细胞分离实验
视频3.2 研磨法分离小鼠脾脏单个核细胞
同学们好！
组织由细胞和细胞间质组成，利用研磨或酶解组织的方法可使其中细胞游离。研磨法主要用于结构相对疏松的脾脏、肝脏、垂体、胎盘等动物组织。研磨工具有注射器内芯、载玻片、盖玻片等，以注射器内芯最为常用。
实验原理：单个核细胞是指外周血和免疫器官中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞和淋巴细胞等密度相近的几种免疫细胞。脾脏是重要的外周免疫器官，富含单个核细胞，同时含有大量红细胞。研磨脾脏可使其中细胞游离，裂解法除去红细胞后即可获得单个核细胞为主的细胞悬液。
实验材料及用品：6~8周龄健康小白鼠；超净工作台及配套用品（酒精灯、酒精棉球缸、试管架、火柴、记号笔、废物缸、废液缸等）；灭菌的2mL玻璃注射器内芯、200目细胞滤网、10mL聚丙烯离心管、眼科剪、尖头镊子、5mL
一次性注射器、一次性6cm平皿、一次性9cm平皿、1mL微量加样器、枪头、一次性吸管、EP管、D-Hanks液、0.83%的氯化铵溶液；10mL低速离心机；托盘天平；40mL小烧杯；水浴锅；不锈钢棉球缸；75%酒精；0.4%台盼蓝生理盐水染液。
实验操作环节主要有：小鼠处死——小鼠消毒——剖取脾脏——研磨游离脾脏细胞——离心收集脾脏细胞——裂解红细胞——收集单个核细胞——台盼蓝
染色——镜检细胞活率
具体操作步骤如下：
1、小鼠处死：用脱颈法处死小鼠。
2、小鼠消毒：将小鼠放入不锈钢棉球缸中，向其中加入75%酒精至覆盖小
鼠，消毒3~5min。
3、剖取脾脏：将装有小鼠的不锈钢棉球缸用酒精棉球擦拭消毒后转入超净
工作台；吸取5mL D-Hanks液，注入6cm平皿中；再吸取5mL D-Hanks
液，放置备用；取出已消毒的眼科剪和镊子，将小鼠转入9cm平皿中，
使其腹部朝上；沿腹中线剪开小鼠腹部皮肤和腹膜；用手将腹部皮肤和
腹膜向左右两侧拉开，使腹部内脏暴露；将小鼠腹部左侧肠道向右上方
向翻开，暴露暗红色长条状脾脏；剪开与脾脏连接的组织，将脾脏放入D-Hanks液。
4、研磨游离脾脏细胞：取出200目钢网，滤网一侧在上放入9cm平皿内；
加盖；将脾脏放到200目钢网上，用眼科剪剪成大小约1mm3的小块；
取出2mL已消毒玻璃注射器内芯，逐块轻轻按压研磨，游离其中细胞，用D-Hanks液将细胞冲至滤网下。
5、离心收集脾脏细胞：拿走滤网；将细胞过滤液转入离心管，加盖；拿出
超净台；平衡；1500r/min离心5min，使细胞沉淀；吸弃上清。
6、裂解红细胞：向细胞沉淀加入5mL 0.83%的氯化铵溶液；轻轻吹打混匀；
加盖后拿出超净工作台，放入37℃水浴锅中；静置10min，使红细胞溶解。
7、离心收集单个核细胞：平衡离心管；1500r/min离心5min，使单个核细胞
沉淀；吸弃上清；用2mL D-Hanks液重悬细胞。
8、台盼蓝染色：吸取2滴细胞悬液加入EP管，将EP管转出超净台，再向
其中加入2滴台盼蓝染液，染色3min。
9、镜检细胞活率：制备细胞装片，显微观察。
注意事项
1、防止微生物污染。凡与组织和细胞接触的用品和溶液均应预先灭菌，
操作过程严格避免微生物污染。
2、不可研磨过度。避免用力过大或在同一位置反复研磨；研磨下来的
细胞要及时用D-Hanks冲下。
3、台盼蓝染色时间不可太长。否则，因染料毒性引起活细胞破坏而着
色。
视频3.3 酶解法制备植物原生质体
同学们好！
植物原生质体是指脱去细胞壁只留细胞膜包裹的细胞。因其无细胞壁障碍，是进行细胞工程遗传操作和植物育种的良好材料。
实验原理：植物细胞壁的主要成分为纤维素，细胞间质则主要为果胶质。因此，用含有相关酶的复合酶液处理植物组织，可破坏植物细胞之间的果胶质使细胞从组织中游离，并破坏细胞壁使原生质体得以释放。因游离原生质体和其他组织成分存在密度差异，可利用蔗糖等密度介质对其进一步纯化。
实验材料和用品：新鲜青菜或水培一周的绿豆幼苗；9cm平皿；镊子；解剖刀； 10mL刻度离心管；载玻片；托盘天平；40mL小烧杯；吸管；200目细胞过滤器；1mL枪及枪头；70%乙醇；3%次氯酸钠；复合酶液；原生质体洗液；原生质体漂浮液；10μg/mL荧光素二醋酸酯（FDA）（棕色瓶）；恒温摇床；离心机。
实验操作环节：取材——材料消毒——材料分割——酶解——收集细胞——漂浮法纯化原生质体——洗涤原生质体——制片检查纯化效果——FDA染色
检测原生质体活力
具体操作细节如下：
（1）取材：分别称取1g青菜叶柄、青菜叶和绿豆茎放入9cm平皿内，用酒精棉球消毒平皿外部后将其转入超净工作台。
（2）材料消毒：先放入75%酒精中消毒30秒；无菌水洗3次；再放入次氯酸钠溶液中消毒15min；无菌水洗3次。
（3）材料分割：将材料转入预先放有消毒载玻片的灭菌9cm平皿中，用消毒解剖刀将材料划切成0.5~1mm宽的细条。
（4）酶解：取出载玻片，加入20~25mL复合酶液覆盖材料；将平皿转入恒温摇床；设定摇床温度为25℃、转速为60r/min；启动酶解。
（5）检查酶解效果：酶解2 h后，每隔1h将平皿移入超净台，用吸管反复吹打酶解液使细胞脱落；制备装片显微观察酶解效果，可看到大量带有细胞壁、形态不规则的完整细胞和一些无细胞壁、基本呈圆球形的原生质体；至有较多原生质体游离出来，并随酶解时间延长不再明显增加时，终止酶解。
（6）收集细胞：将细胞过滤器放入灭菌一次性9cm平皿中；过滤酶解液去
除组织残渣；将酶解液转入离心管；1000r/min离心5min使细胞沉淀。
（7）漂浮法纯化原生质体：吸弃上清；加入3mL原生质体洗液，吹打混匀；另取一支消毒离心管，向其中加入2mL原生质体漂浮液；用吸管将细胞悬液沿管壁叠加在原生质体漂浮液上；1000r/min离心5min；可看到在两液中间出现原生质体带。
（8）洗涤原生质体：将两液中间的原生质体小心转入另一支消毒离心管；向其中加入5mL原生质体洗液，充分混匀；1000r/min离心5min，使原生质体沉淀；倒掉上清；另加1mL原生质体洗液重悬。
（9）制片检查纯化效果：制备装片，显微观察。
（10）FDA染色检测原生质体活力：取EP管，在其中混合100μL原生质体悬液和等体积10μg/mL FDA染液，避光染色10min；制备装片，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察；分别拍摄白光和荧光下原生质体并计数，计算发荧光的原生质体百分率。
注意事项
（1）酶解时间要合适。过短，影响原生质体获取量；过长，引起原生质体破坏。
（2）原生质体漂浮液的密度要适合。通过调整蔗糖浓度，使其既能有效漂浮原生质体，又不会导致太多其他组织成分漂浮混杂。
（3）FDA为荧光染料，要避光保存和避光染色。
视频3.4 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
同学们好！
密度梯度离心法是一种借助密度梯度介质分离不同密度细胞的方法。该法操作简单、成本低，广泛用于对纯度要求不高的细胞分离。最常用于从外周血和脾脏、骨髓等免疫器官组织中分离单个核细胞。
实验原理：外周血中含有密度不同的各种血细胞，其中，红细胞密度最大，粒细胞次之，单核细胞、淋巴细胞等再次，血小板最小。其中，单核细胞及与其密度相近的淋巴细胞、NK细胞等统称为外周血单个核细胞。依据这种密度差异，选择密度比单个核细胞稍大、又比红细胞和粒细胞密度小的淋巴细胞分离液，利用适当的离心方法即可从中分离单个核细胞。
实验材料和用品：肝素抗凝血；普通光学显微镜；10mL低速离心机；托盘天平；10mL聚丙烯离心管；1mL微量加样器；1mL枪头；试管架；40mL小烧杯；胶头吸管；D-Hanks液；淋巴细胞分离液。
实验操作环节主要有：稀释血液——加样——平衡离心——收集单个核细胞——制备装片——显微观察分离效果
操作细节如下：
1、稀释血液：在一支聚丙烯离心管内，混合1mL血液和等体积D-Hanks液。
2、加样：取一支空的聚丙烯离心管，先向其中加入2mL淋巴细胞分离液；再
用吸管吸取稀释血液，沿管壁缓慢加在淋巴细胞分离液上，形成分层。
3、平衡离心：将两只40mL烧杯放到托盘天平上，拨动游码调平；取一支空
离心管，向其中加入4mL水；将分别装有分层液和水的两支离心管放入天平两侧的烧杯中；取2支离心套管，放入两侧烧杯；给轻的一侧套管中加水，使天平平衡；将两侧离心管插入同侧套管；清空离心机中多余套管；
将平衡好的离心管连同套管放入离心机中对角线的位置；设置离心机转速为2000r/min 、离心时间为20min；启动离心。
4、收集单个核细胞：对光观察离心管，可看到两液交界处有白色不溶物，即
为单个核细胞聚集物；用吸管吸取白色不溶物，转入一支空的聚丙烯离心管中；加入5mL D-Hanks液，用吸管反复吹打，使充分混匀；用托盘天平平衡离心管，1500 r/min离心10min沉淀细胞；吸弃上清，另加1mL D-Hanks 液，吹打重悬细胞。
5、制备装片。
6、显微观察分离效果。
注意事项
1、血液样品要新鲜。
2、最好用防粘附的聚丙烯试管，减少单个核细胞损失；如用普通试管，尽
可能缩短操作时间。
3、吸取单个核细胞时尽量少吸取白色沉淀层上下液体，避免过多混入其他
细胞。
4、如有条件，用水平离心机离心收集单个核细胞，可减少细胞在离心管壁
的沉积而导致细胞损失。
视频3.5 巧取小鼠腹腔巨噬细胞
同学们好！
小鼠腹腔巨噬细胞可用于细胞吞噬功能检测、酸性磷酸酶显示、细胞骨架的显示等实验。利用一定技巧，抽取腹腔液即可获得其中巨噬细胞。
实验原理：巨噬细胞天然存在于小鼠腹腔，用生理盐水冲洗腹腔后抽取腹腔液体，即可获取其中的巨噬细胞。
实验材料和用品：6-8周龄健康小白鼠；普通光学显微镜；10mL低速离心机；托盘天平；解剖盘；解剖剪；10mL聚丙烯离心管；40mL小烧杯；5mL一次性注射器；吸管；载玻片；盖玻片；0.9%氯化钠生理盐水。
实验操作环节：脱颈处死小鼠——向腹腔注射生理盐水——解剖暴露腹膜——抽取腹腔液——制备装片——显微观察。
操作细节如下：
1、脱颈处死小鼠。
2、向腹腔注射生理盐水：将小鼠腹部朝上放到解剖盘里；吸取2mL生理盐水；
提起小鼠腹中部的皮肤和腹膜；让针头从提起处扎进小鼠腹腔；缓缓推出生理盐水；轻揉小鼠腹部数次；静置3~5min。
3、解剖暴露腹膜：用镊子从下腹部腹中线处提起皮肤，使与腹膜分开；先在镊
子提起处将皮肤剪开一个小口，再向上、向下剪开整个腹部皮肤；用双手拇指和食指分别在腹中部捏住两侧皮肤，慢慢向两边撕开，使腹膜暴露。
4、抽取腹腔液：左手拇指和食指夹住小鼠一侧皮肤，中指由外向内挤压内脏，
在腹腔内形成空隙；将注射器针头插入空隙处，抽取腹腔液；拔下针头，将腹腔液注入离心管。
5、制备装片。
6、显微观察。
注意事项
尽量避免被小鼠咬伤或吸过小鼠腹腔液的针头扎伤；一旦被咬伤或扎伤，要到专门机构尽快注射狂犬疫苗或同时注射狂犬免疫球蛋白，不能超过24小时。
视频3.6 单个核细胞分离结果分析
同学们好！
我们在前面的视频中学习了“研磨法分离小鼠脾脏单个核细胞”和“密度梯度离心法分离外周血单个核细胞”的原理、操作等内容，本视频我们一并对两个实验结果加以分析。
首先，让我们先复习一下单个核细胞的概念及组成。
单个核细胞是指外周血和免疫器官中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞和淋巴细胞等密度相近的几种免疫细胞。其并非某种特定细胞类群。因此，观察单个核细胞形态和计算纯度时要综合考虑这几种细胞。
1、密度梯度离心法正常分离效果：纯度， 80%左右；回收率，60%左右。
图1中细胞纯度接近80%，算比较好的分离结果。
图2中单个核细胞比率很低，混有大量红细胞和血小板。
2、脾脏单个核细胞理想分离效果：活细胞比率﹥90%，如图3。
图4则死细胞偏多。
3、外周血单个核细胞分离纯度低的原因：吸取单个核细胞层时操作不当。（1）扰动了分层液，使沉于管底的红细胞上浮；（2）吸取上层含血小板液体太多。
4、外周血单个核细胞回收率低的原因
（1）血液在普通玻璃或塑料容器中放置时间过长，部分细胞因贴壁而损失。
（2）吸取单个核细胞不完全。
（3）离心收集单个核细胞时速度偏低、时间偏短。
（4）用普通低速离心机离心时，部分细胞沉于管壁而非管底，吸弃上清和重悬时易损失。
5、脾脏单个核细胞活率低的原因
（1）研磨力度过大。
（2）在同一位置反复研磨。
（3）没有及时用D-Hanks液将研磨游离的细胞冲入悬液。
6、改善外周血单个核细胞分离纯度的方法：吸取单个核细胞的吸管进入细胞悬液前先排出部分气体；缓慢进入单个核细胞层；小心吸取中间层细胞。
避免在液体中反复挤压吸管。
7、提高外周血单个核细胞回收率的措施
（1）血液一经采集尽快分离。
（2）用聚丙烯离心管代替普通离心管盛装血液和分离细胞。
（3）有条件时使用水平离心机。
（4）淋巴细胞分离液密度较大，如吸入较多，应适当调大离心速度并延长离心时间。
8、改善脾脏单个核细胞活率的方法
（1）组织块分割要小。
（2）采用逐块轻轻按压组织游离细胞的方式，而非来回反复研磨。
（3）预先吸好D-Hanks液，研磨前先润湿组织，研磨过程及时冲洗细胞。
总之，只要掌握方法，认真操作，就能够分离获得理想量和纯度的单个核细胞。
视频3.7 植物原生质体分离结果分析
同学们好！
我们在前面的视频中学习了“酶解法制备植物原生质体”的原理、方法等内容，本视频我们来分析其结果。
1、较为理想的分离结果
（1）酶解后游离原生质体较多且细胞结构完整。
（2）纯化后杂质较少。
（3）FDA染色细胞（活细胞）比例高。
2、分离效果差的几种情况
（1）游离原生质体太少。
（2）原生质体结构破坏。
（3）漂浮后杂质较多或与其他细胞同时沉到管底。
（4）FDA染色细胞的比例低或细胞染色浅。
3、原生质体太少的原因
（1）材料细胞壁难以降解。
（2）复合酶组成或浓度不合适。
（3）酶解时间太短。
4、原生质体结构破坏、FDA染色细胞比率低的原因
（1）材料不适合。如青菜叶酶解2h后即有大量原生质体破坏。
（2）酶解时间过长。绿豆茎酶解9h后，原生质体形态已不规则，细胞膜边界变模糊，细胞吸水胀大。
5、漂浮后杂质较多或与其他细胞同时沉到管底的原因
杂质过多：漂浮液密度偏大，致使有些本该沉淀的杂质细胞也被漂浮。
与其他细胞共沉淀的原因：漂浮液密度偏小；离心速度过大、离心时间过长。
质壁分离实验报告范文
质壁分离实验报告范文 一、实验原理 当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分子会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水;由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层伸缩性较大，从而使二者分开;反之，外界溶液浓度小于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质和壁又复原。 二、目的要求 1.初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法; 2.理解植物细胞发生质壁分离和复原的原理。 三、重点难点（实验报告不写这一点，可适当调整添加在“注意”这一部分） 1.初步掌握植物细胞质壁分离和复原的实验方法; 2.临时装片的制作; 3.低倍显微镜的使用。实验器材：紫色洋葱的鳞片叶、刀子、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸（滤纸代替，滤纸可分为剪开几条）、显微镜;质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液或质量分数为30%的蔗糖溶液、清水。 四、方法步骤 临时装片制作： 1选材：选用紫色特别深的洋葱外表皮;说明：在实验之前，最好将洋葱放在水中浸泡一下，可以使洋葱吸水多一些，而且代谢也比较旺盛，实验效果明显。
2：将洋葱的外层剥去两层（因为处于最外的可能已经死亡）。取表皮：在洋葱的外表皮上，用刀片划“井”字，用镊子轻轻撕取一小块;（关键：最好撕取单层细胞，如果撕的太厚，则会使细胞重叠，严重影响实验效果;）3制片：在载玻片中央滴上一滴清水，然后将取下的洋葱表皮放在水中，平展开来;加上盖玻片。（注意：1：洋葱表皮不能卷曲起来;2：不能带有气泡;3加盖玻片时，要从一侧大约45°角放下，在载玻片和盖玻片之间充满了清水，以便挤出空气。） 4盖玻片一端滴入糖水，于另一端用吸收纸重复几次吸引（可重复几次滴糖水和吸引的过程）。 质壁分离实验后可接着进行质壁复原 质壁复原实验 处理 取下临时装片，在一侧滴入清水，另一侧再用吸水纸重复几次吸引，以确保洋葱表皮细胞完全浸在几乎是清水中;（注：无吸水纸可先用滤纸代替） 观察 先在低倍镜找到一个质壁分离现象比较明显的细胞，然后观察，可见和刚才相反的现象，中央液泡渐渐变大，颜色变浅，最后原生质层又和细胞壁紧紧地贴在一起;若质壁分离没有复原，则证明外界溶液浓度过高，导致细胞死亡。三总结：细胞液浓度小于外界溶液浓度时，细胞通过渗透作用失水，发生质壁分离现象;细胞液浓度大于外界溶液浓度时，
实验一 植物细胞的质壁分离及死活鉴定
实验一植物细胞的质壁分离及死活鉴定 细胞是植物结构与功能的基本单位,而原生质则是细胞中有生命的部位。死、活细胞原生质的理化性质有显著差别，如果细胞原生质的膜系统有半透性，可与外界溶液构成渗透系统；活细胞可以主动积累某些溶质等等，而死细胞的原生质则丧失了这些特性。在植物生理研究中，经常需要鉴定细胞的死活。本实验练习两种鉴定方法：质壁分离法及活体染色法，同时还可以通过对质壁分离及活体染色结果的观察，了解原生物的某些特性，如黏滞性、荷电性等，以加深对有关理论的理解。 一、植物细胞的活体染色与死活鉴定 ［原理］活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色技术。中性红是常用的染料之一，它是一种弱碱性pH6.4～8.0之间（由红变黄），在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现桃红色。在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。 ［仪器与用具］显微镜1台；小培养皿一套；载玻片2片；盖玻片2片；单面刀片1片；尖头镊子1把；酒精灯1具；火柴1盒；擦镜纸、吸水纸适量。 ［试剂］ 0.03%中性红溶液；1mol/dm３硝酸钾溶液。 ［方法］ 1.选用洋葱鳞茎（或大葱假茎基部幼嫩部位）及小麦片作实验材料。 2．切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧纵横割划成0.5cm2的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内側向下）。若用小麦片为材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当刮到的只剩下少量叶肉细胞时要小心，用力太重容易损伤表皮细胞，甚至只剩下一层细胞壁，太轻又会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除了小麦外，其他禾本科植物均可用此法制备表皮细胞纸片。将刮好的纸片切成约0.5cm2的小块。
生物实验报告《观察植物细胞的质壁分离与复原》(完整版)
报告编号：YT-FS-8701-57 生物实验报告《观察植物细胞的质壁分离与复原》 (完整版) After Completing The T ask According To The Original Plan, A Report Will Be Formed T o Reflect The Basic Situation Encountered, Reveal The Existing Problems And Put Forward Future Ideas. 互惠互利共同繁荣 Mutual Benefit And Common Prosperity
生物实验报告《观察植物细胞的质壁分离与复原》(完整版) 备注：该报告书文本主要按照原定计划完成任务后形成报告，并反映遇到的基本情况、实际取得的成功和过程中取得的经验教训、揭露存在的问题以及提出今后设想。文档可根据实际情况进行修改和使用。 一、实验目的 1. 初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法。 2. 理解植物细胞发生渗透作用的原理。 二、实验原理 当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞液中的水分就透过原生质层进入外界溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁逐渐分离开，也就是分升了质壁分离当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，外界溶液中的水分就透过原生质层进入细胞液中，整个原生质层就会慢慢
地恢复成原来的状态，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 三、材料用具 紫色洋葱鳞片叶、显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、刀片、吸水纸、清水、0.3g/ml蔗糖溶液 四、实验过程（见书Ｐ60） 物理实验报告·化学实验报告·生物实验报告·实验报告格式·实验报告模板 五、讨论 1．如果将洋葱表皮细胞浸润在与细胞液浓度相同的蔗糖溶液中，这些表皮细胞会出现什么现象？ 2．当红细胞细胞膜两侧的溶液具有浓度差时，红细胞会不会发生质壁分离现象？为什么？ 3．画一个细胞在正常状态下到经过0.3g/ml蔗糖溶液处理，再经过清水处理的细胞变化的一系列模式图。 这里填写您企业或者单位的信息 Fill In The Information Of Your Enterprise Or Unit Here
细胞的质壁分离
观察植物细胞的质壁分离 一、实验目的： 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理： 1．质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。 2．质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 三、实验材料： 紫色洋葱鳞片叶的外表皮。（因为液泡呈紫色，易于观察。） 0.3g/ml的蔗糖溶液。（用蔗糖溶液做质壁分离剂对细胞无毒害作用。） 三、实验步骤： 步骤注意问题分析 1．制作洋葱表皮的临时装片。在载玻片上滴一滴水，撕取洋葱鳞片叶外表皮放在水滴中展平（也可挑取几条水绵放入水滴中）。盖上盖玻片。盖盖玻片应让盖玻片的一侧先触及载玻片，然后轻轻放平。防止装片产生气泡。 2. 观察洋葱（或水绵）细胞可看到：液泡大，呈紫色，原生质层紧贴着细胞壁。（或水绵细胞中有带状叶绿体，原生质层呈绿色，紧贴着细胞壁。液泡含花青素，所以液泡呈紫色。先观察正常细胞与后面的“质壁分离”起对照作用。 3. 观察质壁分离现象。从盖玻片的一侧滴入0．3g/ml的蔗糖溶液，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由大变小，颜色由浅变深，原生质层与细胞壁分离。原生质层与细胞壁之间充满蔗糖溶液。重复几次( 蔗糖溶液浓度大于细胞液浓度，细胞通过渗透作用失水，细胞壁伸缩性小原生质层的伸缩性大，液泡和原生质层不断收缩，所以发生质壁分离。) 为了使细胞完全浸入蔗糖溶液中。糖液浓度不能过高否则，细胞严重失水死亡，看不到质壁分离的复原。 4. 观察细胞质壁分离的复原现象。从盖玻片的一侧滴入清水，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由小变大，颜色由深变浅，原生质层恢复原状。(细胞液的浓度高于外界溶液，细胞通过渗透作用吸水，所以发生质壁分离复原现象。) 发生质壁分离的装片，不能久置，要马上滴加清水，使其复原。重复几次。( 因为细胞失水过久，也会死亡。为了使细胞完全浸入清水中。) 四、实验讨论答案： 1．如果将上述表皮细胞浸润在与细胞液浓度相同的蔗糖溶液中，这些表皮细胞会出现什么现象？ 答：表皮细胞维持原状，因为细胞液的浓度与外界溶液浓度相等。 2．当红细胞细胞膜两侧的溶液具有浓度差时，红细胞会不会发生质壁分离？为什么？ 答：不会。因为红细胞不具细胞壁。
T淋巴细胞提取
淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
观察植物细胞的质壁分离和复原
实验九观察成熟植物细胞的质壁分离和复原 实验原理： 当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水； 由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层性较大，从而使二者分开； 反之，外界溶液浓度大于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质和壁又复原。 目的要求： 1．初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法； 2．理解植物细胞发生质壁分离和复原的原理。 重点和难点： 1．初步掌握植物细胞质壁分离和复原的实验方法； 2．临时装片的制作； 3．高倍显微镜的使用。 实验器材： 紫色洋葱的鳞片叶、刀子、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜； 质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液、清水； 方法步骤： 一．临时装片制作： 1．选材： （1）选用紫色特别深的洋葱外表皮； 说明： A．在实验之前，最好将洋葱放在水中浸泡一下，可以使洋葱吸 水多一些，而且代谢也比较旺盛，实验效果明显。 B．将洋葱的外层剥去两层，因为处于最外的可能已经死亡； （2）取表皮： 在洋葱的外表皮上，用刀片划一些“井”字，用镊子轻轻撕取一小块； 关键： 最好撕取的是一层细胞，如果撕的太厚，则会使细胞重叠，严重影响 实验效果； 2．制片： 在载玻片中央滴上一滴清水，然后将取下的洋葱表皮放在水中，平展开来； 加上盖玻片。 二○○一年十月二十五日星期四第 1 页共4 页
二○○一年十月二十五日星期四 第 2 页 共 4 页 注意： A ． 洋葱表皮不能卷曲起来； B ． 不能带有气泡； C ． 加盖玻片时，要从一侧大约呈45°角放下，在载玻片和盖玻片之间 充满了清水，以便挤出空气。 二．观察： (一) 低倍镜观察： (二) 高倍镜观察： 在高倍镜下主要要注意以下几个结构： （1 ） 紫色的大液泡，几乎充满了整个细胞； （2） 注意观察原生质层和细胞壁紧紧地贴在一起。 （3） 找到细胞核，它是判断液泡膜还是细胞膜的关键。 (三) 质壁分离实验： 1．处理： 从载物台上取下装片，在盖玻片的一侧，滴入0.3g%mL 的蔗糖溶液，另一侧用吸水纸重复吸引几次。 实验成功关键之处： (1) 最好多重复几次，因为在洋葱表皮周围充满的是清水，如 果不多重复几次，洋葱表皮周围的蔗糖溶液浓度太低，质壁分离效果不明显。 (2) 所用的溶液特别要注意以下几点： A ． 不能是对植物细胞有伤害作用的物质，如强酸强 碱，因为它们会使细胞致死，而死亡的细胞内的膜便失去了选择透过性，而成了全透性； B ． 外界溶液中的物质必须是不可以被植物细胞吸收的物
植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤
植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤 （一）制作临时装片并观察 1、制片 ①、用拇指和食指夹住载玻片，然后取三层纱布沿一个方向擦拭载破片，直到对光看到载玻片光亮无污物为止。 ②、在载玻片上滴一滴水。（注意胶头滴管的正确使用方法：①握持方法是用中指和无名指夹住玻璃管部分以保持稳定，用拇指和食指挤压胶头以控制试剂的吸入或滴加量。 ②不能倒置，也不能平放于桌面上。③胶头滴管加液时，不能伸入容器） ③、 A 、洋葱：选用紫色特别深的洋葱外表皮，用刀片划“井”字，用镊子轻轻撕取中间的小正方形。（注意在洋葱未经过处理时一定要取外表皮）由于每种材料主要只在取材上有区别，其它步骤基本类似。下面老师演示一种洋葱鳞片叶外表皮装片。 ④、将撕取的洋葱鳞片叶外表皮借助解剖针放在水滴中展平，主要是为了细胞尽量无重叠。 ⑤、用镊子夹住盖玻片盖在载玻片上（同学们注意：盖盖玻片应让盖玻片的一侧以大约 45 ?先触及载玻片，然后轻轻放平，防止装片产生气泡）如果四周水过多可以用滤纸吸一下。 2、观察洋葱细胞 显微镜使用顺序：取镜—安放—对光（无载破片）打开光源—低倍镜对准通光孔—聚光器调到最高—调节反光镜—把宏光光圈打开（如果还不够亮可以稍微动一下粗准焦螺旋）—放装片—先用低倍镜调粗准焦螺旋至物像清晰，并调至中央，后扭转物镜转换器用高倍镜观察 可以看到洋葱鳞片叶表皮细胞中紫色的中央液泡，还可以看到原生质层紧贴着细胞壁。 （二）、观察质壁分离及复原 1、观察质壁分离现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加蔗糖会一不小心滴漏在显微镜上，会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入0.3g /mL的蔗糖 溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引，重复几次，为什么要重复呢？让盖玻片下面的洋葱鳞片叶完全侵润在蔗糖溶液中。 ③高倍镜观察表皮细胞发生的变化。中央液泡变小，原生质层脱离细胞壁 2、观察细胞质壁分离的复原现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加清水会一不小心滴漏在显微镜上, 会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片另一侧用吸水纸吸引，这样重复几次。洋葱鳞片叶表皮浸润在清水中。 ③用高倍显微镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴向细胞壁。实验
造血干细胞分离培养方法
一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min 得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加比重为的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min 离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除 Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞 ; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞 , 包括 T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞 ; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞 , 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液 , 加入μL CD45- FITC和10μL CD34- PE 充分混合 , 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定 , 上机检测。 磁性标记 CD34+细胞：在细胞悬液中加入100μL Fc - R阻滞剂 , 再加入100μLCD34 磁珠标记细胞 , 于4℃冰箱中充分混合孵育 30 min。用PBS 缓冲液洗涤细胞，离心10 min , 去上清液后再以500μL PBS缓冲液重新悬浮细胞。 MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500μL PBS 缓冲液漂洗。以孔径30μm的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块 , 细胞通过分离柱 , 以500μL PBS
关于植物质壁分离与复原的实验报告单
观察植物细胞的质壁分离和复原 一、实验目的 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法； 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理 成熟的植物细胞在一定浓度的溶液中，构成一个渗透系统。当水分通过原生质层出入细胞后，由于原生质层与细胞壁的伸缩性大小不同，将导致原生质层与细胞壁分离或复原。 三、实验材料、用具 实验材料：（原因？） g/ml的蔗糖溶液（可否适用0.5g/ml的蔗糖溶液？原因？） 显微镜，镊子、载玻片及盖玻片、滴管、水等 四、探究程序 1：制作临时装片与观察 制作临时装片：用刀片在洋葱鳞片叶的外表面划一个小方块，用镊子撕取这一小块洋葱表皮，将它平展地放在载玻片中央的清水滴中，并盖上盖玻片； 观察：先用低倍镜找到洋葱表皮细胞，并移到视野中央，然后移走低倍镜，换上高倍镜。这时可看到洋葱表皮细胞中紫色的大液泡，还可以看到______ __________________________________；2：细胞的质壁分离 滴蔗糖溶液：从载物台上取下装片，从盖玻片的一侧滴入0.3g／mL的蔗糖溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引。这样重复几次，洋葱表皮细胞就浸润在蔗糖溶液中 观察：将装片放在载物台的中央，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。可以看到细胞中的液泡逐渐变小，_________________________________，最后完全分离 3：质壁分离的复原 滴清水：从载物台上取下装片，从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引这样重复几次，洋葱表皮细胞又浸润在清水中 观察：将装片放在载物台的中央，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴着细胞壁 五、实验结果及结论的分析 1．实验现象： 在细胞液的浓度__________外界溶液的浓度时，洋葱鳞片叶表皮细胞就失水，液泡体积，细胞液浓度，颜色；发生质壁分离； 在细胞液的浓度__________外界溶液的浓度时，细胞就吸水，液泡体积，细胞液浓 度，颜色已出现了质壁分离的细胞，发生质壁分离复原。 2．实验结论 细胞能否从外界吸收水分取决于细胞液的浓度和外界溶液浓度的高低。当细胞液的浓度高于外界溶液的浓度时，细胞就吸水，否则就失水 习题 1．对图示的生物学实验的叙述正确的是（） A．图甲是用低倍显微镜观察某视野中的图像，如要看清洋葱根尖处于分裂期的细胞，应将装片适当向左移动 B．图乙是某同学在2m×2m样方范围内进行的双子叶草本植物苦荬菜种群密度的调查，圆圈表示个体，则这块地苦荬菜的种群密度为3.25株/m2 C．图丙是在高倍显微镜下观察到的黑藻叶细胞的细胞质处于不断流动的状态，实际上图中所标注的叶绿体位于右下角，细胞质按逆时针方向流动 D．图丁表示用高倍显微镜观察正在发生质壁分离的紫色洋葱表皮细胞，可见其液泡的颜色逐渐变浅 2．很多生物学实验都需要制作临时装片，在显微镜下观察，下列实验步骤不正确的是（） A．脂肪的鉴定：切取花生子叶薄片→染色→洗去浮色→制片→观察 B．观察细胞中叶绿体：取黑藻幼嫩小叶→染色→制片→观察 C．察观察细胞有丝分裂：解离洋葱根尖→漂洗→染色→制片→观察 D．观察细胞质壁分离：制作洋葱鳞片叶表皮装片→观察→滴入0．3g/mL蔗糖溶液→观察 3．（多选）用一个紫色洋葱的鳞片叶可做下列哪些实验的材料? （） A．观察植物细胞减数分裂B．观察植物细胞的质壁分离和复原 C．观察细胞中DNA和RNA的分布D．叶绿体中四种色素的提取和分离 ①
2018年淋巴细胞分离
淋巴细胞分离 淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 tZz3a1Ui实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备：1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程： 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释（外周血：稀释液=1：2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀） 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2） 5.放入离心机1500r/min离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）
6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释 3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数： 实验流程： 1.准备计数板：
细胞培养的基本方法-细胞分离技术
细胞培养的基本方法-细胞分离技术 细胞分离技术 一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机 械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。 1. 胰蛋白酶（Trypsin） ?在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬 浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。 ?将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐 溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。 ?在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 ?移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。 ?在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要 加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 ?通过无菌不锈钢丝网（100?200mm过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。 2. 胶原酶（Collagenase） ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片 几次。 ?加入胶原酶（50?200单位/ml，溶解在HBSS中）。 ?在37C孵育4到18小时。加入3mM CaCI2增加解离效率。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。 如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 ?通过离心在HBSS中清洗悬液几次。 ?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 3. Dis pase ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片 几次。 ?加入Dispase （0.6?2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液） ?在37C孵育20分钟到几个小时。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的
观察植物细胞质壁分离与复原
《实验七观察植物细胞质壁分离与复原》 作者：郭文娟 【教材分析】这是人教版生物高中第一册第三章第四节《植物对水分的吸收和利用》中的一节实验课是帮助学生理解细胞吸水原理的有力实例，但是这个实验的操作相对简单，因此在教学目标上， 1. 初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法 2．理解植物细胞发生渗透作用的原理我在原有的基础上，添加了用课本实验的方法，让学生体验实验设计的几个重要基本原则的目标【教学重难点】 1. 观察植物细胞的质壁分离 2. 理解植物细胞发生质壁分离与复原的原理根据我对高二学生的了解，他们具备了以下四个特征，而且在以往的实验课中经常想尝试做一些自己的实验，也正是由于这点，使我在这节课中作了一个新设计实验的尝试 【教学方法】保证学生能在上完这节课后，要留下对学习过程的记录和今后作为复习的第一手资料，因此我使用了学案教学的方法， 【学案教学法】 学案的使用分为课前预习、课堂导学、课后巩固测试三部分 【教学过程】 一、导课用导学案的预习部分，以回忆知识的方式，讲解实验原理，了解实验用具和材料，同时将方法步骤中的难点和注意事项交代清楚。 用大约5-6 分钟的时间，学生已经对课本实验已经了解透彻，可这个实验操作很简单，那我们能不能完成这个实验的同时再多做一些观察呢？有些学生就想观察一些其他的植物。 导学案上就提出可不可以根据课本实验，用质壁分离的原理比较其他植物细胞与洋葱表皮细胞吸水能力的强弱吗？ 问题提出后教师就利用导学案上的“课堂导学”部分对学生进行引导，学生通过讨论完成导学案上实验设计。这里我在导学案的实验设计中把它分解为以下这三个问题，为什么这样设置呢？ 首先变量是实验的核心；设计实验的核心归根到底就是要确定实验变量的选择；学生只有抓住了这个核心，才能抓住这个实验设计的要诀。 而接着对照实验组的确定无非就是对实验变量的控制，保证实验中对照实验组之间只有一个变量不同，无关变量尽量控制在相同的条件下。 第三观察现象的确定，在这一步里学生必须找到一个能确定实验结果的可观测指标，使这个实验具有可操作性。 这样的设置看似简单，但其中却恰恰包含了新课标对学生思维培养的一种期待，这种期待是什么呢？ 通过这个简单的实验，学生掌握的不仅仅是专业知识，更是在这个过程中潜移默化地培养他们的思维，这种思维不仅仅可以用在今后的生物学习中，更可以用来解决人生道路上的各种问题。 就这个案例来说，从讨论实验设计的方法中，学生可以体会到单一变量原则、对照原则、可行性原则，事实上这些原则提炼出来就是实事求是、严谨全面、正视困难的精神，当学生在今后学习生活当中遇到问题的时候，遵循这样的精神，去寻找解决问题的方法。 当然，这节课中，学生对学案中提出的问题大感兴趣，他们找到了很多植物，除了课本上的洋葱，还有红花羊蹄甲、菠菜、香葱、美人蕉等等植物，确定实验变量为不同植物细胞。 在设计对照实验的过程中，同学们设计了各种各样的对照实验，我选了几个比较有特色的三组同学的
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告 一、实验目的 1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理 2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础 二、实验材料 1.淋巴细胞分离液 2.EDTA抗凝剂 常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固 3.PBS缓冲液 PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用 4.戊巴比妥钠溶液 作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。 5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml） 三、实验原理 外周血中各种细胞的密度不同。密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。 第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层
图1 小鼠外周血离心前后示意图 四、实验步骤 1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉 2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液 3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1) 4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面 5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管 6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min 7.弃上清液，加入4mlPBS待用
探究植物细胞质壁分离的创新实验说课稿
探究植物细胞质壁分离的创新说课稿 武陟一中梁西周 一、理论背景及实验创新理念 目前高中生物教学中尽管改革不断深化，课堂的人文性有所加强，但生物课堂教学效率低下，低效教学甚至无效教学在传统的教学中仍然大量存在。因此当前亟待解决的问题就是如何实现有效教学，以尽可能少的时间、精力和物力投入，取得尽可能多的教学效果。对实验的创新是必要的，在改进中的和创新中使学生对实验的原理、现象、结论及其运用有更好的理解和掌握，相对传统的实验，创新实验的效果更明显，更易于激发学生的学习和探究热情，培养学生的发散思维和逆向思维，在教学过程中做到有效果、有效率、有效益。 二、教学内容分析 本案例出自必修1《分子与细胞》新课标内容的第四章第一节：物质跨膜运输的实例。本实验是在学习扩散和渗透、被动转运、主动转运知识的基础上，利用植物细胞质壁分离及质壁分离复原实验强化渗透作用原理，同时也是对物质出入细胞方式这块内容的升华。本实验也是在初中《科学》“根对水分的吸收”的基础上进一步学习植物的水分代谢过程。同时也与后面学习的细胞呼吸作用和光合作用存在一定程度的联系，是植物体新陈代谢的基础。 三、学情分析 学生除拥有初中自然科学相关水分吸收内容基础知识外，在学习物质出入细胞的方式内容后，他们对植物细胞在什么情况下吸水和失水等内容已经有所了解，并在日常生活经验中也有类似植物细胞吸水失水的实例，例如萝卜咸菜腌制等。但并没有系统学习植物细胞吸水和失水的基本原理及条件，缺乏感性认识。与平时理论课相比，学生对实验课有更高的积极性，对课本中没有的创新实验有更强的探究欲望。 四、教学目标 高中生物课程标准的基本理念中明确指出倡导探究性学习和注重与现实生活的联系。尝试从不同角度思考、分析和解释观察的现象，树立实事求是的科学态度；解释植物细胞质壁分离及质壁分离复原的现象。 1．知识目标：解释植物细胞渗透吸水的原理和过程；解释质壁分离与复原的实质；说明质壁分离能否自动复原的条件。 2．能力目标：初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法；尝试对实验结果进行分析和解释并得出相应的结论；运用质壁分离与复原知识解决实际问题；复习并熟练光学显微镜的操作步骤。 3．情感目标：参与小组合作与交流，体验团队协作学习过程；通过实验结果和现象观察，养成实事求是的科学态度；培养不断探求新知的精神和合作精神。 五、教学重点与难点
DC细胞的分离及培养
DC细胞的分离及培养 一、单个核细胞的分离 1. 取新鲜脐带血按等体积加血液稀释液或PBS，混合均匀。 2. 将Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）瓶来回倒置几次，以确保其混合均匀。使用带注射针头的注射器刺穿隔片，倒置Ficoll-Paque PLUS 瓶并抽取需要量的Ficoll-Paque PLUS。 3. 将Ficoll-Paque PLUS 取3 ml 缓缓加入15 ml离心管中。 4. 轻轻加入稀释血液样品4 ml，使其置于Ficoll-Paque PREMIUM层上。加入稀释血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PREMIUM分层，二者不得混合。 5. 在18-20 °C 下，离心400 g 30-40 分钟。 6. 使用无菌的吸管或移液器抽出上层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状。 7. 采用一无菌的吸管或移液器将淋巴细胞层移入一清洁的离心管中。在最小量的情况下移出界面处所有的物质至关重要。移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致粒细胞污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。 8. 向装有淋巴细胞的试管中加入至少3倍体积的PBS溶液。 9. 用吸管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。在18-20 °C 下，以60-100 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液。 10. 重复步骤8-9，至此，淋巴细胞应悬浮于适合CD34阳性细胞分选液中。 二、CD34阳性细胞分选 1. 使用含0.5% BSA的PBS（分选buffer）重悬制备好的单个核细胞，加入50~100 μl CD34+ microbeads（Miltenyi公司），4 °C混合半个小时。 2. 选择合适的分选柱，MS柱适合50 ml血量，更多则使用LS柱。 3. 用分选buffer平衡分选柱3个柱体积后，将分选柱至于磁极上。 4. 将步骤1的悬浊液混合物以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并使用2-3 ml的分选buffer重悬。 5. 把重悬后的细胞和磁珠缓缓加到分选柱上，使其缓慢流下。 6. 用分选buffer清洗分选柱3个柱体积。 7. 将分选柱自磁极上取下，加入一个柱体积的分选buffer，快速将之打入离心管中。为提高回收效率，可重复一次。 8. 将洗下的细胞以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并用PBS重悬。 9. 重复步骤8并用合适的培养基重悬以适应下面的细胞培养。 三、CD34阳性细胞培养 1. 培养基配置：IMDM培养基+10% FBS，细胞因子SCF 50 ng/ml、IL-3 5 ng/ml、IL-6 20 ng/ml、FL-3t 50 ng/ml、TPO 20 ng/ml，加双抗。 2. 将分离好的CD34阳性细胞置于六孔版的一孔或分于两孔中（视血量和细胞
MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书
MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书 主要用途： 淋巴细胞分离试剂是一种旨在通过葡聚糖和泛影酸钠混合液，达到特定比重，然后离心分层以获得纯化完整的单核细胞/淋巴细胞的权威而经典的技术方法。可以被用于动物（大鼠、小鼠等）单核细胞/淋巴细胞的分离、鉴定、染色、标记、培养、 DNA萃取、线粒体分离、细胞因子测定和细胞流式仪分析等研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，分离出色，性能 稳定，细胞活性保证。 技术背景： 全血溶液含有血清、各种蛋白因子、无核血红细胞、血小板、多核白细胞和单核白细胞等。为了获得纯化完整的单核白细胞 /淋巴细胞，采用Boyum（1968）的离心技术，可以方便快速地从全血和骨髓中分离。 产品内容： 淋巴细胞分离液（200）毫升 产品说明书1份 产品特点： -密度变化率依照 Ficoll400泛影酸和氢氧化钠。-最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数-在 低粘度时高密度-无菌-即用型-溶液产品规格
检测标准： 热源检测结果：＜0.5EU∕ml 无菌检测结果：已检测 应用 人外周血中分离出淋巴细胞的最佳试剂。这种分离液同样可被用作从其它途径分离人的淋巴细胞，包括骨髓血细胞、脐带血 细胞及组织匀浆。 实验步骤 实验开始前，室温预热淋巴细胞分离液。然后进行下列操作。（注：上述方法适用于从外周血中分离淋巴细胞。如从骨髓、脐带及组织匀浆中分离，需要先去除红细胞后再进行上述步骤分离淋巴细胞。 1．准备无菌的锥形离心管 2．加入淋巴细胞分离液 3. 用hank’s 液或用户自备的PBS缓冲液1：1比例（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品。 3．小心沿着管壁，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴分离液上面。 （注意：切记不要搅浑淋巴细胞分离液） 4．小心放进台式离心机离心30分钟，速度为400g 5．小心取出离心管，切记不要震动 6．可见，最上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的致密白色环
〖实验6〗观察植物细胞的质壁分离和复原
〖实验6〗观察植物细胞的质壁分离和复原（B1C4P61“探究”） 一、实验目的： 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理： 1．质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。 2．质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 六、实验结论：_____________________________________________________________。 实验4key： 三.实验假设：原生质层相当于一层半透膜 四、实验流程：液泡的大小蔗糖原生质层清水 五、注意事项：水平污染载物台太长太高复原 六、实验结论：原生质层相当于一层半透膜 （实验材料：紫色洋葱鳞片叶的外表皮。因为液泡呈紫色，易于观察。也可用水绵代替。0.3g/ml的蔗糖溶液。用蔗糖溶液做质壁分离剂对细胞无毒害作用。）
i 质、壁的概念 1.发生质壁分离复原的植物细胞中，水分经过的结构依次是（） A．细胞膜、液泡膜、细胞质、细胞壁B．细胞壁、细胞膜、细胞质、液泡膜 C．液泡膜、细胞质、细胞膜、细胞壁D．细胞壁、细胞膜、液泡膜、细胞质 2.某学生做“细胞的质壁分离和质壁分离复原”实验，所用材料为紫色洋葱，试剂是30%蔗糖溶 液，请据图回答下列问题： ⑴显微镜下观察到洋葱表皮细胞图B处于 ___________________状态；由A形成B的原因 是___________________________。 ⑵从结构上看，图A中的原生质层是由［］_____ _____、［］__________、［］_____________ 共同构成的，相当于 ⑶“⑦”处溶液是_____________________；“⑧”处溶液是_____________________。 ⑷实验过程中看到的是，当细胞浸泡在30%蔗糖溶液中后，液泡的颜色变_________，说明细胞 通过渗透作用而______________；当已发生质壁分离的细胞置于清水中后，液泡的颜色变_________，说明细胞通过渗透作用而_______________。 ⑸若将B细胞放入清水中它_______（填“会”或“不会”）无限吸水，理由是____ ________。ii 质壁分离、复原的原理：浓度差、半透膜、渗透吸水、活细胞 3.植物细胞发生质壁分离的内因是（） A．外界溶液浓度大，细胞液浓度小B．原生质层伸缩性小，细胞壁伸缩性大 C．外界溶液浓度小，细胞液浓度大D．原生质层伸缩性大，细胞壁伸缩性小 4.下列结构中会影响细胞渗透吸水，但基本不影响细胞渗透失水的是（） A．细胞膜B．液泡膜C．细胞液D．细胞壁 5.（06广东）2．以紫色洋葱鳞茎表皮为材料观察植物细胞质壁分离现象，下列叙述错误的是（） A．在发生质壁分离的细胞中能观察到紫色中央液泡逐渐缩小 B．滴加30％的蔗糖溶液比10％蔗糖溶液引起细胞质壁分离所需时间短 C．发生质壁分离的细胞放入清水中又复原，说明细胞保持活性 D．用高浓度的NaCl溶液代替蔗糖溶液不能引起细胞质壁分离 iii 质壁分离与否的判断 6.置于30%的蔗糖溶液中会发生质壁分离的一组细胞是（） A．用95％乙醇浸泡过的洋葱鳞片叶上表皮细胞（死）B．玉米根分生区细胞和伸长区细胞C．形成层细胞和胚芽细胞D．洋葱表皮细胞和根毛细胞 7.如果把一个膨胀到最大限度的植物细胞放在“它自己的细胞液”溶液（与膨胀前浓度相等的溶 液）中，则细胞（） A．没有变化B．水被释放，最后质壁分离C．细胞胀破D．细胞失水，但不会质壁分离8.具有液泡的成熟植物细胞放入蔗糖溶液中，经一段时间，这个细胞会发生的变化是（） A．液泡变大B．液泡变小C．液泡保持不变D．无法肯定 iv 质壁分离的结果 9.(08广东卷·3)观察在0.3g／mI．蔗糖溶液中的洋葱表皮细胞，发现中央液泡逐渐变小，说明 A．细胞壁相当于一层半透膜B．洋葱表皮细胞是活的 C．此时蔗糖溶液浓度小于细胞液浓度D．细胞壁收缩导致中央液泡失水