Caspase家族与细胞凋亡的研究进展_易铁男
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(收稿日期:2000204212 修回日期:2000207205)
Caspase 家族与细胞凋亡的研究进展
易铁男综述 周云峰,伍 钢审校
(湖北医科大学第二附属医院放化疗科,湖北 武汉 430071)
摘要:近年来Cas pase 蛋白酶家族是细胞凋亡研究的热点,Cas pase 被认为是细胞凋亡的中心环节和执行者。现就Cas pase 蛋白酶家族生物学特性、分布、作用底物、抑制剂,以及激活机制、凋亡调控基因之间的作用等从分子机制对凋亡调控的研究现状及与肿瘤和疾病防治可能的应用前景进行综述。
关键词:Cas pase 家族;细胞凋亡
中图分类号:R 730.5 文献标识码:A 文章编号:100028225(2001)20120039204
作者简介:易铁男(19632),男,湖北襄樊人,副主任医师,在读硕士生,主要从事肿瘤放化疗专业,研究方向为端粒酶和细胞凋亡。
细胞凋亡是一种基因控制的细胞自主性的死亡过程,是维持内环境稳定的重要机制之一。目前细胞凋亡的机制尚不完全清楚。细胞凋亡在胚胎发生、神经系统的功能完善以及免疫功能调节等方面具有关键性的作用。细胞凋亡功能的抑制将导致肿瘤的发生及免疫功能的异常,而细胞凋亡功能亢进与组织损伤和器官功能衰竭的
发病密切相关。因此探讨细胞凋亡的分子生物学机制与调节将对细胞损伤及肿瘤防治产生深远的影响[1]。细胞凋亡发生和发展概括为3个阶段:信号传递阶段、中央调控阶段、结构改变阶段[2]。细胞凋亡从内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号,传递至Cas pase 并使其活化开始,以蛋白底物裂解、细胞解体为结局,从而使细胞凋亡得以完成。因此,对于Cas pase 的深入研究将对其依赖的细胞凋亡相关肿瘤和疾病有可能作为治疗的又一新靶点,从而为基因治疗提供新的途径。
1 Ca spa se蛋白酶及其生物学特性
1993年Yuan等发现秀丽隐杆线虫的Ced23基因与哺乳动物细胞I CE(in terleuk in21Βconverting enzym e)存在功能和序列上的高度同源,和Ced23一样I CE高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。目前在哺乳动物细胞中已发现有14种I CE Ced23蛋白酶家族成员[3],命名为半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl as partate s pe2 cific p rotesae),简称Cas pase,有人谓之“半胱天冬酶”。它们具有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性。按其家族成员公布时间,在Cas pase命名下对所有I CE样蛋白酶进行统一命名分类,目前已有Cas pase21到Cas pase214分类。结构上Cas pase均含有OA CXG(X为任何氨基酸)五肽保守序列半胱氨酸蛋白酶,以无活性的酶原形式存在。Cas pase21和Cas pase23X线衍射晶体结构相似,均是由大、小亚单位组成的两个异源二聚体所构成的Α2Β2四聚物。每个异源二聚体内,两个大小亚单位构成一个催化区,负责对其底物位点激活。二者主要不同在Cas pase23有一环形区(l oop)而Cas pase21则无[4]。所有Cas pase都由一个前域(p rodom ian)和一个酶的区域组成,由于前域的结构、蛋白酶之间存在着多相性,根据酶原N端被切割肽段的长度,Cas pase可分为长前域和短前域。长前域主要起激发和调节凋亡的活化作用,其中以Cas pase22、Cas pase28、Cas pase210为代表,它们都有两个约60个氨基酸的蛋白2蛋白作用基元(motif),称为“死亡域”(death effecto r dom ain,D ED),调节与其它蛋白的结合及传递信号。短前域主要进行蛋白质酶解作用,主要有Cas pase23、Cas pase26、Cas pase27等代表,又称效应Cas pase,其作用为在链的下游末端去剪切底物。
2 Ca spa se的分布、作用底物及抑制剂
Cas pase家族广泛存在于细胞中,主要以酶原的形式存在。各成员分布和表达有一定的组织特异性。例如在子宫和胎盘中Cas pase21几乎无表达,而Cas pase24有较高的表达水平,脑中有大量的Cas pase23,少量Cas pase27存在,其他成员则难以检出。动物实验表明,缺乏Cas pase23小鼠表现为脑内细胞过度增生和细胞发育失去有序性。K raje w ska等[5]报道了Cas pase23在人体组织细胞中含量有明显差异。此外Cas pase家族各成员常共存在于同一细胞中。人的Jurkat T2细胞甚至含有该家族所有的已知成员,它们在细胞中一般存在于细胞质中,偶尔也见于一些细胞核中。
对Cas pase诱导凋亡机制的认识很大程度上取决于对其作用底物的发掘,近年来已有40多种Cas pase底物得到发现。根据蛋白酶对其底物酶切后产生作用的后果不同,将其底物分为四大类:第一类是被酶切后活化的底物,如Cas pase本身切割可引起自身活化,PKC2?、P21激活的激酶2(PA K2)、凝脂酶A2、类固醇调节元件结合蛋白(SR EBF)等;第二类为酶切后失活的底物,如DNA催化亚单位、视网膜母细胞瘤抑制蛋白等;第三类为酶切后改变其结构的蛋白,如A型和B型细胞核L a m in及Gas2;第四类为酶切后对凋亡作用尚不清楚的底物,如PA R P[po ly(A op2ribose)po lym erase]DNA2PA K s等。通过对底物的作用引起的变化包括:①阻遏细胞周期循环;
②破坏细胞平衡状态及修复机制;③使细胞从周围的组织结构中脱落;④使维持细胞结构的物质解体;⑤磷脂酰丝氨酸(PS)为其他细胞如巨噬细胞作包裹吞噬的标记[6]。
Cas pase酶活性的抑制物可分为三大类:即天然抑制剂、人工合成抑制剂和拮抗Cas pase酶作用的抑制剂。天然抑制剂主要见于病毒产生蛋白,如C r mA、P35等。人工抑制剂主要是其活性中心抑制剂如A c2D EVD2CHD、Z VAD2f m k等;拮抗作用的有Bcl22、Bcl2xL等。
3 Ca spa se激活机制
一旦对细胞重要成分执行致命性切割的Cas pase被激活,细胞死亡将不可避免出现。因此,弄清楚最初Cas2 pase蛋白水解酶激活机制是解释细胞凋亡关键的一步。最近的研究表明,Cas pase激活是既可发生在细胞膜死亡受体复合体,又可发生在细胞质线粒体的依赖机制。
3.1 死亡受体路径
凋亡开始最具特征的路径之一是细胞死亡信号蛋白(TN F22、Fas L、TRA I L和A Po23L)盘绕粘附到它的同源细胞表面的接受器上。目前5个死亡受体c DNA序列已清楚,它们是Fas分子(CD95 apo21)、肿瘤坏死因子受体21(TN FR21)、死亡受体23(DR3、W SL21、TRAM P、LA RD)、DR4和DR5(A PO22、TRA I L2R2)。Fas分子的配体为Fas L;TN FR21配体为TN F2Α;DR3为A PO23L,而DR4H和DR5配体为TRAL、A PO22。死亡受体包含一明显的细胞质区域,由80个氨基酸残基构成的该区有重要的蛋白水解功能,这个区域被称为“死亡区域”。由于死亡受体分子中的死亡结构域(death dom in,DD)有相互积聚的倾向,死亡配体与其受体结合后导致其死亡结构域相互积聚并与转节器分子的死亡结构域相互结合,使死亡受体分子活化。死亡受体与转节器分子结合后导致细胞内Cas pase酶原(p ro2cas pase)在局部聚集,通过转节器分子的另一端含有Cas pase酶原分子相似的死亡效应器蛋白结构域相互串联结合构成大分子复合物,称为“凋亡酶体”(apop tos om e)。凋亡酶体形成后其分子中的Cas2 pase酶原(通常为p ro2cas pase28)分子中的两个线形亚单位相互靠近,可以进行自身水解而成为具有水解活性的蛋白酶,然后可以依次水解其下游的同源酶(如p ro2cas2 pase26,p ro2cas pase27等),最后激活其效应器酶(通常cas
pase23)而导致细胞死亡[7]。
3.2 线粒体路径
最近报道线粒体对凋亡发挥重要的作用。L iu等[8]应用细胞游离的体外凋亡体系,发现3个蛋白A paf21(凋亡促进因子21)、A paf22(细胞色素C)、A apf23(Cas pase2
9)与凋亡有关。对Cas pase23激活除了需要dA T P或
A T P外必须有线粒体内膜的细胞色素C释放,线粒体参与凋亡转导的机制主要有两个方面:①线粒体质膜的渗透性改变,PT孔的开放使线粒体基质和胞浆内的离子得以平衡流动,使原来存在的线粒体跨膜电位(△7m)被驱散。离子的流动有可能造成线粒体基质的高渗状态,从而使线粒体膨胀、细胞骨架蛋白受压,直接导致细胞凋亡的发生[9]。②线粒体的释放反应,线粒体内膜含有许多死亡促进因子(D PF),包括细胞色素C、凋亡诱导因子(A IF)、促死亡蛋白、Cas pase酶原等。Susin等至少在某些细胞线粒体中发现Cas pase22、Cas pase23、Cas pase29的前体[10]。线粒体释放的细胞色素C能与A paf21及Cas2 pase29形成一个复合体,在dA T P、A T P存在下活化Cas2 pase23、Cas pase26、Cas pase27等成员,使凋亡进行下去[11]。线粒体内部释放的p ro2cas pase23直接参与凋亡信号的转导。这样就有可能存在一个Cas pase和线粒体自身反馈的环,凋亡刺激导致线粒体细胞色素C、A IF、Cas pase释放,Cas pase的活化又促进诱发这一过程,这对于凋亡的加速和凋亡信号传递有十分重要的意义。
4 Ca spa se家族与其他调控基因
细胞凋亡受各种内外信号的影响调控,或抑制或诱导细胞凋亡,Bcl22是凋亡研究中最受重视的癌基因之一。目前已知的其同源蛋白至少有15种,每种同源蛋白至少包含一种Bcl22家族共有同源序列(BH12BH4),根据其结构和功能不同可将其分为两大类:前凋亡蛋白(p ro2 apop totic p rotein,又称为凋亡蛋白)和抗凋亡蛋白(anti2 apop totic p ro tein)。绝大多数抑制凋亡蛋白包含BH1和BH2两个保守区域,其中与Bcl22高度同源的含有HB1～BH4四个保守区域,其中促凋亡蛋白共同含有BH3结构域残基[12]。Bcl22基因是该家族抑制凋亡的代表,主要分布在线粒体外膜的浆膜面、内质网及核膜上,具有稳定线粒体膜的功能,阻止线粒体释放Cas pase及活化因子A IF、细胞色素C等。Bcl22可作用于PT孔的有关蛋白,阻止PT孔的开放,维持△7m。有研究表明Cas pase23能裂解Bcl22蛋白,在体外从过表达Cas pase23的细胞中发现Fas配体诱导细胞凋亡时,Cas pase能在Bcl22蛋白环状区域(l oop di m ain)的A s p34处裂解Bcl22蛋白。Bcl22C 末端产物能触发细胞凋亡,裂解产物或进一步激活下游的Cas pase,并导致Cas pase级联反应放大。促凋亡蛋白Bax含有BH1到BH3三个结构域,它分布在线粒体外膜上,可直接和线粒体膜结合形成线粒体跨膜通道促进细胞色素C释放;B id蛋白仅含有一个单独的BH3结构,它存在于活细胞的胞浆部分呈一种无活性的前体状态,是Fas细胞凋亡信号通路中的一种特异性底物。被死亡受体Fas、TN F激活的Cas pase28可切割Bcl22家族的B id,裸露的C末端可结合在线粒体上导致释放细胞色素C, B id经Cas pase28切割放大Fas TN F细胞凋亡信号。胞质内的B id保存其全长,而经修剪后的tB id能将细胞凋亡信号自胞质传递至线粒体使之释放细胞色素C[13]。
除了Bcl22家族对Cas pase蛋白酶起作用外,其他参与细胞凋亡的基因如p53、p35、c2m yc、m dm2等以及端粒也参与Cas pase蛋白酶的调控。p53基因稳定染色体DNA,当DNA损伤如受到辐射时,p53便转录表达修复DNA或是诱导细胞凋亡。研究发现Cas pase也参与p53介导的凋亡信号传导,Fuch s等[14]发现放射损伤引起的小鼠胸腺细胞凋亡时,p53依赖于Cas pase23的活化,且这种放射损伤作用可用特异性抑制剂A c2D EVD2CHO阻止。Gao等报告[15]Fas缺乏的l p r小鼠对Χ2射线诱导的p53依赖的凋亡仍然敏感,表明p53诱导的凋亡不包含Fas路径的激活,但Cas pase激活是必须的。p35是杆状病毒编码的蛋白,能抑制昆虫、线虫和哺乳动物细胞的凋亡,p35阻断细胞凋亡机制在于与Cas pase家族成员(包括Cas pase21、Cas pase22、Cas pase23、Cas pase24)形成p352 Cas pase复合体,从而抑制Cas pase催化活性。m dm2蛋白能负调节p53蛋白的功能,抑制p53蛋白诱导的细胞凋亡,有研究表明活化的Cas pase能裂解m dm2蛋白,导致在凋亡的细胞中检验不到m dm2蛋白。c2m yc蛋白是一种转录调节因子,与细胞增值、分化、凋亡有密切关系。在c2m yc诱导的细胞凋亡过程中,可见Cas pase23进入活化状态,当其选择性抑制时,能部分抑制c2m yc诱导的细胞凋亡,说明Cas pase蛋白酶家族,尤其是Cas pase23参与c2 m yc介导的细胞凋亡途径[16]。另外,还有一系列蛋白称为凋亡抑制因子(inh ibito rs of apop tosis,I A P)同样具有直接的阻止凋亡作用,I A P与Cas pase蛋白酶结合可使后者失活,一些病毒在细胞中复制和传播就是靠I A P使宿主细胞永生的。研究者还发现目前在哺乳动物中至少有5种以上的I A P。尽管染色体的断裂可以导致细胞凋亡的发生,但正常细胞有丝分裂染色体复制过程中,染色体末端端粒的缩短并不诱导细胞凋亡,其机制被认为与端粒重要序列结合因子22(TR F22)有关。正常情况下TR F2 2具有维持端粒完整性的功能。最近Karlseder等[17]发现TR F22的丧失将导致p53的激活而诱导细胞凋亡的发生。
5 Ca spa se对癌症和其它疾病防治的可能性
肿瘤细胞的生物学特性是异常增殖和永生化,常常
表现为凋亡不足,怎样通过激活Cas pase酶系统或活化死亡受体启动Cas pase系统促进肿瘤细胞的凋亡,这是值得研究的问题。首先应了解某种肿瘤细胞启动的Cas2 pase酶系统和正常细胞死亡Cas pase酶系统的差异,以便选择性激发肿瘤细胞的Cas pase系统。化疗和放疗可诱导肿瘤细胞凋亡,目前肿瘤化疗存在的两个主要问题是化疗药物对正常细胞的毒性作用及肿瘤细胞的耐药性。T hornberry等[6]提出了针对耐药肿瘤细胞的策略,耐药肿瘤细胞凋亡诱导的失败,是由于导致Cas pase活化的信号传导通路的缺陷(凋亡拮抗事件,如p53突变或Bcl22的过度表达)。治疗策略在于绕过这些缺陷,方法一是激活死亡受体复合物并进而活化相应的启动Cas pases (如Cas pase28);方法二即绕过凋亡通路的缺陷部分,使化疗或癌基因转化所触发的信号得到恢复,已观察到癌基因转化可使细胞周期失调、Cas pase活化而导致凋亡,癌基因只有在转化后才成为细胞的凋亡信号。另外美国耶鲁大学医学院A ltieri等发现所有癌细胞都大量含有一种叫生存蛋白(survivin)的蛋白质,该蛋白质的结构与I A P具有同源性[18]。生存蛋白有抑制Cas pase和细胞凋亡的作用,它的表达水平和5年生存率呈负相关[19]。如果能够找到使生存蛋白失活的途径,就可以使癌细胞对诸如放疗、化疗的方法更敏感,也就更容易以此诱导癌细胞死亡。
对于那些不适应细胞凋亡引起的疾病,可以通过抑制Cas pase的激活来拯救濒死的细胞。Roberts on等发现诱导受损的大鼠脑组织产生较多的I A P将可以减少脑细胞的死亡;Steller等证实,如果将诱导患色素性视网膜炎的果蝇细胞产生更多的p35蛋白2Cas pases的抑制物,可以使这些细胞逃脱凋亡的命运,继续发挥正常功能[18]。目前已知与凋亡有关的疾病主要有以下几类:①脑缺血神经细胞凋亡,如新生儿窒息、老年脑缺血、老年痴呆症[20];②过度凋亡所导致的疾病,如神经系统退行性病变、视网膜退行性病变、移植排斥、全身免疫性疾病等[7];③心肌缺血、心肌梗死,在急性条件下,心肌纤维多为坏死,有些缓慢发现的心肌缺血可产生心肌细胞凋亡。以上研究表明Cas pase的激活与抑制在防治某些疾病方面有巨大的潜力。
6 展望
在过去的几年里,凋亡的基础研究已取得了巨大的进展,认识到Cas pase家族是细胞凋亡调控的关键分子群,他们通过切断与周围细胞的联络,重组细胞骨架,关闭DNA复制和修复,破坏DNA和核结构,诱导凋亡小体的形成等。明确其机制及调控过程,无疑是防治肿瘤和其它疾病研究的重要方面。相信随着对Cas pase系统研究的深入,Cas pase上游基因和下游的作用底物及各种协作因子将一一被阐明,促Cas pase因子和拮抗因子将制成药品推向市场,对有关疾病产生细胞凋亡独特机制的深入了解,有可能用于某种肿瘤和某种疾病的治疗,从而开辟基因治疗的新领域。
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