为发展生产服务(引自卢良恕院士)。 到2030年，我国人口的持续增长将要达到高峰期，预计达到16亿人口，解决这个庞大人口的口粮是一个新的挑战。 随着人民生活水平的提高，肉蛋奶和水产品的消费不断增加，粮食作为饲料的比重将越来越大，人均粮食占有量的标准应有所提高。 2、食品安全性也成为全球的焦点之一： 农业综合措施、现代农业技术尤其是转基因技术的应用，使老百姓对当前食品尤其是转基因食品安全性问题十分关心。 (五)农业科技创新的一个核心内容：良种创新 农业科技创新的核心：良种+良法。良种对增产的作用所占的比重越来越大，良种是一个先进技术的集合体。 良种创新：植物良种创新、动物良种创新。植物食品占总食品的93%，动物食品占7%，但也间接来自植物食品，所以良种创新的首要任务是植物良种创新。 (六)传统育种面临的挑战 以杂交育种为核心的传统育种技术取得了丰硕的成果，目前仍然是主要作物的主要育种手段。目前传统育种技术在改良作物性状方面遇到了一些挑战，如缺乏特别性状的种质资源，育种周期长，难以克服不良性状的连锁或负相关，易受杂交不亲和及杂种不育的限制，远缘物种间不能进行遗物物质交流和性状转移。 (七)基因工程带来的机遇与竞争 20世纪50年代以来，DNA双螺旋模型和基因操纵子学说的提出，以及DNA限制性内切酶的发现，导致了DNA体外重组技术?a?a基因工程技术的发展，推动了分子生物学和基因工程本身在广度和深度方面以空前的速度蓬勃发展，生物技术相关产业和生命科学已经出现划时代的
DNA甲基化原理
DNA甲基化 甲基化检测服务-亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠发生脱氨基变为尿嘧啶的原理，用两一特异性引物扩增后测序。测序法克服了只能针对单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。 甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图 DNA甲基化（英语：DNA methylation） DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生於CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则於胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing）方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。
DNA甲基化综述
分子生物学综述 题目：DNA甲基化的研究方法与技术姓名： 班级： 学号：
摘要：DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 关键字：表观遗传学；DNA甲基化；甲基化研究方法 1 导言 早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R. Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识[1]，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用[2]。DNA甲基化的研究，逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。让我一一介绍现有的大部分DNA甲基化研究方法，并对其相关特性进行简要分析与总结。
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的 表达[3]。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体[4]。 1.2 DNA 甲基化的生物学作用 1.2.1 DNA 甲基化与遗传印记、胚胎发育 DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li 等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions,ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的[4]。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等[5]。
植物抗病基因工程研究进展
植物抗病基因工程研究进展 摘要随着植物抗病基因的分离，植物抗病机制的分子生物学和植物抗病基因工程取得了重大研究进展。该文就植物抗病基因工程的原理、目的基因、转化方法等进行综述，并对植物抗病基因工程的应用前景做了展望。 关键词植物；抗病基因；基因工程；原理；目的基因；转化方法；前景 随着世界人口的迅速增长，粮食问题已成为人类生存的关键问题。有专家预测，到2050 年，全球人口总数将膨胀至90 亿。剧增的人口将给为人类提供粮食的农业生产带来严峻的挑战。众多学者为提高作物产量作了许多努力，也取得了很大成果。但是，长期以来，因病菌侵染而造成的作物产量损失也是巨大的。当前，防治病害的主要策略是改进栽培措施和施用化学杀菌剂。但这只能从一定程度上控制病害的流行而不能从根本上解决问题，而且化学药剂所带来的环境污染和病原抗药性生理小种的形成等问题也给病害防治造成了更大的障碍。 自上世纪90 年代以来，分子生物学理论和技术的不断发展完善，使人们能够从分子水平上研究植物与病原菌的相互作用机制，植物基因工程的兴起更是为病害的控制提供了更广泛的选择余地。基因工程被认为是一项能为人类提供以食用动物为基础的健康和充足粮食途径的关键技术，在应用中扮演着重要角色。在植物抗病基因工程的研究历程中，以植物抗病毒基因工程开展最早，发展也最为迅速，部分转基因植株已开始用于生产。随着植物抗病反应机制和病原菌致病机理研究的深入，近年来植物抗病基因工程的研究取得了很大的进展。 1 植物抗病基因工程的原理 人们对植病互作机制的认识，主要来源于对模式植物拟南芥的研究。并且已经从拟南芥中鉴定和克隆了许多抗病基因，给其他作物的抗病性遗传分析提供了理论基础。 病原菌对宿主植物成功的感染，包括接触识别、崩解植物理化防御系统、产生毒素、灭活整个植株或部分组织的代谢生理活性。病原菌往往含有致病基因和毒性基因，其表达 调控包含有复杂的信号传导。 在经典遗传学中，植物与病原物的互作被看作是由基因型控制的，植物抗病性常常是由来源于植物的抗病基因R 与相应的来源于病原物的无毒基因avr 互相作用所决定的，即“基因对基因”学说。Flor通过亚麻与亚麻锈病菌之间的相互关系的研究，发现真菌的显性avr 基因的产物
DNA甲基化和去甲基化的研究现状及思考_邓大君
Hereditas (Beijing) 2014年5月, 36(5): 403―410 https://www.wendangku.net/doc/8213041804.html, 综 述 收稿日期: 2014-01-07; 修回日期: 2014-01-27 基金项目:国家自然科学基金项目(编号：30921140311，31261140372)资助 作者简介:邓大君，教授，研究方向：肿瘤病因学和DNA 甲基化研究。E-mail ：dengdajun@https://www.wendangku.net/doc/8213041804.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0403 网络出版时间: 2014-3-3 12:41:25 URL: https://www.wendangku.net/doc/8213041804.html,/kcms/detail/11.1913.R.20140303.1241.001.html DNA 甲基化和去甲基化的研究现状及思考 邓大君 北京大学肿瘤医院／研究所, 北京 100142 摘要: DNA 甲基化通过调节基因转录、印记、X 染色体灭活和防御外源性遗传物质入侵等, 在细胞分化、胚胎 发育、环境适应和疾病发生发展上发挥重要作用, 是当前表观遗传学研究的热点领域之一。文章介绍了在过去几年中TET 介导的DNA 羟甲基化及其在早期胚胎发育中的作用, DNA 主动去甲基化及其与被动去甲基化的关系, DNA 甲基化建立及其与组蛋白修饰、染色质构象、多梳蛋白和非编码RNA 结合等关系方面的重要研究进展和存在的问题以及DNA 甲基化的转化应用前景。 关键词: DNA 甲基化; 去甲基化; 表观遗传学; 稳态; 转化研究 DNA methylation and demethylation: current status and future per-spective Dajun Deng Peking University Cancer Hospital and Institute , Beijing 100142, China Abstract: DNA methylation plays important roles in cell differentiation, embryonic development, host adaptations to environmental factors, and pathogenesis through regulation of gene transcription and imprinting, X-inactivation, and de-fense of foreign genetic material invasion, is currently one of the hottest research fields on epigenetics. In the past few years, a number of important findings on DNA methylation have been achieved. These findings include discovery of TETs-catalyzed cytosine hydroxymethylation and its functions in the early embryonic development; the relationship be-tween active and passive DNA demethylation; establishment and maintenance of DNA methylation patterns and their asso-ciations with histone modifications, chromatin configuration, polycomb group proteins and non-coding RNA bindings. DNA methylation has become a new potential biomarker and therapy target. Keywords: DNA methylation; demethylation; epigenetics; homeostasis; translational research DNA 甲基化是指DNA 序列中的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)碱基在甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合, 可在细胞分裂过程中传递给子细胞的表 观遗传现象。由DNA 腺嘌呤甲基化酶(DNA adenine methylase, DAM)催化形成的O 6-甲基腺嘌呤(6mA)是一种CTAG 序列复制后维持甲基化, 在细菌表观