棉铃虫3种蜕皮相关基因的RNA干扰效应比较
南京农业大学学报 2014,37(1):81-86http ://https://www.wendangku.net/doc/8b13470279.html, Journal of Nanjing Agricultural University doi :==================================================================================================================================================================10.7685/j.issn.1000-2030.2014.01.014收稿日期:2013-03-29
基金项目:国家自然科学基金重点项目(30771428)
作者简介:杨静,博士研究生三*通信作者:韩召军,教授,主要从事昆虫毒理学二昆虫生物化学和分子生物学研究,Tel :025-********,E?mail :zjhan@https://www.wendangku.net/doc/8b13470279.html, 三
杨静,韩召军.棉铃虫3种蜕皮相关基因的RNA 干扰效应比较[J ].南京农业大学学报,2014,37(1):81-86
棉铃虫3种蜕皮相关基因的RNA 干扰效应比较
杨静,韩召军*
(南京农业大学植物保护学院/农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室,江苏南京210095)
摘要:利用表达dsRNA 的细菌液连续喂食棉铃虫,比较热激同源蛋白70基因(Hsc70)二几丁质酶基因(Chi )和蜕皮激素受体基因(EcR )的沉默效应三结果表明:dsHsc70处理后试虫热激同源蛋白70基因的表达量为对照的115%,无显著差异,试虫的生长发育也没有显著变化三但dsChi 和dsEcR 处理后,棉铃虫几丁质酶和蜕皮激素受体基因的表达量分别下降到对照的37.2%和80.3%,且化蛹成功率也显著降低,分别为对照的53.2%和79.1%三此外,dsChi 处理棉铃虫的体质量增长缓慢,幼虫死亡率(49.3%)显著高于对照(11.1%),但发育异常率没有显著变化三而dsEcR 处理试虫的发育异常率(14.6%)显著高于对照(2.8%),但体质量增长速率和幼虫死亡率与对照没有显著差异三综合分析表明,在RNA 干扰研究中,并不是所有的被干扰基因都会表现出明显的沉默效应三因此,为了获得显著的沉默效应,靶基因的选择至关重要三本研究表明:棉铃虫几丁质酶基因较其他两种基因更适合作为研究RNAi 防治害虫的靶基因三
关键词:表达dsRNA 细菌液;几丁质酶;蜕皮激素受体;热激同源蛋白70
中图分类号:Q9651.9 文献标志码:A 文章编号:1000-2030(2014)01-0081-06
Comparison of silencing effect of three ecdysis involved genes in cotton bollworm ,Helicoverpa armigera
YANG Jing ,HAN Zhaojun *
(College of Plant Protection /Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests ,Ministry of Education ,Nanjing Agricultural University ,Nanjing 210095,China )Abstract :With continuous ingestion of bacteria fumigation ,dsRNAs targeting at three different genes were compared for their RNAi
efficiency on phenotypes of cotton bollworm.It was found that ingestion of bacteria expressing dsHsc70(heat shock cognate protein 70)did not inhibit the expression of Hsc70(115%as compared with the control ).The morphology and development of the treated larvae had no significant difference either as compared with the control.However ,when ingesting bacteria expressing dsChi (chitinase )or dsEcR (ecdysone receptor ),the expression of the corresponding target gene was depressed to only 37.2%and 80.3%,respectively ,and the successful pupation rates of the treated larvae decreased to 53.2%and 79.1%of the control.Furthermore ,it was found that feeding bacteria expressing dsChi resulted in higher mortality (49.3%)as compared with the control (11.1%),but had no obvious effect on the abnormal development of test larvae.To the contrary ,feeding bacteria expressing dsEcR enhanced significantly abnormal development (14.6%)as compared with the control (2.8%),but no obvious changes in larva body weight and mortality was observed.Therefore ,it is not all dsRNA targeting at any genes that could result in phenotypical RNAi.The target gene was the key element for silencing effect.Our results proved that as target genes for further study on pest control with RNAi ,Chi was more suitable than the other two genes.Key words :bacteria expressing dsRNA ;chitinase ;ecdysone receptor ;heat shock cognate protein 70
害虫基因干扰的研究揭示了害虫防控的新途径[1-2]三从安全性角度考虑,目前已经报道的可以产生明显毒理学效应的昆虫靶基因主要分为两类:一类是在脊椎动物和无脊椎动物中都存在的维持细胞存活和代谢所必需的基因,如液泡ATP 酶二肌动蛋白二羧酸酯酶和细胞色素P450等基因[1-4];另一类则为无脊椎动物所特有的基因,如几丁质合成酶二蜕皮激素受体二精氨酸激酶二信息素结合蛋白和几丁质酶等基因[3,5-9]三一般认为后一类基因具有更高的靶标生物专一性,其中不乏现行杀虫剂的靶标基因,尤其是一些蜕皮变态相关基因的沉默效应,得到了广泛关注[5,8,10-11]三
28
南 京 农 业 大 学 学 报第37卷棉铃虫(Helicoverpa armigera)是棉花蕾铃期重要钻蛀性害虫,但目前已有的关于棉铃虫基因干扰的研究报道主要集中在细胞色素P450CYP6AE14二乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase)二氨肽酶N (aminopeptidase N)等代谢和杀虫剂靶标基因上,与蜕皮变态有关的基因沉默在棉铃虫活体中还未见有成功的报道[2,12-14]三为此本研究选择了几丁质酶二蜕皮激素受体和热激同源蛋白70这3个蜕皮相关的基因进行比较研究三
几丁质酶在昆虫蜕皮二围食膜碎片的消化以及含几丁质食物的分解过程中起着重要的作用,对昆虫的正常生长发育至关重要[15-19]三蜕皮激素受体可以与蜕皮激素和超气门蛋白结合形成激素受体复合体,是启动蜕皮反应控制生长发育的关键组分[10,20-23]三热激同源蛋白是一类不同生物体内广泛分布的重要分子伴侣,不仅可以保护功能蛋白,提高昆虫的抗逆性,研究还发现热激同源蛋白70与超气门蛋白结合,参与蜕皮激素的生长发育调控[14]三本研究通过喂食表达dsRNA的细菌液分别诱导棉铃虫几丁质酶二蜕皮激素受体和热激同源蛋白70基因的沉默,一方面可以比较不同基因的沉默效率,另一方面也可以筛选高效干扰基因,为开发棉铃虫高新防控技术提供靶基因三
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
供试棉铃虫最初采自江苏省南京市的大田棉花植株上,随后在养虫室内用人工饲料饲养,饲养条件为温度25℃,相对湿度70%,光/暗为14h/10h三本研究选择初孵幼虫为试虫进行试验研究三
1.2 主要试剂和仪器设备
Ex Taq DNA聚合酶为宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)产品;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit为美国Axygen公司产品;T4DNA连接酶二限制性核酸内切酶和去磷酸化酶为Fermentas公司产品;Plasmid Mini Kit为Omega公司产品;其他常规生化试剂购自南京基天生物技术有限公司和南京生兴生物技术有限公司三PCR引物合成和测序由上海Invitrogen公司完成三凝胶成像系统Gel Doc2000,美国Bio?Rad公司;PTC-200热循环仪,美国MJ Research公司;恒温金属浴,杭州博日科技有限公司三
1.3 目标基因dsRNA表达载体的构建和验证
将质粒pET?30a(+)改造为具有2个T7启动子和2个T7终止子的dsRNA表达载体,命名为pET?2P[24]三
以棉铃虫cDNA第1条链为模板,设计特异性引物进行片段的克隆三克隆几丁质酶基因(Chi)二蜕皮激素受体基因(EcR)和热激同源蛋白70基因(Hsc70)所使用的引物分别为:Chi?F:5′?TTGGATTGGGAG?TACCCTGGT?3′,Chi?R:5′?CCAGCCTCCTTGTTGATGTAA?3′;EcR?F:5′?GCTGGTATAACAACGGAGGA?3′, EcR?R:5′?AGCTGGAGACAACTC?CTCACG?3′[14];Hsc70?F:5′?GCGTAACACCACCATCCC?3′,Hsc70?R:5′?CT?GCTTCTCGTCCTCAGTCC?3′[14]三
另外,克隆绿色荧光蛋白基因(EGFP)片段,作为棉铃虫基因沉默试验的对照基因三引物序列为: EGFP?F:5′?AAGTTCAGCGTGTCCG?3′,EGFP?R:5′?CACCTTGATGCCGTTC?3′三
利用获得的棉铃虫几丁质酶二蜕皮激素受体二热激同源蛋白和绿色荧光蛋白基因片段Chi二EcR二Hsc70和EGFP,构建表达dsChi二dsEcR二dsHsc70和dsEGFP的表达载体pET?2P?Chi二pET?2P?EcR二pET?2P?Hsc70和pET?2P?EGFP三
将构建好的质粒表达载体使用标准方法转化到HT115(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,单克隆在含有100μg四mL-1卡那霉素和12.5μg四mL-1四环素的LB培养基中,37℃二250r四min-1震荡培养14h三将细菌发酵液按照1∶100的体积比接种到LB液体培养基中三当D600=0.4时,加入IPTG至终浓度为0.25 mmol四L-1,在37℃条件下继续发酵5h三取2mL细菌发酵液,离心收集菌体并按照吕东等[24]的方法验证dsRNA的表达三
1.4 细菌液喂食试验
取100mL表达dsRNA的大肠杆菌新鲜发酵液,离心后弃上清液,加入新的LB培养基悬浮细菌至20mL,制成5倍细菌浓缩液三
将棉铃虫人工饲料切成10mm见方的小块,每一小块人工饲料放到12孔板的一个孔中,压平整,使其覆盖孔的底部,每块饲料的表面覆盖100μL表达dsRNA的浓缩细菌液,接种初孵幼虫,每天更换饲料
第1期杨静,等:棉铃虫3种蜕皮相关基因的RNA 干扰效应比较和细菌液,直至化蛹三每试验处理48头幼虫,每组试验重复3次三处理组分别为喂食表达dsChi 二dsEcR
和dsHsc70的细菌液,对照组喂食表达dsEGFP 的细菌液或超纯水(ddH 2O )三
1.5 沉默效应观察指标二观察方法和数据统计方法1.5.1 目标基因表达量分析 在使用表达dsRNA 的细菌液处理5d 后,从每处理组中取7~10头试虫,提取总RNA ,反转录获得cDNA 第1条链,以延伸因子(EF )为内参基因,用实时定量PCR 检测目标基因表达量的变化三不同基因实时定量PCR 所使用的上下游引物为:Chi ?q?F :5′?TCTTTCCTCTT?CGCAATGAATCAC?3′,Chi ?q?R :5′?CAGCCTAAACATCACAAACCTACC?3′;EcR ?q?F :5′?GATATGCCGTTC?CGTCAGATTACC?3′,EcR ?q?R :5′?GCCACTCGCAACATCATCACC?3′;Hsc70?q?F :5′?CGACTGCTGCTGCGA?TTGC?3′,Hsc70?q?R :5′?CGAAGTCCTCTCCTCCCAAGTG?3′;EF ?q?F :5′?AATTGCCCGTCAGTACGA?3′,EF ?q?
R :5′?TGAGCTTCTCATTGAGGA?3′[25]三被测目标基因表达量采用2-ΔΔC T 方法计算[26],具体公式为:ΔΔC T =(C T 目标基因-C T 内参基因)干扰组-(C T 目标基因-C T 内参基因)对照组
目标基因表达量=2((C T 目标基因-C T 内参基因)对照组-(C T 目标基因-C T 内参基因)干扰组)
在获得dsEGFP 处理的对照组的目标基因相对表达量和干扰组的目标基因相对表达量后,计算处理
组表达量占对照组的比值作为评价沉默效应的参数三1.5.2 基因沉默表型效应测定方法 每天更换饲料和菌液时,检查各处理组试虫,统计处理后到试虫化蛹前不同处理组的幼虫累计死亡率;统计累计化蛹成功个体数,计算各处理组处理试虫的化蛹成功率;记录各处理组试虫的累计发育异常个体数(发育异常包括发育停滞二幼虫畸形和蛹畸形),计算各处理组处理试虫的发育异常率三同时在不同处理组中随机挑选一块12孔板中的试虫,从处理后的第5天到第15
天,隔1天称一次体质量(期间死亡的幼虫不再称量),并记录统计基因沉默对试虫体质量的影响三1.5.3 数据统计方法 试验所得数据采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析,如差异显著,则用Turkey 法再进行两两分析三2
结果与分析
图1 棉铃虫喂食表达不同基因dsRNA 细菌液对靶基因表达量的影响Fig.1 The target gene expression level in Helicoverpa armigera ingesting bacteria expressing dsRNA targeting on different genes *P <0.05,n =3.The same as follows.
2.1 喂食表达dsRNA 的细菌液后目标基因的表达量
用表达几丁质酶二蜕皮激素受体和热激同源蛋白70基因dsRNA 的细菌液喂食处理5d 后,检测各目标基因表达量的变化三如图1所示,喂食表达dsChi 和dsEcR 细菌液的棉铃虫相应基因的表达量与对照相比均有显著下降,但是下降的程度不同,分别下降到对照
的37.2%和80.3%三而喂食表达dsHsc70细菌液的棉
铃虫,其Hsc70基因的表达量(115%)与对照没有显著
差异,且重复之间的表达量差异较大,表明本研究所用
的dsHsc70不能沉默靶基因Hsc70三2.2 喂食不同dsRNA 表达菌液对试虫体质量的影响
如表1所示,随着喂食时间的延长,喂食表达dsChi 细菌液的试虫体质量与对照组试虫体质量的比值不断下降,从第11天开始,与对照有显著差异;喂食
到第15天,体质量下降到仅为对照的29.2%,时间越
长,沉默效应越显著,说明Chi 基因的沉默对棉铃虫的生长发育具有很强的抑制作用三其他处理组的试虫体质量由高到低依次是水处理组二dsEGFP 菌液对照组二dsHsc70菌液处理组和dsEcR 菌液处理组,其中喂食dsEcR 菌液处理组试虫体质量在第11和13天达到显著差异,其余虽表现出一定的差异,但统计上差异不显著,而且均没有时间变化趋势,这表明喂食这些dsRNA 表达细菌对试虫体质量的影响不显著三
38
南 京 农 业 大 学 学 报第37卷表1 喂食不同dsRNA表达菌液对棉铃虫体质量增长的影响(n=9~12)
Table1 Effect of ingesting bacteria expressing different dsRNA on the increase of
body weight of H.armigera in time course
指标
Item处理
Treatment处理时间/d Treatment time
579111315体质量/mg dsChi16.6±5.0217.5±4.2921.4±6.7224.8±7.7036.5±13.8059.5±37.30 Body weight dsEcR16.7±1.9419.3±2.3328.4±3.3738.6±8.3678.6±27.30164.6±35.20 (?x±SD)dsHsc7018.3±5.9722.0±6.5730.8±7.2058.5±12.50108.0±18.80193.0±31.30
ddH2O22.7±5.9232.3±8.3934.5±10.7049.1±13.1094.2±28.60227.0±102.00
dsEGFP21.1±7.1923.5±8.7531.1±11.7044.8±20.0088.2±34.80204.0±99.00
相对比率dsChi0.7820.7460.6880.554a0.414a0.292a
Rate related to dsEcR0.7860.8230.9110.862ab0.891b0.807b
control dsHsc700.8620.9380.990 1.310c 1.220c0.974b
ddH2O 1.070 1.370 1.110 1.100c 1.070c 1.110b
dsEGFP 1.000 1.000 1.000 1.000c 1.000c 1.000b
注:不同上标字母表示同列数据差异显著(P<0.05)三Different letters marked mean significant difference among the column(P<0.05).
2.3 喂食不同dsRNA表达细菌对试虫化蛹成功率的影响
如图2所示,喂食表达dsChi和dsEcR细菌液的试虫化蛹成功率分别为45.8%和68.1%,显著低于对照组试虫(喂食dsEGFP)的化蛹成功率86.1%;而喂食dsHsc70细菌液的处理组和超纯水处理组的化蛹成功率分别为85.4%和93.1%,与对照组相比没有显著差异三这表明干扰几丁质酶基因和蜕皮激素受体基因均可显著降低棉铃虫的化蛹率,但干扰热激同源蛋白70基因,或水和棉铃虫无关基因dsRNA对棉铃虫正常化蛹都没有显著影响
三
图2 连续喂食表达不同dsRNA细菌液的
棉铃虫化蛹成功率
Fig.2 The successful pupation rate of H.armigera ingesting bacteria expressing different
dsRNA
图3 连续喂食表达不同dsRNA细菌液的
棉铃虫发育异常率
Fig.3 The abnormal development rate of H.armigera ingesting bacteria expressing different
dsRNA
图4 连续喂食表达不同dsRNA细菌液的
棉铃虫幼虫死亡率
Fig.4 The larva mortality rate of H.armigera ingesting bacteria expressing different dsRNA
2.4 喂食细菌液后试虫发育异常率和幼虫死亡率的分析
为了分析处理试虫化蛹率降低的原因,统计了
连续喂食表达不同dsRNA的细菌液后,试虫的发育
异常率和幼虫的死亡率三图3显示,喂食dsEcR细
菌液的试虫发育异常率为14.6%,显著高于对照组2.8%三而喂食表达其他dsRNA细菌液棉铃虫的发育异常率与对照相比并没有显著性变化三
图4显示,喂食表达dsChi细菌液的试虫幼虫死
亡率为49.3%,显著高于对照11.1%三而喂食表达
其他dsRNA细菌液的试虫与对照相比幼虫死亡率
并没有显著性差异三
上述结果表明,干扰蜕皮激素受体基因会对棉
铃虫产生较为显著的致畸作用,而干扰几丁质酶基
因会对棉铃虫产生较高的致死效应三
48
58 第1期杨静,等:棉铃虫3种蜕皮相关基因的RNA干扰效应比较
3摇讨论
本研究利用3种重要功能基因构建效应dsRNA,并以dsEGFP和超纯水为对照,就棉铃虫基因干扰的毒理学效应进行了研究,结果发现,干扰棉铃虫几丁质酶基因和蜕皮激素受体基因,都可以使体内靶基因表达量显著下降,并且出现幼虫死亡率和发育畸形率升高等毒理学表型效应三目前,不同昆虫几丁质酶和蜕皮激素受体的基因干扰已有一些研究报道,在赤拟谷盗二欧洲玉米螟和德国小蠊中分别发现,干扰几丁质酶和蜕皮激素受体基因可以导致明显的生理功能障碍[10,15-16,22]三由此我们认为,几丁质酶和蜕皮激素受体基因可以作为研究害虫防治的靶基因三
另一方面,本研究发现用同样的方法和相同菌液剂量的dsRNA干扰不同基因,其干扰效率明显不同三干扰棉铃虫几丁质酶基因的沉默效果最好,可以使靶基因的表达量下降62.8%,干扰棉铃虫蜕皮激素受体基因仅使表达量下降19.7%,而干扰Hsc70基因,表达量却没有产生显著的变化三这一结果与Baum 等[1]在2007年的研究结果是一致的,他们通过基因筛查,从玉米根叶甲的290个潜在靶基因中,只筛选出了14个能产生较高基因沉默效应的靶基因,这充分表明在昆虫RNAi研究中,必须通过筛选才能得到基因沉默效率比较高的靶基因三
此外,本研究还发现Chi基因的沉默会对棉铃虫产生较高的致死作用,而EcR基因的沉默则对棉铃虫产生了较高的致畸作用三几丁质酶主要参与昆虫体内几丁质的代谢,与幼虫的生存和生长关系重大三而蜕皮激素受体主要参与蜕皮启动,直接影响昆虫的蜕皮和变态三因此,本研究表明基因沉默的表型反应与靶基因的生理功能有关三对赤拟谷盗的RNAi研究表明,几丁质合成酶基因CHS1和CHS2在昆虫表皮形成和围食膜形成过程中起到了重要的作用,其中CHS1在外表皮形成过程中起到了重要的作用,CHS2则作用于几丁质在围食膜中的沉淀[27]三而另外的研究表明,沉默德国小蠊的蜕皮激素受体基因BgEcR和BgRXR/USP以及BgHR3和BgFTZ-F1,蜕皮过程被破坏,蜕皮不完全,沉默BgE75基因削弱了皮层溶离[10,28]三表明,即使沉默同一基因家族的不同基因也会产生不同的表型反应,RNA干扰的表型反应直接揭示了靶基因的生理功能三
已有报道表明,利用培养液加dsRNA的方法,在棉铃虫的表皮细胞系中可以成功干扰棉铃虫Hsc70基因[14]三但本研究发现喂食表达dsHsc70的细菌液对棉铃虫Hsc70基因的表达量没有影响,试虫也没有产生任何明显的表型反应三由于昆虫活体基因干扰的操作方法明显不同于培养细胞的基因干扰,喂食试虫菌液进行dsRNA递送的效率可能较dsRNA溶液直接浸泡昆虫细胞低三此外,本研究虽然使用了同等剂量的细菌液,但由于不同基因在细菌中的表达效率不尽相同,故试虫摄入的dsRNA也可能存在一定差异三由此表明,虽然目前的研究结果尚不能肯定活体喂食菌液干扰Hsc70基因无效,但至少可以表明,常规菌液饲喂法沉默Hsc70基因的效率显著低于沉默Chi和EcR基因三
综上所述,在棉铃虫中不同基因的dsRNA对靶基因的沉默效应同样不一定相同,沉默是否产生致死或畸形等表型反应与靶基因的功能有关三本研究发现喂食菌液沉默棉铃虫的几丁质酶和蜕皮激素受体基因均能抑制靶基因的表达,影响棉铃虫发育并产生显著的致死二致畸等毒理学效应,其中干扰几丁质酶的毒理学效应更为突出三这一结果为利用植物介导的RNA干扰防治害虫提供了基因资源,有望促进转基因育种和无公害植保技术水平的提高三
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责任编辑:夏爱红