金标渗滤法快速检测曼氏裂头蚴病患者血清IgG
３２０中国人兽共患病学报
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｎｏｓｅｓ
２００８．２４（４）
价值。
１材料与方法
１．１试剂氯金酸为上海试剂一厂产品；葡萄球菌Ａ蛋白（ＳＰＡ）为Ｓｉｇｍａ公司产品；牛血清白蛋白和Ｔｒｉｓ均为Ａｍｒｅｓｃｏ产品（电泳级）。辣根过氧化物酶标记的羊抗人ＩｇＧ为ＢｏｓｔａｒＩｎｅ产品。
１．２垂直流渗滤装置分塑料小盒、吸水垫料和硝酸纤维素膜３部份。塑料小盒委托浙江省余姚塑料厂加工；硝酸纤维素膜（ＮＣ）孔径为０．４５肚ｍ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆ＳｃｈｕｅｌｌＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．）。
１．３抗原从自然感染的蛙中分离、收集裂头蚴，经口感染ＩＣＲ小鼠，每鼠５条。于感染后第８ｗｋ剖杀小鼠，从皮下、腹腔、肌肉组织等分离、收集裂头蚴，用灭菌ＰＢＳ（ＰＨ７．４，０．０２ｍｏｌ／Ｌ）洗涤３次。碾磨后用ＰＢＳ配制成１％（ｗ／ｖ）匀浆，反复冻融３次，超声粉碎，再置４℃冷浸２ｄ，经４５０００９离心６０ｍｉｎ，收集上清液即为裂头蚴可溶性抗原（ＰＳＡ）。用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定ＰＳＡ蛋白浓度为４ｍｇ／ｍＬ。囊虫囊液抗原、肺吸虫成虫抗原、血吸虫虫卵抗原、华支睾吸虫成虫抗原、旋毛虫及广州管圆线虫成虫抗原制备及点样浓度选择按本室常规方法进行。
１．４血清样本曼氏裂头蚴病病人血清共２５份，其中２１份由韩国国立首尔大学医学院蔡锺一教授惠赠，４份为门诊病人血清。诊断标准：有曼氏裂头蚴病相关临床表现，ＥＬＩＳＡ检测抗体阳性并且有生食或半生食蛇、蛙（蝌蚪），或用蛙肉贴敷创口等流行病学史，或者组织活检发现曼氏裂头蚴虫体；１００份健康人血清，为杭州市知识分子体检人群血清；囊虫病病人血清４０份，由河南省囊虫病治疗中心提供；３０份旋毛虫病病人血清，采自云南流行区暴发感染
图１ＤＩＧＦＡ检测结果判读
１．１：检测阳性；１．２：检测阴性；１．３：检测无效Ｆｉｇ．１ＥｘａｍｐｌｅｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｗｉｔｈＤＩＧＦＡ
１．１：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；１．２：Ｎｅｇａｔｉｖｅ；１．３：ｉｎｖａｌｉｄ１．６ＥＬＩＳＡ检测用ｐＨ９．６碳酸盐缓冲液稀释
抗原（１０ｐｔｇ／ｍＬ），按ＩＯＯｔＬＬ／孑Ｌ包被酶标条，置４℃冰箱孵育过夜。．用ｐＨ７．６ＰＢＳＴ洗涤３次，加待检血清（１ｓ２００稀释，ｌｏｏ弘Ｌ／孔），３７。Ｃ孵育３０ｍｉｎ；洗涤３次后加羊抗人ＩｇＧ酶结合物（１：１６０００稀人群；２５份肺吸虫病病人血清，其中２０例为痰检虫卵阳性，５例为ＥＬＩＳＡ检测抗体阳性并有生食或半生食溪蟹史；血吸虫病病人血清３０份，采自江西流行区粪检虫卵阳性者；２５份华支睾吸虫病病人血清采自广西粪检虫卵阳性者；２０份广州管圆线虫病病人血清，２例为病原学确诊病人，１８例为临床诊断病人；３０份结核病病人血清采自痰检菌阳肺结核病人。“７
１．５金标免疫渗滤法（ＤＩＧＦＡ）’
１．５．１胶体金标记物制备０．０１％氯金酸（ＨＡｕＣｌ。）溶液１００ｍＬ加热煮沸，搅拌下加入１％柠檬酸钠２ｍＬ，继续加热至溶液呈酒红色，冷却至室温，用０．２ｍｏｌ／ＬＫ：ＣＯ。溶液调ｐＨ值，加入适量ＳＰＡ混匀结合，加少量ＰＥＧ２００００，４～１０℃高速离心浓缩胶体金标记物，４＂－－－２０℃保存．
１．５．２抗原点样在垂直流渗滤法检测盒中央圆孔ＮＣ膜左侧点加ｌｍｇ／ｍＬ裂头蚴可溶性抗原０．５弘Ｌ，此为检测点（Ｔ），右侧点加０．２ｍｇ／ｍＬ人ＩｇＧ０．５ｐＬ为质控点（Ｃ），４－－．，２０℃保存备用。
１．５．３检测操作流程取检测盒置一平面上。中央圆孔中加洗脱液（ｐＨ７．６ＰＢＳＴ）２滴，使加样孔上的ＮＣ膜湿润；加待检血清２５肛Ｌ，待完全渗入后加洗脱液１滴，洗去未结合抗体；再加胶体金一ＳＰＡ标记物１滴，待渗入后加洗脱液２滴，肉眼判读结果。１．５．４结果判读中央圆孔ＮＣ膜上检测点（Ｔ）、质控点（ｃ）均出现红色圆点为阳性；检测点（Ｔ）点未出现红色圆点、质控点（Ｃ）点出现红色圆点为阴性Ｉ若两点均未出现红色圆点，仅留白色或淡粉色背景则为无效（见图１）。
释，ｌＯＯ／－Ｌ／孔），３７。Ｃ孵育３０ｍｉｎ；洗涤３次后加ＴＭＢ底物溶液，１００ｐｔＬ／孔。置暗盒室温孵育１０ｍｉｎ，加１滴２ｍｏｌ／ＬＨ：ＳＯ。终止反应；用酶标仪在４５０ｎｍ波长处测吸光值（Ａ值）。以５０份健康人
血清Ａ值的平均值计算阳性阈值（ｉ＋３Ｓ），大于或
金标渗滤法快速检测曼氏裂头蚴病患者血清IgG
作者：王越， 汤益， 干小仙， WANG Yue， TANG Yi， GAN Xiao-xian
作者单位：王越,干小仙,WANG Yue,GAN Xiao-xian(浙江省医学科学院寄生虫病研究所,杭州,310013)， 汤益,TANG Yi(浙江省医学科学院寄生虫病研究所,杭州,310013;杭州市疾病预防控制中
心,杭州,310006)
刊名：
中国人兽共患病学报
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ZOONOSES
年，卷(期)：2008,24(4)
被引用次数：4次
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本文读者也读过(10条)
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