RNA提取原理及步骤

细菌总RNA提取

一、TRIzol溶液提取细胞总RNA实验原理

1. TRIzol溶液的成分及作用:苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉等。其中苯酚可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，8－羟基喹啉（可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用）、异硫氰酸胍（是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离）、β-巯基乙醇（主要作用是破坏RNase 蛋白质中的二硫键）。因此内源和外源RNase（RNA酶）受抑制，在样品裂解或匀浆过程中，TRIZOL能保持RNA完整性。

2. 提取原理：细胞用TRIzol溶液裂解后，加入氯仿后溶液分为水相和有机相，RNA在水相中（上层）、中层为DNA、下层为粉色的蛋白质层。之后将水相取出，用异丙醇或者无水乙醇沉淀回收RNA。RNA沉淀用70%的乙醇进行漂洗，最后加ddH2O溶解。

二、实验步骤

1.取一只2mL离心管，加入大肠杆菌培养液0.7ml，10,000 rpm离心2 min，倒掉上清液。

2.加入2mL TRIzol溶液, 至菌体彻底悬浮并彻底裂解。之后，在室温下放置5min,使核酸蛋白质彻底分离。

3.往管中加入0.4ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15sec,之后在室温放置3min。

4.4℃,13000rmp,离心15min。取出后，可见样品分成三层，RNA在水相中（上层）、中层为DNA、下层为粉色的蛋白质。

5.将上层水相小心取出（约0.5ml）,加入1.5ml离心管中，往管中加入等体积的异丙醇。室温下在室温放置5min。

6. 4℃,13000rmp,离心10min。离心后，可见管底见胶装沉淀。

7.加入2ml 70%乙醇洗涤沉淀，之后倒出液体，注意不要将沉淀倒出，若沉淀松动，可稍离心。

8.用黄色枪头将剩余液体全部吸出后，往管中加入25μl ddH2O,彻底溶解RNA。

9.电泳检测RNA以及昨天实验的DNA。各取8μl样品与2μl loading buffer 混匀，点样。