淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

一、细胞融合前准备

(一)免疫方案

选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射

)

↓2～3周后

第二次免疫1×10７／0.5ml ip

↓3周后

加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注

射)

↓

取脾融合

2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8～1ml0.2ml／点)

↓3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

│(ip剂量不宜超过0.5ml)

↓3周后

第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip

│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)

↓2～3周后

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv

↓3天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

(二)饲养细胞

在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

小鼠腹腔巨噬细胞的制备

小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄

↓

拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟

↓

用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

↓

用无菌注射器注入6～8ml培养液

↓

反复冲洗，吸出冲洗液

↓

放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟

↓

用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×

10５／ml

↓

加入96孔板，100μl／孔

↓

放入37℃CO2孵箱培养

一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，

若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×

106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。

(三)骨髓瘤细胞

骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂

交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。

常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。

骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10 稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏

感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。

保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决

定细胞融合的关键。

(四)免疫脾细胞

免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后

一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，

融合的成功率较高。

脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平

皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约

是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。

二、细胞融合，选择杂交瘤

(一)细胞融合流程

(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

(6)在室温下融合:

①30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。

②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

(7)离心，800rpm，6分钟。

(8)弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％

CO2孵箱培养。

一般一块96孔板含有1×107脾细胞。

(二)HAT选择杂交瘤

应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已

经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。

因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择

培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。

50×HAT

H:5×10-3M

A:2×10-5M

T:8×10-4M

一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，

改用一般培养液。

三、抗体的检测

筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫

原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性

抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，

一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有:

1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。

2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。

3.FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。

4.IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

四、杂交瘤的克隆化和冻存

克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和

其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

(一)克隆化方案

用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

1.有限稀释法的程序

①制备饲养细胞悬液(同融合前准备)

②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml

③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。

⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。

注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

2.软琼脂法

①软琼脂的配制

含20％FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640

1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

②用上述0.5％琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室

温中待凝固后作为基底层备用。

③按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

④1ml 0.5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混

合。

⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。

⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞

的24孔板中进行培养。

⑦检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。

(二)杂交瘤细胞的冻存

及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。

因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发

生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述

的意外而全功尽弃。

杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安

瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培

养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。

细胞冻存液:

50％小牛血清

40％不完全培养液

10％DMSO(二甲亚砜)

冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降

温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后

放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细

胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或

更长时间。

五、单克隆抗体的大量生产

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但

此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。

2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml, 共2～4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血

，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。但采血量有限。

②腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于

BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前

，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用

注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是

目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

六、单克隆抗体的鉴定

对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:

1.抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗

原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色

素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗

重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其

次是与其它细胞因子间有无交叉。

2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠

IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3％)，将有利于沉淀线的形成。

3.McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

5.McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。

七、影响因素、失败原因分析

由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

其主要失败原因和影响因素有:

1.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题

。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的

污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支

原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行

支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取

生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水

或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。

2.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因

素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选

。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。

3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

①融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。

②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗

体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体

丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效

措施。

三要:

要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

要定期进行再克隆。

三不要:

不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗

体的杂交瘤细胞。

不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

4.杂交瘤细胞难以克隆化

可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫

杂交瘤技术的基本原理

杂交瘤技术的基本原理 1975年G. Kohler和C. Mistein利用细胞融合技术，首次获得能生产单一抗体的杂交瘤细胞。与血液中的多种抗体比较，单克隆抗体更具有其特殊的优点。也正是它的特异性和高纯度的单一性而被利用于多种产业，从而获得巨大的经济效益。 抗体由B淋巴细胞产生，为了得到能产生单一抗体的淋巴细胞，并且要求这种淋巴细胞既能在一般的体外培养条件下进行正常的生长繁殖，而且还要能持久的产生这种单一抗体。G. Kohler和C. Mistein 发现存在多发性骨髓瘤疾病中的B淋巴肿瘤，由于在浆细胞中发生了成瘤转而能产生免疫球蛋白，而且这种细胞能在体外生长易被克隆。。受到这种天然肿瘤B淋巴细胞能产生抗体的启发，他们利用骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合成杂交瘤细胞制造各种单克隆抗体，使之成为一种成型的生产单克隆抗体的杂交瘤技术。 骨髓瘤细胞可以在体外生长，而且比正常细胞生长繁殖速度要快。此种细胞可以从患骨髓瘤的小鼠体内中获得，只是这种细胞不会产生抗体。用特定的抗原刺激正常小鼠脾脏B淋巴细胞，B淋巴细胞就会产生相应单一的特异性抗体，但这种B淋巴细胞却难以体外培养。杂交瘤技术就是将这两种具有功能的细胞融合在一起，在体外快速生长的杂交瘤细胞。此种杂交瘤细胞群持续分泌的成分但已有特异性的抗体。我们称为单克隆抗体。 其原理从三个方面阐明： (一)细胞的选择与融合

建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。 使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇(PEG1 000～2 000)是目前最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为40%(W/V)。 (二)选择培养基的应用 细胞融合一个随机的物理学过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中仅存活5～7d，无需特别筛选；细胞的多聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 细胞DNA合成一般有两条途径。主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌吟磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，

杂交瘤细胞生成抗体技术

杂交瘤细胞生成抗体技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。 1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理 标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法 单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限

杂交瘤技术的实验原理及其操作演示(4学时)

教案 课程名称细胞生物学实验授课题目（章、节）实验八：杂交瘤技术的实验原理及其操作演示授课老师刘庆平授课对象2002级生物工程授课时间第十三周教学方法理论教学选用教具多媒体教学实验内容提要： 杂交瘤技术的实验原理及其操作演示（4学时） 第一节实验介绍150分钟 （一）、实验原理； （二）、实验目的； （三）、实验用品； （四）、实验方法和过程； （五）、实验结果分析； 第二节．实验多媒体示教30分钟

教学重点、难点及基本要求： 重点及难点： 杂交瘤获得成功的基本要素。 1、动物免疫 2、细胞融合 3、杂交瘤细胞的融合 基本要求： 1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法 2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体 教研室主任意见： 单元教学小结（经验效果、问题、改进措施、信息反馈等） 本教案以讲授一个单元（2-4学时）一次实验（实习）为单位填写。填写要用钢笔。字迹要清晰、工整。按表项目逐一填写。

实验二杂交瘤技术的实验原理及其操作演示 （多媒体教学演示4学时） 杂交瘤技术是1975年Kohler和Milstein用于制备单克隆抗体而创建的一项重要技术，被誉为“免疫学上的一次革命”。此技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备。抗体是由B淋巴细胞分泌的，一个B淋巴细胞只能分泌一种抗体。把B淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌的杂交瘤细胞，如果把单个杂交瘤细胞克隆化，扩增传代，其分泌的抗体即为高度纯一的单克隆抗体。单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能结合一种特定的抗原决定簇。正是由于其这种高度专一性，因此被广泛用于疾病的论断和治疗，生物大分子的鉴定、定位和分离纯化，以及一些细胞器，特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离等方面, 具有极其远大的应用前景, 因此，用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要，应用范围越来越广。 实验目的 1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法 2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体 实验原理 杂交瘤技术的建立基于以下三种关键技术。 一、动物免疫 动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。 二、细胞融合 B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。 脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官, 取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞, 自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都

杂交瘤技术基本程序与方法

杂交瘤技术基本程序与方法 一、杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HA T培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。 二、基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml 注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。 淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、

杂交瘤技术制备单克隆抗体

杂交瘤技术制备单克隆抗体 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体制备的一般流程如下:

单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合

筛选杂交瘤细胞的方法

如何筛选杂交瘤细胞？ 教学中经常有学生问：如何筛选杂交瘤细胞？ 浙科版选修3教材中有筛选杂交瘤细胞的内容，但没有如何筛选的方法，以下的上海高考试题可以在教学中作为一个情境感知。 单克隆抗体制备示意图

NO.1 用选择培养基筛选 情境导入： 已知细胞合成D N A有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有D N A合成的S途径，但一般不分裂增殖，鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加入聚乙二醇促进融合，获得杂种细胞（一般只考虑细胞两两融合）。 细胞存在情况分析： 骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合形成3种杂种细胞，则试管中有5种细胞，即B淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞、杂交瘤细胞、B淋巴细胞和骨髓瘤细胞；鼠骨髓瘤细胞能不断分裂增殖，因此骨髓瘤细胞自身融合的细胞、杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞能增殖。 设计方法： 在培养液中添加入氨基嘌呤再收集增殖的细胞。 原理分析： 加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有该合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的瘤细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成D N A而增殖。

NO.2 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞的机理 首先，在已免疫过的B淋巴细胞（即效应B细胞）和骨髓瘤细胞进行杂交时，可能出现的情况应该先弄清楚。 如果只考虑两两融合，可能的情况有：（1）（效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合；（2）（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）；（3）骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）。

第一类细胞在体外培养的条件下，因为无法无限增殖，最终死亡，因此，筛选的关键是限制第二类细胞的增殖。科学家在设计实验时，已经考虑到这方面问题，所以他们选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（T K－）或者次黄嘌呤磷酸核苷转移酶（H G P R T－）缺陷。 筛选的目的：获得杂交瘤细胞。 筛选的方法：用选择性培养基来完成，即H A T培养基。 加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的培养基称H A T培养基。其中，氨基喋呤可阻断D N A合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应急途径即在H G P R T（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶）和T K（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成D N A，缺少其中一种，D N A合成不能发生。 用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无T K或H G P R T，所以单个或融合骨髓瘤细胞在H A T 培养液中将死亡。B细胞虽然有H G P R T和T K，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。因此，只有杂交瘤细胞才能在H A T培养液中生长繁殖。 淋巴细胞：不能生长，5到7天死亡，原因是D N A的主要合成途径被A 阻断。 骨髓瘤细胞：不能生长，5到7天死亡，原因是H G P R T缺乏，D N A合成的旁路途经受阻。

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合

杂交瘤技术制备单克隆抗体

杂交瘤技术制备单克隆抗体 来源：https://www.wendangku.net/doc/8b17378924.html, 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体制备的一般流程如下:

单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后

淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

一、细胞融合前准备 (一)免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射 ) ↓2～3周后 第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注 射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射 │(一般0.8～1ml0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后

第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二)饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入6～8ml培养液 ↓ 反复冲洗，吸出冲洗液

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT 选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D 途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B 细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培

养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3-4次，直至确信每孔中增殖的细胞为单克隆细胞。第二次筛选也是鉴定的过程。 创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王*

单克隆抗体

单克隆抗体技术 单克隆抗体的克隆化方法 经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。 克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。 克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。 （一）有限稀释法 1．材料 （1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。 （2）HT培养基 2．操作方法 （1）取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。 （2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。 （3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。 （4）5％CO2饱和湿度，37℃培养。 （5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。 （6）克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。 （7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。（二）软琼脂克隆化 借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下： 1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。 2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。 3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。 4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。 5．DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。 6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。 7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。 8．用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。 （三）显微镜操作法 在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×108细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。 （四）荧光激活分离法 用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管

杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法

杂交瘤技术的单克隆抗体的 制备方法 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法 冉继平 摘要：本文主要介绍了单克隆抗体、杂交瘤技术以及运用杂交瘤技术制备单克隆抗体的步骤。还对三种（包括人促甲状腺激素单克隆抗体、绵阳早孕因子单克隆抗体、阿莫西林单克隆抗体）不同的单克隆抗体的制备方法和临床运用做了简单的介绍。 关键词：单克隆、抗体、杂交瘤技术。 1.0 杂交瘤单克隆抗体的简介 抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 杂交瘤单克隆抗体的原理是: B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。杂交瘤技术产生单克隆抗体的步骤 一.提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。 二.应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既 具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性 三.对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，体外或体内培养，从培养液或 动物腹水中提取单克隆抗体 2.0 单克隆抗体的实例 单克隆抗体用于临床诊断和治疗，目前研究的单克隆抗体非常的多，下文就会介绍几种单克隆抗体的的应用实例： 2．1 人促甲状腺激素单克隆抗体 人促甲状腺激素是脑垂体分泌的促进甲状腺生长和机能的糖蛋白激素。血液中人促甲状腺激素含量的异常变化会起机体产生一系列甲状腺疾病例如原发性甲状腺功能减退，甲状腺肿瘤及新生儿呆小症等。给社会和家庭带来了巨大伤害。因此，临床上将血清人促甲状腺激素含量作为评估甲状腺功能是否正常的首选指标。所以建立快速精确的人促甲状腺激素检测方法成为了预防甲状腺疾病的关键。目前检测人血清人促甲状腺激素常用方法均为免疫分析法：包括兔疫放射分析和酶联兔疫等。无论哪一种方法制备特性强灵敏度高的单克隆抗体才是实现精确检测的前提。采用杂交瘤技术取经兔疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮阳性筛选和亚克隆得到能稳定高效分泌抗人促甲状腺激素单克隆抗体的杂交瘤细胞株