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巨噬细胞提取方法

巨噬细胞提取方法
巨噬细胞提取方法

我是按照经典的方法,注射淀粉肉汤3天后腹腔灌洗得来的,培养3小时除去上清液后纯化了巨噬细胞然后加药的,培养24小时后可以看到细胞已经贴壁了,但是我发现加了LPS的组细胞悬浮的比阴性组多,这个就很奇怪了,我的LPS浓度从10ng一直到20ug/mL都有设置,但是吞噬率无一超过阴性组的。(1) 小鼠2 ml/只腹腔注射3%巯基乙醇酸钠,三天后颈椎脱臼处死小鼠,用75%乙醇浸湿3 min消毒,置超净台中;

(2)用镊子将小鼠下腹部皮肤提起,剪开一个小口,将皮肤撕开,完全暴露腹膜;

(3)用镊子提起腹膜,用10ml注射器向小鼠腹腔中注入6ml PBS缓冲液,针尖向上,避开肠和脂肪,反复回抽腹腔液,不同的方向冲洗数次,最后吸出腹腔液;

(4)将细胞悬液1000r/min条件下离心10min,用PBS液洗涤l次,用含10%的胎牛血清RPMIl-1640将细胞悬起,台盼蓝染色,当活细胞数达到95%以上时调整细胞浓度至2×106个/ml。

(5)将细胞接种到96孔细胞培养板中,每孔100μL,把细胞培养板放置于37℃5%CO2的培养箱中培养3h;

(6)3h后取出细胞培养板,清洗1次,去除未贴壁的细胞,弃去上清液,然后每孔加入100mL RPMI-1640完全培养液,此时细胞培养板孔内的贴壁细胞即为纯化以后的小鼠腹腔巨噬细胞。

按照以上述制备和纯化腹腔巨噬细胞方法处理细胞后,200μL/孔加入不同浓度的阳性药LPS,阴性对照孔加200μL培养基,放置于培养箱中,培养24 h后取出细胞板,弃上清,用PBS液200μL/孔洗3遍,加0.1%中性红溶液200μL/孔,继续于培养箱中孵育3h。取出细胞板,弃上清,用PBS液200μL/孔洗两遍后加细胞裂解液(醋酸与无水乙醇等体积混合) 200μL/孔,将96孔板放在微型振荡器上振荡10 min后,放在4℃冰箱12h过夜。将细胞板520 nm 波长处测定吸光度。按下式计算吞噬中性红增加率%=(给药孔A值一对照孔A值)/对照孔A值×100%。

细胞组织裂解(提蛋白)方法

第一种方法 蛋白匀浆缓冲液: 50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl 5 mM EDTA 1 % NP-40 1 mM PMSF 操作步骤 直接用这个进行组织匀浆 然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清 作SDS-PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。 将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。70v浓缩,150v分离 第二种方法 裂解液配方: 尿素:8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加)PMSF:1mM(现加)MiliQ 水操作步骤: 取300mg样品在液氮环境下研磨, 加入1ml裂解液混匀, 室温静置1小时(实验证明改为匀浆更好,蛋白降解轻), 15000g离心1小时, 取上清测定蛋白质浓度。 在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以

除去。建议最好加,浓度从0.5-2%不等(这取决于您样品蛋白质的难溶程度)。IPG buffer 是载体两性电解质,IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加,裂解液中没有IPG buffer可以么? (可以的,最后上胶条的时候可以再加) 不过,我觉得液氮研磨以后,最好是粗离心一下,把一些结缔组织给离心掉(150g既可)然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题,主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好) 第三种方法 建议最好加完裂解液后再用超声波破碎,我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒,间歇10秒,次数15次,一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次(因为不同的样品用一根超声柱子,可能会导致污染,所以一定要用双蒸水冲洗干净,再用70%乙醇洗一下,再用水洗一次),另外样品超声时要置于冰浴中,以免产热 做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织,最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul 测595 OD值时,设定一个只用水的空白,把所有测得的值都减去这个空白。再用减后的值做标准曲线。查得未知蛋白浓度时,也要用减后的值在标准曲线上查得。 培养细胞 细胞培养于100 mL/L FCS+RPMI1640培养基中,待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集.按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7 mol/L尿素,2 mol/L硫

巨噬细胞的原代培养

1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞,具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能,是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活2-3周多用做原代培养,不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系,大多来自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均获恶性,培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难以建株。目前,单核巨噬细胞株也有,比如RAW264.7,但价格比较贵,且保存也不方便。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞,目前以小鼠腹腔取材法最为实用,而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种,一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔,从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞,还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物(如牛血清,淀粉,糖原,脂多糖,矿物油,PRMI1640培养液等),这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗,但由于许多刺激物能激活巨噬细胞,而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物,有此得到的巨噬细胞培养用于培养时,细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中,影响细胞代谢,同时也不能很好的模拟体内环境,所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔,从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。 2试验材料 昆明种小鼠10只体重约18g~25g(约6周龄)由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡1只 PRMI1640培养基 新生小牛血清 HEPES D-Hanks液 青霉素 链霉素 3试验仪器 无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针,试管、培养瓶(12),12孔培养板(12)等。 二氧化碳培养箱 生物显微镜 高速冷冻离心机 低温冰箱 4实验步骤 4.1细胞培养液的制备及消毒制备方法: 将RPMI1640干粉一袋,HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中,充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水,使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间,容积为1000m1。 鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。 培养液的无菌处理: (1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水,与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好,并高压灭菌。 (2)在净化室内,打开己消毒的zeiss抽滤器,将配制好的RPMI1640培养液进行过滤,开将过滤后的RPMI1640培养液分装,置入4℃冰箱中备用。

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态,台盼蓝染色计算存活率,瑞氏染色计算纯度。结果获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。 【关键词】小鼠;巨噬细胞;分离;培养;鉴定 0.引言 巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞,具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1,2] ,被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞,但这些方法大多都是繁琐、复杂,所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象,探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。 1.材料与方法 1.1实验对象 清洁级巴贝斯小鼠,体重在(30-32g),由兰州大学实验动物中心提供。 1.2实验方法 1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养 随机选取巴贝斯小鼠,腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min,静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死,至于解剖板上,无菌条件下打开腹腔,用注射器抽取腹腔液,离心5min (1000r/min),弃上清,用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液(0.1%双抗溶液)调节至2×106ml-1,接种于培养瓶及6孔板,置37℃,5%CO2培养箱培养2h,弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍,然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。 1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定 (1)台盼蓝染色计算存活率。 4%台盼蓝母液:称取4g台盼蓝,加少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100ml,用滤纸过滤,4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。(也可买Gibco的成品);

实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察

实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察 姓名:李思露 学号:131140040 一、实验目的 1.通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察,加深理解细胞吞噬作用的过程; 2.了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法 二、实验原理 吞噬作用也称为胞吞作用(cellular eating),指细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的较大固体物质(直径一般大于250mm)的过程。许多原生动物通过吞噬作用摄取营养;高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。不同动物来源的巨噬细胞或同一动物来源的不同巨噬细胞吞噬功能强弱不同,个体吞噬细胞的平均吞噬能力是机体非特异性免疫功能强弱的重要反映。 吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体,可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物,引起受体胞内区活化,进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。 内吞 内吞体 吞噬溶酶体 胞吐 巨噬细胞吞噬自身衰老凋亡细胞而不吞噬正常细胞,原因是,凋亡细胞细胞膜内侧面的磷脂酰丝氨酸反转到胞膜外侧面而被巨噬细胞模式识别受体识别。 吞噬功能一般用吞噬百分率和吞噬指数两个指标反映。 吞噬百分率=吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100%

吞噬指数=吞噬的鸡红细胞总数/吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数 三、实验材料、试剂及器材 (一)材料: 1.健康小白鼠:6-8周龄健康小白鼠,实验前1~2天,每只腹腔注射4%淀粉肉汤1mL。 2.抗凝鸡血 (二)试剂: 1.4%淀粉肉汤 2.D-Hanks液 3.0.85%生理盐水 4.180IU/mL肝素钠生理盐水溶液 (三)用品 普通光学显微镜、10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱(37℃)、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等 四、实验操作 1.巨噬细胞收集:脱颈处死小鼠;腹腔注入2mL生理盐水,揉匀;剪开腹部皮肤, 暴露腹膜;用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。 2.体外吞噬。0.3mL腹腔液+0.3mL鸡红细胞悬液,37℃吞噬。 3.制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min 制备细胞混合液临时装片,观 察现象并作图。 五、实验结果 图1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞装片(不染色) 0min15min30min45min 时 间 现 象 巨噬细胞吞噬物的变化亦具有与时间相关的特点,巨噬细胞吞噬物在形态上易于观察和检测,这些特征使得巨噬细胞在损伤时间推断过程中具有重要的法医学意义。 六、作业与思考题

巨噬细胞培养

腹腔巨噬细胞的获取和培养 1.实验目的: 掌握腹腔巨噬细胞的获取方法及其培养技术 2.实验原理: 利用巨噬细胞具有趋化运动,吞噬,分泌和参与免疫调节的功能,向成熟大鼠腹腔内注射煮沸灭菌的4%的硫代乙酸钠,使血液中的单核细胞趋化至腹腔,即巨噬细胞。硫代乙酸钠刺激后4日腹腔内巨噬细胞数量较多且其他细胞成分少(如淋巴细胞)。 3.实验器材及材料: (1)成年大鼠 (2)手术器械:解剖剪,解剖镊和止血钳 (3)其他用品:注射器,培养皿和吸管,酒精及酒精棉球等 (4)清洗液:HBSS和不含Ca和Mg的HBSS。 (5)培养液:DMEM(加10%血清) (6)细胞计数板和计数器 4.实验步骤: (1)取细胞4d前,动物腹膜腔内注射5-10ml 4%硫代乙酸钠。(2)乙醚麻醉后,拉颈处死动物,经颈总动脉放血。将动物仰置,

剪去腹壁皮毛,用70%酒精消毒。 (3)沿正中线剪开腹壁,将5-10mlHBSS注入腹膜腔,用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞。 (4)吸出腹膜腔的细胞悬液,离心(1000r/min,10min)。 (5)用培养液混悬沉淀细胞,将细胞悬液加入培养皿中,培养2h. (6)吸去培养液,用不含Ca2+和Mg2+的HBSS清洗2次,去除漂浮的细胞,得到附着于培养皿底部的巨噬细胞。 (7)采用刮取法或酶消化法取出贴壁的巨噬细胞,离心(1000r/min,10min)。用培养液混悬细胞,将细胞调整至1-3X106个/ml,继续培养或直接用于实验研究。 5.实验结果分析: (1)除巨噬细胞外,自腹膜腔洗出的细胞还含有淋巴细胞等。由于淋巴细胞不贴壁,培养2h后用HBSS清洗,可除去淋巴细胞和其他悬浮细胞。最终获得95%以上是巨噬细胞。(利用巨噬细胞贴壁能力较其他细胞强)。 (2)巨噬细胞大小约50μm,一般不分裂,在培养条件下可存活1-3周。直接从腹腔取得的巨噬细胞为静止性的,呈圆形,伪足不明显。经硫代乙酸钠刺激可获得大量的炎症性巨噬细胞,培养2h后,细胞多呈梭形并伸出伪足,即“有头有尾”,具有较强的变形运动和吞噬能力。

总蛋白的提取

1.单层贴壁细胞总蛋白的提取: (1)倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。 (2)每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 (3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。) (4 )每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 (5 )裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。) (6 )于4℃下12000rpm离心5min。(提前开离心机预冷) (7 )将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于-20℃保存。 2. 组织中总蛋白的提取: (1 )将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 (2)加400 μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中,进行匀浆。然后置于冰上。 (3 )几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。 (4)裂解30 min后,即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,然后在4℃下12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。 3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取: 由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除按(一)操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取: (1 )将培养液倒至15ml离心管中,于2500rpm离心5min。 (2 )弃上清,加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 (3)用枪洗干上清后,加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 (4)将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。 含量测定

小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取

小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取 实验动物: 6-8周的SPF级雄性BALB/C小鼠,小鼠取细胞前三天每天腹腔注射0.5-1mL淀粉肉汤,或者取细胞前一小时注射1mL淀粉肉汤。 试剂:75% 乙醇、RPMI 1640 (Gibcol/BRL,美国)、含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)步骤: 1、取6周左右的小鼠,剃去腹部的毛并消毒。 2、引颈杀死动物,手提鼠尾将全鼠浸入75%酒精中3~5秒。 3、倒立小鼠,置动物于解剖台上,固定四肢,75%酒精擦洗腹膜壁后,用9号针头5ml注射器沿腹中线将预冷的不含小牛血清的PBS5mL注入腹腔中,同时从两侧用手指揉压腹膜壁,令液体在腹腔内充分流动。轻轻按摩腹部2-3分钟,静置5-7分钟。 4、无菌条件下,剪开腹壁,双手持镊撕开皮肤拉向两侧,暴露出腹膜,但勿伤及腹膜壁。再用75%酒精擦洗腹壁。 5、用针头轻轻挑起腹壁,使动物体微倾向一侧,使腹腔中液体集于针头下吸入注射器内。小心拔出针头。把液体注入50ml离心管中。再用同样容量的PBS冲洗腹腔2~4次。合并渗出液于50 mL离心管中。直至冲洗液变澄清。 6、4℃ 250×g(1000 rpm/min)离心10min,去上清。 7、用PBS培养液洗涤细胞3次,每次4℃ 250×g(1000 rpm/min)离心10min,去上清。 8、用含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)悬浮细胞。将调整细胞浓度调整至 5×106cells/mL 加入培养皿中培养9、将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养3 h,然用37℃预温的RPMI-1640培养液清洗培养皿2-3次,去除未贴壁的细胞,即得到纯化的贴壁巨噬细胞。 种96孔板。2h细胞贴壁。换液。墨汁(时间短,可以不灭菌)染色。观察。

山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培养技术研究

安徽大学 本科毕业论文(设计、创 作) 题目:山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培养技术研 究 学生姓名:孙义学号:D3******* 院(系):生命科学学院专业:生物工程 入学时间:2012年9月 导师姓名:班谦职称/学位:博士 导师所在单位:安徽大学 完成时间:2016年5月

山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培 养技术研究 摘要 肺泡巨噬细胞是存在于肺泡中的免疫细胞,它是免疫系统的重要组成部分,肺泡巨噬细胞免疫功能非常活跃。它是肺脏抵御外来微生物侵害的第一道防线。本次实验通过研究山羊巨噬细胞的体外分离和体外培养技术,从而建立一套完整可行的巨噬细胞分离培养技术方法。人体吸入空气中的尘粒、细菌等异物进入肺泡和肺间质,多被巨噬细胞吞噬清除,在今天空气污染日趋严重的情况下,研究肺泡巨噬细胞对于免疫学和人类健康有重要的意义。而研究巨噬细胞分离培养技术将为肺泡巨噬细胞的免疫学研究奠定坚实的基础。本实验从健康无病变的羔羊肺脏灌洗液中分离肺泡巨噬细胞,加入脂多糖进行诱导刺激。实验表明,通过此次实验的方法,获得了高纯度的山羊肺泡巨噬细胞,在CO2培养箱中连续培养30天左右未发现细胞大规模死亡,LPS刺激下发现其仍具有免疫活性。为进一步通过山羊肺泡巨噬细胞进行各种致病菌导致的疾病的治疗和肺泡巨噬细胞的免疫学功能研究奠定实验基础。 关键词:肺泡巨噬细胞;分离培养;LPS;山羊。 Isolation and primary culture of goat alveolar macrophages in vitro Abstract Alveolar macrophages are present in alveolar in immune cells, it is an important part of the immune system, immune function of alveolar macrophages is very active. It is the first line of defense against microbial invasion of the lung. This experiment through study on goat macrophages in vitro isolation and in vitro culture techniques, so as to establish a complete set of feasible macrophage separation cultivation techniques. Inhaled dust particles in the air, bacteria and other foreign matter into the alveolar and interstitial lung, is phagocytosis of macrophages, in today's air pollution increasingly serious situation, study of alveolar macrophages is important for immunology and human health. And the study of macrophage isolation technology will lay a solid foundation for Immunology Study on alveolar macrophages. The separation of alveolar macrophages from healthy lamb lung lavage fluid of lesions in this experiment, With lipopolysaccharide induced stimulation. The experimental results show that through the experimental method, goat alveolar macrophages in high purity and in CO2 culture box in continuous culture about 30 days found no large-scale cell death, under the stimulation of LPS found it still has the immune activity. Study on the immunological function of further by goat alveolar macrophages were all pathogenic bacteria caused the disease treatment and alveolar macrophages lay the experimental foundation.

细胞总蛋白提取方法

细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg,超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中,待溶解后加入HCl调pH值至7.4,定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中,待细胞融合约100%,收集细胞 2)弃培养基,加入PBS 2ml清洗培养皿一次,弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml,37℃温育1min。 4)待细胞变形后,将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中,10,000rpm×3min,4℃ 5)弃上清,1ml预冷的PBS清洗沉淀,10,000rpm×

6)重复PBS清洗一次 7)弃上清,-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min,4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中(约250μl)

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察 一、实验目的 a)通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬大肠杆菌活动的观察,加深理解细胞吞噬 作用的过程; b)了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法。 二、实验原理 吞噬作用是细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的固体物质(直径一般大于250nm)的过程。 吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体,可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物,引起受体胞内区活化,进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。 许多原生动物通过吞噬作用摄取营养;高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。 三、实验仪器及试剂 a)材料:健康小白鼠:6-8周龄健康小白鼠,实验前1~2天,一部分腹腔 注射4%淀粉肉汤1mL另一部分不注射,大肠杆菌悬液。 b)试剂:4%淀粉肉汤,D-Hanks液,0.85%生理盐水,180IU/mL肝素钠生理 盐水溶液 c)普通光学显微镜、 10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱(37℃),5mL 一次性注射器、 10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等 四、实验步骤 a)巨噬细胞收集:分别用脱颈法处死一只腹腔注射4%淀粉肉汤1mL的小 鼠和一只不注射的小鼠。然后都在腹腔注入2mL生理盐水,揉匀;剪开 腹部皮肤,暴露腹膜;用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。 b)体外吞噬。在两支10mL玻璃离心管分别加入0.3mL注射淀粉肉汤的腹腔 液+0.3mL大肠杆菌悬液和0.3mL不注射淀粉肉汤的腹腔液+0.3mL大肠杆 菌悬液,放在37℃水浴锅中吞噬。 c)制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min 制备细胞混合液临 时装片,观察现象并作图。 d)在0min和45min时在两管中分别取两滴混合液滴于载玻片上,用次甲基 蓝染色5分钟后装片观察。 五、实验结果 a)0min时注射肉汤(左)与未注射肉汤(右)图片(次甲基蓝染色)

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养2013

细胞工程综合实验报告 小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 班级 xxxx 姓名 xxxx 学号 xxxxxxxxxx 指导教师 xxxx 实验时间 xxxx 成绩

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 姓名学号班级 一、实验目的 1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。 2.初步掌握培养过程中的无菌技术。 3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官,经体外培养后,直到第一次传代为止。这种培养,首先用无菌操作的方法,从动物体内取出所需的组织(或器官),经消化,分解成单个游离细胞,在人工培养下,使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长,必须满足两个基本要求:一是供给细胞存活所必须的条件,如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度,注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 巨噬细胞属天然免疫细胞,具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能,是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活2-3周多用做原代培养,不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系,大多来自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均获恶性,培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难以建株。目前,单核巨噬细胞株也有,比如RAW264.7,但价格比较贵,且保存也不方便。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞,目前以小鼠腹腔取材法最为实用,而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种,一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔,从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞,还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物(如牛血清,淀粉,糖原,脂多糖,矿物油,PRMI1640培养液等),这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗,但由于许多刺激物能激活巨噬细胞,而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物,有此得到的巨噬细胞培养用于培养时,细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中,影响细胞代谢,同时也不能很好的模拟体内环境,所以我们直接用培

巨噬细胞培养

1、实验前三天,向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml(勿注入肠内)。 2、引颈杀死动物,手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3~5秒。 3、置动物于解剖台上,用针头固定四肢,双手持镊撕开皮肤拉向两侧,暴露出腹膜, 但勿伤及腹膜壁。 4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后,用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中,同时从两侧用 手指揉压腹膜壁,令液体在腹腔内充分流动。 5、用针头轻轻挑起腹壁,使动物体微倾向一侧,使腹腔中液体集于针头下吸取入针管 内。 6、小心拔出针头,把液体注入离心管中,250g4℃离心10分钟,去上清,加10mlEagle 培养基。 7、计数细胞,每只小鼠可产生20~30×105细胞,其中90%为巨噬细胞。 8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米,需接种2.5×106/ml。 9、为纯化培养细胞,去除其它白细胞,接种数小时后,去除培养液,用Eagle液冲洗1~2 次后,再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养 小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7 1.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。我们的经验是,以0.25%胰 酶+0.02%的EDTA作为消化液。使用温至室温的消化液进行消化,消化时镜下观察,并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底,约3~5 mi n后,待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化,弃去胰酶,以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感,所以不要用吸管反复吹打细胞。该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来,所以换瓶传代就行了。看了楼主的描述,感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。 2.消化液:0.5%胰酶、0.2%EDTA,实验前加温到37度以50ml培养瓶为例:1、细胞 贴壁生长,长满瓶底80%时,弃去培养液,加D-HANKS 漂洗两次;2. 加入含胰酶和EDTA 的消化液1-2ml,消化37℃约2-5min,镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化,弃消化液加D-HANKS 漂洗两次;3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞,按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下:实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶:1、 细胞贴壁生长,长满瓶底70%时,弃去培养液,加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次;弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可,离心后去除DPBS.用DMEM 培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶;4. 入37℃5%CO2孵箱,几小时后即可再贴壁;4. 入37℃5%CO2孵箱,几小时后即可再贴壁。 4.RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短,半小时就能贴很多,刚贴壁时细胞呈圆形,折 光度很好,镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后,部分细胞会变为类似四角形,伸出伪足之类的吧。这个时候其实就是提示你注意传代了,这部分细胞如再不传代,很容易就老化掉。 5.细胞老得特别快,用DMEM培养基本上一天培养基就会变黄,需要换液,如果换液换晚了 的话细胞就感觉长融在一起细胞壁不清楚,但基本上不会有死细胞 6.小鼠的单核细胞系RAW264.7细胞(ATCC号:TIB-71)用含10% 胎牛血清(FBS,美国 GIBCO公司)的无酚红DMEM (美国Promega公司)培养液培养,其中含50 U/ml青霉素和 50 μg/ml庆大霉素。3 d换液1次,细胞汇片后, 用胰酶二乙胺四乙酸(EDTA)消化液消化 细胞,根据不同的实验目的接种于不同规格的培养板上。 7.ATCC complete growth medium:The base medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%.

细胞的总蛋白质提取全过程及经验

细胞的总蛋白质提取全 过程及经验 The manuscript was revised on the evening of 2021

细胞的总蛋白质提取全过程及经验 如果你要自己裂解细胞的时候,需要注意的事项:师兄给你的细胞要赶紧裂解,当然了,你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般我使用的时候,是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来,然后赶紧4 度下离心,用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液,这个一般都是做 western 什么用的,需要的蛋白量不是很多,而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。一般1000rpm 足够离心了,转速太快,细胞会破碎,然后会损失蛋白。PBS 洗涤的最后一遍,记得将细胞转移到超声管中,也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的能量吧,我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞,然后加入裂解液直接超声。3s 每次,间歇3s 60 次,400W,重复工作复位2 次,总共超声180 次就差不多了。裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min,超声管是没有盖子的,可以直接在上面加一层封口膜离心。在离心的时候,去配制沉淀液,丙酮:无水乙醇:冰乙酸=50:50:,体积比。一般我加的是裂解液体积的5 倍。沉淀液要预冷,我喜欢将沉淀液放在-20 度下。细胞离心后,上清液加入到沉淀液中,就会看到比较多的白色沉淀出现,-20 度沉淀>2h,然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大,一般的离心管不能用,要用 beckman 专用的那种50mL 离心管,25000g,15-30min。Beckman 离心管比较大,底部是平的,所以蛋白在底部并不是很牢固,在弃去上清液的时候,一定要注意用枪头缓慢的吸出!然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍,再用75%酒精将蛋白转移到4mL 的离心管中,当然,如果你的蛋白很少,的EP tube 也可以使用。之所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg,而冻干后的蛋白复溶后测定浓度,一般要求在5-6mg/mL 之间,所

小鼠巨噬细胞功能的检测

小鼠巨噬细胞功能的检测 伍国强 (兰州大学草业学院兰州730020) 摘要:本实验用CFA免疫小鼠后,检测小鼠腹腔巨噬细胞的数目以及用中性红检测巨噬细胞的吞噬能力。结果表明,免疫小鼠的腹腔巨噬细胞的数目和吞噬能力均有所提高。 关键词:巨噬细胞;功能;检测 1 前言 巨噬细胞是一种多功能免疫细胞,在机体的特异性和非特异性免疫反应中发挥重要功能。主要作用有:(1)吞噬杀伤作用:直接吞噬、调理吞噬作用。(2)抗原提呈作用:即外来的抗原性异物通过巨噬细胞的捕获、加工和处理后,与胞内合成的MHC-1/II类分子形成抗原肽-MHC分子复合物,并被呈递到细胞膜表面,被TCR 识别的作用。具有此作用的细胞叫抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)。此外,巨噬细胞表面还表达多种共刺激分子,如B7、ICAM-1、LFA-1,3等分别与T细胞上的CD28、LFA -1(CD11)、LFA-2(CD2)等相互作用,为T细胞的活化提供第二信号。(3)抗肿瘤作用:Mφ被某些细胞因子如IFN-γ激活后能有效杀伤肿瘤等靶细胞,其吞噬杀菌能力也显著提高。(4)分泌生物活性介质,产生免疫应答和其它免疫效应:如 IL-1,12、IFN、TNF、PGE等;以及某些补体成份和凝血因子、组织修复因子等。为了检测巨噬细胞的吞噬功能,我们用CFA免疫的小白鼠作为实验材料检测其腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用。 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 药品:生理盐水、0.6%环磷酰胺、Hank’s溶液、1640培养基、细胞裂解液、中性红等。 2.1.2 仪器:血球计数板、细胞培养箱、分光光度计等。 2.1.3 动物:小白鼠2只,由兰大医学院动物实验中心提供。 2.2、方法 2.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞制备取小白鼠2只,分为对照组和实验组,对照组注射0.1ml生理盐水,试验组注射0.1mlcFA。48小时后,小鼠眼眶放血,断颈处死。腹腔注射3ml预冷的生理盐水。吸取腹腔渗出液5ml离心管(冰浴)。1600rpm离心10 分钟,弃上清,4℃生理盐水定容至5ml。血球计数板镜下巨噬细胞计数。用生理盐水调mΦ浓度为1×106,取4ml 1600rpm 离心10分钟,弃上清加4ml 1640定悬。将mΦ加入24孔板,每组4孔,每孔1ml。37℃,5%CO2细胞培养箱贴壁培养纯化2小时。2.2.2 巨噬细胞吞噬中性红试验将贴壁纯化好的mΦ弃1640培养液,对照孔加0.5ml生理盐水,其余每孔加0.5ml0.075%中性红,继续培养1小时。倾去上清液,用温PBS 洗细胞3 次,每孔加入细胞溶解液(为体积分数50 %的乙酸和体积分数50 %的无水乙醇) 2ml ,室温下放置30分钟,待细胞溶解后,即用分光光度计测定OD值。以OD 值表示巨噬细胞功能的强弱。 3 结果与讨论表:mΦ的浓度及吸光值 mΦ细胞个数mΦ浓度 (个/ml) 0D值 对照组256 6.4×105 0.252 试验组2176 5.44×106 0.283 3.1 免疫小鼠腹腔巨噬细胞浓度从上表可以看出,用cFA免疫的小鼠腹腔巨噬

小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法

小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活2-3周,多用做原代培养,难以长期生存。 步骤 一、实验材料准备 1. 动物:各个品系的小鼠2-4只。 2. 试剂:RPMI1640培养基(含酚红),小牛血清,双抗,培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗),台盼兰等。碘酒绵球和酒精绵球。 3. 器械:一次性注射器、手术器械。 二、实验方法 如果采用刺激物,则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL,获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物,直接开始下面的步骤。 1. 拉颈处死小鼠,在75%酒精浸泡1-2分钟,移入超净台中,仰卧位固定于解剖板上,碘酒消毒腹部皮肤,酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤,暴露腹部肌层,再用

酒精绵球消毒腹部肌层。 2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔,用绵球轻揉腹部1-2 min,然后,用眼科镊稍提起腹腔,并用眼科剪剪开一个小口,用吸管吸取细胞悬液,移入离心管中(个人认为,此法比用注射器抽吸好一些)。 3. 1 000 rpm离心5 min后,用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次,再次离心,重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中,如果是作为饲养细胞使用,则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数,将细胞稀释到目的浓度后,接种即可。 4. 如果是作为饲养细胞使用,调整浓度至2x105个/mL,接种到96孔板中,每孔100-200 uL;如果作为其它实验使用,可以调整成2x106/mL,加到24孔平底培养板中,1 mL/孔;5% CO2温箱孵育2 h后,换液,并用RPMI1640培养基洗1-2次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为单层的巨噬细胞。 三、结果 巨噬细胞刚贴壁时偏圆形,或者类似鹅卵石形状,然后慢慢伸出伪足,铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性,当与细菌混合在一起的时候,在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌,因此,巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。 注意

蛋白提取实验步骤

蛋白提取实验步骤: 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞,每106细胞加250 ul RIPA (在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),振荡。如果需要提高蛋白浓度,可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA(使用前数分内加入蛋白酶抑制剂)于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶,使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下,收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取: A、组织块用冷TBS洗涤2-3次,去除血污,剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度,可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中,振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜,若不能及时提蛋白,组织标本应保存在-80℃冰箱,并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行,避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定,需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。

4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器(200μl)反复吹打,或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定(蛋白酶依旧有活性)可在-80℃短时间保存,建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存,避免反复冻融。

提取蛋白的常规方法

1、原料的选择 早年为了研究的方便,尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小,如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料, - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑,注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难,或含量 来源均理想,但分离纯化操作繁琐,反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系,如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶,马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性,对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性,用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时,原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质(本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白)时,不但 使用种属一定的原料,而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异(如饥饿时脂肪和糖类相对减少),采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验,则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分,对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎,使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织,其细胞破坏难 易不一,使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软,作普通匀浆器磨研即 可,肌肉及心组织较韧,需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有:①高速组织捣碎机(转速可达 10000rpm,具高速转动的锋利的刀片),宜用于动物内脏组织的破碎;②玻璃匀浆器(用两 个磨砂面相互摩擦,将细胞磨碎),适用于少量材料,也可用不锈钢或硬质塑料等,两面间

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