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米粉中粗蛋白含量和油菜籽中脂肪含量的测定

米粉中粗蛋白含量和油菜籽中脂肪含量的测定
米粉中粗蛋白含量和油菜籽中脂肪含量的测定

实验报告

课程名称:农产品检测与农化分析实验指导老师:金崇伟成绩:__________________ 实验名称:米粉中粗蛋白含量和油菜籽中脂肪含量的测定 同组学生姓名:余慧珍

一、实验目的和要求 二、实验内容和原理

三、实验材料与试剂四、实验器材与仪器 五、操作方法和实验步骤六、实验数据记录和处理

七、实验结果与分析八、讨论、心得 一、 实验目的和要求

1. 掌握米粉中粗蛋白含量的测定方法——半微量消煮蒸馏法;

2. 了解凯氏定氮法与其他测定方法的区别;

3. 掌握油料作物粗脂肪的测定方法,熟悉与掌握重量分析的基本操作;

4. 了解实验中粗脂肪测定所采用的方法和优缺点。 二、 实验内容和原理 1. 米粉中粗蛋白测定意义 米粉是我国目前消费量和消耗大米量最大的大米深加工产品,但目前国内米粉生产技术较低,米粉品质尤其是粗蛋白含量随产品变异较大,因此米粉中粗蛋白的测定对米粉标准化、工业化、规范化生产具有重要意义[1]。 2. 粗蛋白测定——硫酸过氧化氢-半微量蒸馏法 2.1 待测液制备——硫酸-过氧化氢消化法 浓硫酸是一种强氧化剂,也是一种脱水剂,在反应过程中还起到升温的作用。过氧化氢是一种氧化剂。米粉在浓H 2SO 4溶液中,历经脱水炭化、氧化等一系列作用,而氧化剂H 2O 2在热浓H 2SO 4溶液中分解出的新生态氧具有强烈的氧化作用,分解H 2SO 4没有破坏的有机物和碳。使有机氮转化为硫酸铵盐,该消煮液可用半微量蒸馏法定氮[2]。 反应过程:NH 2-R-COOH + H 2SO 4→nCO 2 +SO 2+H 2O+NH 3; 2NH 3 + H 2SO 4 → (NH 4)2SO 4。 2.2 粗蛋白含量测定——半微量蒸馏法 消煮液中的硫酸铵经强碱(如30%-40%的氢氧化钠)碱化使之分解放出暗器,利用蒸汽将氨气蒸至硼酸溶液中被吸收,氨与硼酸溶液中的氢离子结合生成铵根离子,使溶液中的氢离子浓度下降。用标准酸液滴定,利用标准酸液消耗体积及其浓度可计算得到标准酸液消耗量,对应反应方程可计算求出NH 4+含量,进一步求出米粉粗蛋白含量[2]。 1) 蒸馏过程: (NH 4)2SO 4 + 2NaOH → Na 2SO 4 +2NH 3↑+2H 2O 2) 吸收过程: NH 32H 2O + H 2BO 3→NH 32H 2BO 3+ H 2O 3) 滴定过程: 2NH 32H 2BO 3+ H 2SO 4→(NH 4)2SO 4+ 2H 2BO 3。

2.3粗蛋白含量计算公式

粗蛋白含量(%)= (V - V 0)×c×14×10-3×ts×K×100 m

其中,V ——样品测定所消耗1/2H 2SO 4的体积(mL );

V 0——空白试验所消耗的1/2H 2SO 4的体积(mL );

c ——标准的1/2H 2SO 4浓度(mol/L);

14——氮原子的摩尔质量(g/mol );

10-3——mL 换算为L ;

ts ——分取倍数,本实验为ts=10;

m ——样品质量(g ,干基);

K ——氮换算成蛋白质的系数,本实验为K=5.95。

3.粗脂肪测定意义

脂肪是粮食、油料中的重要化学成分。测定粮食、油料中的粗脂肪含量,对评定其可食部品质和营养价值具有重要意义。对油料作物如油菜、花生等而言,含油量的高低直接体现了其经济价值;同时含油量高低又是确定油料等级的重要依据[3]。本实验中提取的脂肪性物质为脂肪类物质的混合物,其中含有脂肪游离脂肪酸、磷脂\酯、固醇、芳香油某些色素及有机酸等,称为粗脂肪。

4.油菜粗脂肪含量测定——残余重量法

4.1残余重量法

本实验采用重量法,对提取前的样品和用脂肪溶剂提起后的脂肪进行称量,通过质量差值计算油脂含量,该法适用于固体和液体样品。通常将样品浸于脂肪溶剂,为乙醚或沸点30℃至60℃的石油醚,借助于索氏提取器(图1)进行循环抽提[2]

4.2粗脂肪含量计算公式

粗脂肪含量(%)=(m 1+m 2-m 3)/m 23 100%

其中,m 1----滤纸的质量(g);

m 2 ----滤纸及烘干样品的质量(g);

m 3 ----浸提后的滤纸及残渣的质量(g)。 三、 实验器材与仪器

1. 样品

市售米粉;油菜籽;

2.试剂

乙醚或石油醚、浓

H 2SO 4(密度1.84g/mL )溶液、H 2O 2溶液、NaOH 溶液、甲基红(含乙醇)-

溴甲酚绿混合指示剂、H 3BO 3指示剂、(1/2 H 2SO 4)

标准液;

3.器材

2.1 粗蛋白测定

万分之一分析天平、消煮炉、消煮管、半微量定氮蒸馏装置、半微量滴定管(5mL )、锥形瓶、容量瓶、移液管、洗耳球;

图1 索氏提取器

2.2 粗脂肪测定

万分之一分析天平、高温鼓风烘箱、称量瓶、药匙、滤纸、分析天平、毛玻璃板、脱脂棉、索氏提取器。

四、操作方法和实验步骤

1.米粉中粗蛋白含量测定

1.1待测液制备

1.2半微量蒸馏法测定

2.油菜中粗脂肪含量测定

2.2样品抽提测定

五、实验数据记录和处理

表1 米粉中粗蛋白含量的测定

样品质量m(g) 滴定后体积

V(ml)

滴定前体积

V0(ml)

稀释倍数

ts

换算系数

K

硫酸浓度

c(mol/L)

米粉中粗蛋白

含量(%)

实验组0.2506 1.980 0.02 10 5.95 0.0103 4.79 注:米粉中粗蛋白计算公式含量(%)= (V - V0)3c314310-33ts3K3100

m

表2 油菜中粗脂肪含量的测定

滤纸质量m1(g)

滤纸及烘干

样品质量m2(g)

浸提后滤纸及

残渣质量m3(g)

油菜籽中粗脂肪

含量(%)

实验组0.5956 1.6233 1.5958 38.38

注:油菜籽中粗脂肪计算公式含量(%)=(m1+m2-m3)/m23 100%

六、实验结果与分析

1. 米粉中粗蛋白含量的测定

本次实验根据GB 50095-2010测定得到米粉中粗蛋白含量为4.79%。据报道[1],一般市售米粉的粗蛋白含量范围为 5.4~7.8%。比较可得,本组测定值较低;而与同一时间测定的其他组比较,其他组测定得粗蛋白含量在4%~6%之间。比较可得,本组测定值较为正常。可能原因是操作误差与米粉品质差异,其中影响米粉粗蛋白的影响因素有原大米蛋白质含量、加工中糊化程度、浸泡中浸泡液pH和离子强度、制粉中干磨强度等[5]。而实验中误差可能原因与改进如下:

1.1 误差

实验中误差的可能原因有:

1) 本组在将米粉移如消煮管中,有少许粘附在侧壁上,导致之后的消煮始终无法将在粘附在最上端的米粉溶下,而导致消煮所得待测液中NH4+浓度较低,从而使得粗蛋白测定结果偏低;

2) 蒸馏过程中,如NaOH未加过量、蒸馏装置接头处有漏气导致NH3溢出,或蒸馏时间不够(本次蒸馏终点仅以锥形瓶中溶液达到50mL为标准),由此导致的NH3未完全被吸收均会导致粗蛋白测定结果偏低;

3)由于是实验操作考试,本实验未设空白对照组,因此在计算结果时,除加加入米粉之外,消煮前引入的含氮化合物,以及消煮后蒸馏滴定阶段引入的NH4+或NH3均会使得实验结果测定值偏高,本实验中该影响程度不可确定;

4)本实验消煮过程开始阶段,消煮温度仅为150℃,远未大浓硫酸微沸的温度。此时过早加入过氧化氢会使得消煮温度始终无法达到理论值;此外,消煮时间过短,反复取放消煮管造成消煮不充分也会使得消煮不完全。这是本实验中粗蛋白含量较低的主要误差来源。

5)蒸馏速度过快,或者加热温度过高,碱液容易被蒸汽带出至锥形瓶,导致测定结果偏高;且蒸馏结束拔出入口玻璃塞过快时,会使碱液倒喷入冷凝管,亦导致结果偏高[6]。

1.2 改进

针对以上误差分析,可通过以下方法加以改进:

1)往消煮管中加入大米时,宜使用长纸条缓慢送入到硬质试管底部,尽量减少粉末粘在壁上,

影响样品的消煮。

2)消煮过程中应留意消煮温度,调节加热温度在200~250℃,保证充分的消煮时间。且H2O2滴加第一次不可过早,尽量在等到达到浓硫酸微沸后一段时间再加入,且滴加时需直接滴入瓶底溶液中,避免滴在瓶壁上,否则H2O2会因高温快速分解,失去氧化效果。

3)蒸馏过程中NH4+在碱性条件下释放出氨,为防止样液中氨气逸出,在检查好装置气密性的前提下1)加入氢氧化钠溶液需过量;2)缩短待测液的滴加时间,因为操作时间越长,从加入口溢出的NH3越多,使得测定结果越小;3)水封;4)夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽。

4)蒸馏过程中为确定蒸馏是否完毕可在液体即将蒸馏完毕时,打开玻璃塞口,用蒸馏水润湿的洁净红色石蕊试纸检验蒸汽中是否存在NH3。此过程操作亦需快速完成。若试纸变红,则说明蒸馏未结束,反之,则可终止蒸馏过程。

5)定容和滴定时,需等溶液充分冷却至室温后方可进行,否则由于温度的变化会影响定容的准确性和滴定终点的判断。

6)所用的试剂溶液必须用无氨蒸馏水配制,且在转移待测液时尽量避免氨氮的污染。

2. 食品中粗脂肪含量的测定

本次实验根据GB 5490-1985测定得到油菜籽中脂肪含量为38.38%,油菜籽中油脂的含量为37.5%~46.3%,且根据油菜的类型不同其油脂含量略有不同[8]。对比可得,本实验测定值在正常范围之内,且与同一时间其他组测定值较为接近。由于本实验中,索氏提取器部分有助教代为操作完成,因此以下分析可能的误差原因,实际状况尚未可知。

2.1 误差

实验中误差原因可能有以下几点:

1) 烘干样品吸水。经过索氏提取器对油脂进行提取后的纸包要进行烘干,但因烘干与称量时间相隔较久,且当天环境中相对湿度较大,滤纸与油菜籽等吸水导致测定结果偏低;

2) 提取不完全。多个样品共同提取时,部分脂肪物质没有提取完全,因而导致实验结果偏低:

3)烘干冷却时间不一致。且时间过长时,不饱和脂肪酸会因受热氧化而增加质量,导致测定结果偏高[9]。

2.2 改进

1)称量油菜籽样品之后,迅速包好滤纸,加入索氏提取器;或缩短烘干与称量的时间,减少其吸水带来的误差;

2)增加单个滤纸包内油菜籽质量,同时单个索氏提取器内加入样品数量,且滤纸包需在保证油菜籽不外漏的前提下,使得乙醚提取液能与其充分接触,提高脂肪提取率;

3)保证烘干冷却时间一致,且烘干时间不宜过长。

七、讨论、心得

问题1 粗蛋白含量测定方法之间的比较?

目前,粗蛋白的方法主要以传统蒸馏滴定法和仪器自动检测法为主。下面将就强碱直接蒸馏法、双氧水法(本实验采用)、凯氏定氮仪法进行比较。先简要介绍强碱直接蒸馏法和凯氏定氮仪法原理与操作步骤。

1.1强碱直接蒸馏法[10]

强碱直接蒸馏法是间接测定粗蛋白质的一种简便的方法。其将样品在强碱中消煮,使饲料中的α-氨基、酰氨基以及某些特殊基团上的氮素在强碱的作用下以氨的形式释放出来,直接蒸馏到硼酸中,再用盐酸溶液来滴定,根据盐酸消耗量来计算出DD法所测得的表观含氮量。计算公式与双氧水法类似。

1.2凯氏定氮仪法[11]

BuchiK-370 全自动凯氏定氮仪,其将样品在催化剂与硫酸加入后,置于红外线消化炉上消煮,后用全自动凯氏定氮仪进行蒸馏滴定。即放入已消化好的样品,用pH6.86和4.00两种标准液校正后,即可自动蒸馏、滴定。并可根据仪器给出的标准酸消耗量进行计算。

1.3三种方法比较

强碱直接蒸馏法与双氧水法比较,偏差比自动定氮仪打但均在国际法两个平行样品测定允许误差范围之内。强碱直接蒸馏法分析速度快,消煮与蒸馏同步进行,节省时间,但缺点是蒸馏时对操作控制较为严格,稍有不慎蒸馏物亦产生泡沫状,不易与氨气的挥发。

双氧水法与凯氏定氮仪法比较如下表1[11],对比看出BuchiK-370全自动凯氏定氮仪与半微量蒸馏法测定8组不同浓度饲料中的粗蛋白含量的最大相对偏差为0.51%,平均相对标准差为0.16%。比较两种方法,1)全自动定氮仪红外辐射加热只需要90~120min,大大缩短消化时间,节省电能;而半微量蒸馏法消煮时间通常在3~5h;2)全自动定氮仪减少人为操作误差,通过电极判断的滴定终点优于人肉眼判断变色;3)全自动定氮仪减少转移冷却定容等步骤,避免环境中氨对样品污染导致的误差,而半微量蒸馏法并不能消除这种误差[11]。但针对不同粗蛋白含量的样品,需采用不同的称样量(如表1右),且若装置气密性不加,会到使得样品吸出导致测定结果不准确,且该仪器成本较大,不适合研究实验操作。

综上,与半微量蒸馏法相比,强碱直接蒸馏法用强碱消煮与蒸馏效果略逊,但准确度尚可,适用实际生产检测所用;而凯氏定氮仪法(自动)虽然省时节能,操作更为精确,但成本高,且不适于锻炼实验操作技能。综合考虑后,半微量蒸馏法是用于科研教学实验的最佳方法。

问题2油料脂肪测定方法之间的比较?

目前,国内外测定粗脂肪的方法有十余种之多,而抽提法是常用的脂肪测定方法。其中,索氏抽提法(Soxhlet extractor method)为脂肪含量测定的经典方法。下面就索氏抽提浸泡法及阿贝折射仪法与索氏抽提法(本实验采用)作比较。索氏抽提法根据GB 5490-1985,索氏抽提浸泡法及阿贝折射仪法的操作步骤如下[3]。

2.1索氏抽提浸泡法

用烘盒称取2 g~5 g 样品,于105 ℃左右烘箱中烘30 min,趁热倒入研钵中研细,用滤纸包扎好样品,放入抽提筒内, 加入乙醚,虹吸一次, 再加入乙醚使滤纸包浸泡在乙醚中,浸泡8 h~12 h(过夜),然后抽提至抽提筒内的乙醚用玻片做点滴实验无油迹为止(约1 h~2 h)。抽净脂肪后, 取出滤纸

包,加热回收溶剂。将抽提瓶中的乙醚挥干,置于105 ℃烘箱,烘90 min 后再烘30 min 至恒重,抽提瓶增重的质量即为脂肪的质量。脂肪含量计算类似于本实验中计算公式。

2.2阿贝折射仪法

称取研细后的均匀样品5.00 g~10.00 g,置于小烧杯中,加入10 g~15 g 无水Na2SO4,用玻棒搅拌,以吸干水分。精确加入有机溶剂(α-溴代萘)5 ml~10 ml,用研棒充分研磨使脂肪溶出,静置数分钟后,将浆状物转入有滤纸的漏斗中过滤,取滤液1~2 滴,用阿贝折射仪测定混合液的折射率。

式中,V———加入溶剂量(ml);

ρ———20 ℃时脂肪的密度(一般取0.92 g/ml,亦可根据所用油脂的种类查得或实测,因温差1 ℃时校正值为0.00064 ,故可不校正);

m———样品的质量(g);

n———纯溶剂的折射率(α-溴代萘为 1.6582 , 八角茴香油为 1.5503 , 二碘乙烯为

1.742 , 亦可根据实际所用溶剂测定);

n1———混合液的折射率;

n2———油脂的折射率。

2.3三种方法比较

表中[3]对比可以看出,后两方法与

GB 5497-1985所得结果,绝对偏差平均

值为0.04%,相对偏差平均值为0.018%,

均为达到显著性差异水平,这说明两种发

发测定结果较为准确。

其中,索氏抽提浸泡法测定结果与国

标法相比有负偏差,这主要是在浸泡过程

中没有对流充分,使得脂肪大部分只能溶

解在乙醚,从而影响下一步测定。但国标

法对抽提瓶要求高,在测定前需达到恒重,

操作中亦需防治污染且在烘干脂肪时常

常因脂肪氧化后质量增加而使得恒重难

以实现,且工作效率较低,而索氏抽提浸

泡法只需1~2h即可完成,这在实验教学

和实际生产检测中较为实用。

而阿贝折射仪法测定的相对偏差平均值为0.002 %。阿贝折射仪法克服了国标等其他索氏抽提法耗时长的缺点,具有方便、快速等优点,是粮食、油料收购部门可选用的方法。此方法主要是依据脂肪溶于有机溶剂的特性,选择某种比脂肪有较高折射率的有机溶剂,通过研磨使样品中的脂肪溶解出来。之所以阿贝折射仪法相对偏差较大时由于研磨中细度、时间、温度对会影响测定准确度,而这些方面因为人为操作差异变异性较大。研磨时间过长、温度过高,α-溴代萘就会挥发损失,

使测定结果产生偏差,同时研磨细度直接影响到脂肪溶出的速度和溶出率[12]。

综上,以上两种方法与国标法相比,相对偏差平均值均小于0.002 %。索氏抽提浸泡法可以缩短抽提时间,提高抽提效率,适用于科研教学实验操作;而阿贝折射仪法具有方便快速的特点,更能适应油料收购部门检测。

参考文献

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[2]鲍士旦.土壤农化分析. 中国农业出版社, 1999.

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[4]GB 50095-2010 食品安全国家标准食品中蛋白质的测定

[5]邓丹雯, 郑功源, 陈红兵. 米粉保鲜工艺的研究[J]. 食品科学, 2001, 22(4):70-72.

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[7]GB 5490-1985粮食、油料及植物油脂检验

[8]刘兴媛. 我国油菜品种资源的脂肪酸含量[J]. 中国油料作物学报, 1981, (4).

[9]钟红舰, 魏红. 索氏抽提法测定粗脂肪含量的改进[J]. 产品可靠性报告, 2004, (2):39-40.

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[12] 李旺, 王占彬, 武晓红. 几种粗脂肪测定方法的优缺点[J]. 四川畜牧兽医, 2004, (6):27-27.

粗脂肪测定方法

粗脂肪测定方法 1、简述:本标准适用于各种单一、混合饲料和预混料中粗脂肪的测定方法。 2、方法原理:索氏脂肪提取器中用乙醚提取试样,称提取物的重量,除脂肪外还有有机酸,磷脂、脂溶性维生素,叶绿素等,因而测定结果称粗脂肪或乙醚提取物。 3、试剂与仪器 2) 无水乙醚(AR) 3) 索氏脂肪提取器(带球形冷凝管):100或150ml。 4) 索氏脂肪提取仪。 4、使用索氏脂肪提取器测定: 索氏提取器应干燥无水。抽提瓶(内有沸石数粒)在105±2℃烘箱中烘干60min,干燥器中冷却30min,称重,再烘干30min,同样冷却称重,两次重量之差小于0.0008g为恒重。(可直接烘1.5-2h,冷却后将抽提瓶称重编号) 称取试样1-5g,于滤纸筒中,或用滤纸包好,放入105℃烘箱中,烘干120min(或称测水分后的干试样,折算成风干样重),滤纸筒应高于提取器虹吸管的高度,滤纸包长度应以可全部浸泡于乙醚中为准。将滤纸筒或包放入抽提管,在抽提瓶中加无水乙醚 60--100ml,在60--75℃的水浴(用蒸馏水)上加热,使乙醚回流,控制乙醚回流次数为每小时约10次,共回流约50次(含油高的试

样约70次)或检查抽提管流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。(将试样在无水乙醚中浸泡三小时,效果更佳) 取出试样,仍用原提取器回收乙醚直到抽提瓶全部收完,取下抽提瓶,在水浴上蒸去残余乙醚,擦净瓶外壁。将抽提瓶放入105+-2℃烘箱中烘干120min,干燥器中冷却30min称重,再烘干30min,同样冷却称重,两次重量之差小于0.001g这恒重。(延长烘干时间至3h,称重一次即可) 5、计算: 粗脂肪(%)= 式中:m--风干试样重量,g m1--已恒重的抽提瓶重量,g; m2--已恒重的盛有脂肪的抽提瓶重量,g. 6、重复性 每个试样取两平行样进行测定,以其算术平均值为结果。 粗脂肪含量在10%以上(含10%)允许相对偏差为3%。 粗脂肪含量在10%以下时,允许相对偏差为5%。

食品中脂肪的测定

食品中脂肪的测定 【实验目的】: 1.掌握食品中脂肪存在状态的相关概念和知识; 2.熟练地掌握乙醚、石油醚、乙醇等有机溶剂的安全使用方法,有机溶剂提取、萃取、回流、回收及分离技术。 3.了解各类食品中的脂肪测定方法,掌握索氏提取法的检测技能。 食品中脂肪是重要的营养成分之一,脂肪是人体组织细胞的一个重要成分,量种富含热能的营养素,也是脂肪溶性维生素的良好溶剂,有助于脂溶性维生素的吸收。脂肪与蛋白质结合生成的脂蛋白,在调节人本生理机能、完全生化反应方面具有重要的作用。因此,各种食品中脂肪的含量是重要的质量指标之一。食品中的脂肪有两种存在形式,即游离脂肪和结合脂肪。测定食品中脂肪含量的方法有索氏提取法、酸水解法、碱水解法、皂化法等。 一、标准方法(GB 5009.6-85) (一)索氏抽提法(第一法) 1.原理 样品用无水乙醚或石油醚等溶剂抽提后,蒸去溶剂所得的物质,在食品分析上称为脂肪或粗脂肪。因为除脂肪外,还含色素及挥发油、蜡、树脂等物。抽提法所测得的脂肪为游离脂肪。 2.试剂 (1)无水乙醚或石油醚; (2)海沙;同GB5009.3食品水分的测定方法。 3.仪器 索氏脂肪抽提器。 4.操作方法 (1)样品处理 ①固体样品。精密称取2 -5g (可取测定水分后的样品),必要时拌以海沙,全部移入滤纸筒内。(干样粉碎后过40目筛,肉绞两次,一般样品用组织捣碎机。) ②液体或半固体样品:称取5.0-10.0g ,置于蒸发皿中,加入海沙约20g 于沸水浴上蒸干后,再于95---105℃干燥,研细,全部移入滤纸筒内。蒸发皿及附有样品的玻棒,均用沾有乙醚的脱脂棉擦净,并将棉花放入滤纸筒内。 (2)抽提 将滤纸筒放入抽提管内,连接已干燥至恒量的接受瓶,由抽提器冷凝管上端加入无水乙醚或石油醚至瓶内容积的2/3处,于水浴上加热,使乙醚或石油醚不断回流抽提,一般抽提6-12h 。 (3)称量 取下接受瓶,回收乙醚或石油醚,待接受瓶内乙醚剩1-2mL 时在水浴上蒸干,再于95--105℃干燥2h ,放干燥器内冷却0.5h ,称量。 5.计算10020 1?-=m m m X …………………………(3-11) 式中:X---样品中脂肪的含量, % m 1---接受瓶和脂肪的质量,g; m 0---接受瓶的质量,g; m 2---样品的质量(如是测定水分后的样品中,按测定水分前的质量计),g 。 6.说明 (1)本法为索氏(SoxhLet )提取法,为经典方法,测定准确,但费时、费试剂。 (2)本法要求必须干燥无水,水分有碍有机溶剂对样品的浸润。 (3)本法测得的脂肪中,还含有少量的可溶于脂肪的有机酸、色素、香精、醛、酮等,故只可称为粗脂肪。 (4)索氏提取器如图3-7所示。有机溶剂在接受瓶中受热蒸发至冷凝管中,冷凝后于盛装

测量蛋白质三种方法测定原理

测定蛋白质含量的三种方法原理 院系:xxx 专业:xxx 姓名:xxx 学号:xxx

测量蛋白质三种方法测定原理 【摘要】了解测量蛋白质三种测定方法的基本原理和优缺点。三种方法为考马斯亮蓝法(Bradford法),Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。 【关键词】蛋白质含量测定考马斯亮蓝法 Folin-酚试剂法紫外吸收法 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一目前常用的有两种古老的经典方法,即Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford 法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍。。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。简单列表为: 考马斯亮蓝法 双缩脲法(Biuret法)和Folin—酚试剂法(Lowry法)的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。它是一种蛋白定量法 (一)实验原理 考马斯亮蓝G-250(Coomassie G-250)是一种甲基取代的三苯基甲烷,分子中磺酸基的蓝色染料,在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液,引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移,在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收,因此,可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定,适合于蛋白质类的定量分析,尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。 (二)Bradford法的突出优点是: (1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这

实验一、食品中粗脂肪含量的测定

食品分析实验一:食品中粗脂肪含量的测定 1.实验目的 (1)学习索氏抽提法测定脂肪的原理与方法; (2)掌握索氏抽提法基本操作要点及影响因素。 2.实验原理 利用脂肪能溶于有机溶剂的性质,在索氏提取器中将样品用无水乙醚或石油醚等溶剂反复萃取,提取样品中的脂肪后,蒸去脂肪瓶中的溶剂,所得的物质即为脂肪(或称粗脂肪)。 3.仪器及材料 3.1仪器 索氏提取器(如图3-3所示)、电热恒温鼓风干燥箱、干燥 器、恒温水浴箱 3.2试剂 无水乙醚(不含过氧化物)或石油醚(沸程30-60°C)、滤 纸筒 3.3材料 饼干、方便面等选一 4.实验步骤 4.1样品处理 准确称取均匀实验样品2g左右并记录(精确至0.01mg),装入滤纸筒内。 4.2索氏提取器的清洗 将索氏提取器各部位充分洗涤并用蒸馏水清洗后烘干。脂肪烧瓶在103°C±2°C的烘箱内干燥至恒重(前后两次称量差不超过2mg)。 4.3样品测定 (1)将滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内,连接已干燥至恒重的脂肪烧瓶,由抽提器冷 凝管上端加入乙醚或石油醚至瓶内容积的2/3处,通入冷凝水,将底瓶浸没在水浴中加热,用一小团脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口。 (2)抽提温度的控制:水浴温度应控制在使提取液在每6-8min回流一次为宜。 (3)抽提时间的控制: 抽提时间视试样中粗脂肪含量而定,一般样品提取6-12h,坚果 样品提取约16h。提取结束时,用毛玻璃板接取一滴提取液,如无油斑则表明提取完毕。 (4)提取完毕。取下脂肪烧瓶,回收乙醚或石油醚。待烧瓶内乙醚仅剩下1—2mL时,在 水浴上赶尽残留的溶剂,于95—105°C下干燥2h后,置于干燥器中冷却至室温,

脂肪测定国标

脂肪的国标检测方法—索氏萃取法 【GB/T 5009.6—1985】 牛奶中脂肪的测定方法 本标准适用于各类食品中脂肪含量的测定。 第一法索氏抽提法 1原理 样品用无水乙醚或石油醚等溶剂抽提后,蒸去溶剂所得的物质,在食品分析上称为脂肪或粗脂肪。因为除脂肪外,还含色素及挥发油、蜡、树脂等物。抽提法所测得的脂肪为游离脂肪。 2试剂 2.1无水乙醚或石油醚。 2.2海砂:同GB 5009.3—85《食品中水分的测定方法》2.3。 3仪器 索氏提取器。 4操作方法 4.1样品处理 4.1.1固体样品:精密称取2~5g(可取测定水分后的样品),必要时拌以海砂,全部移入滤纸筒内。 4.1.2液体或半固体样品:称取 5.0~10.0g,置于蒸发皿中,加入海砂约20g于沸水浴上蒸干后,再于95~105℃干燥,研细,全部移入滤纸筒内。蒸发皿及附有样品的玻棒,均用沾有乙醚的脱脂棉擦净,并将棉花放入滤纸筒内。 4.2抽提 将滤纸筒放入脂肪抽提器的抽提筒内,连接已干燥至恒量的接受瓶,由抽提器冷凝管上端加入无水乙醚或石油醚至瓶内容积的2/3处,于水浴上加热,使乙醚或石油醚不断回流提取,一般抽提6~12h。 4.3称量 取下接受瓶,回收乙醚或石油醚,待接受瓶内乙醚剩1~2ml时在水浴上蒸干,再于95~

105℃干燥2h,放干燥器内冷却0.5h后称量。 4.4计算 式中:X——样品中脂肪的含量,%; m1——接受瓶和脂肪的质量,g; m0——接受瓶的质量,g; m2——样品的质量(如是测定水分后的样品,按测定水分前的质量计),g。 第二法酸水解法 5原理 样品经酸水解后用乙醚提取,除去溶剂即得游离及结合脂肪总量。 6试剂 6.1盐酸 6.295%乙醇 6.3乙醚。 6.4石油醚。 7仪器 100ml具塞刻度量筒。 8操作方法 8.1样品处理 8.1.1固体样品:精密称取约2g,置于50ml大试管内,加8ml水,混匀后再加10ml 盐酸。 8.1.2液体样品:称取10.0g,置于50ml大试管内,加10ml盐酸。 8.2将试管放入70~80℃水浴中,每隔5~10min以玻璃棒搅拌一次,至样品消化完

粗蛋白测定方法

粗蛋白测定方法—凯式定氮法 粗蛋白crude protein;crude matter(DM)食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。不仅包括蛋白质这一物质,它涵盖的范围更广,包括含氮的全部物质,及真蛋白质和含氮物(氮化物)。换句话说,粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称,食物中以大豆的粗蛋白含量最高,肉类次之。所以说,粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物,后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而,不同蛋白质的氨基酸组成不同,其氮含量不同,总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之,粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量,测量步骤如:蛋白质含氮量约为16%(这已通过多次试验得出),再用凯氏法测出总氮量,再乘以 6.25就可求得粗蛋白的含量。 一、实验原理 蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系,其中含碳50~55%、氢6~8%、氧20~23%、氮15~17%和硫0.3~2.5%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。 由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征,而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近,一般恒定在15~17%,平均值为16%左右,因此在蛋白质的定量分析中,每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量,再乘以6.25,就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热,被氧化成二氧化碳和水,而氮则转变成氨,氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。为了加速消化,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃),加入硫酸铜作为催化剂,过氧化氢作为氧化剂,以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行,其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小,节省能源,本仪器使用方便,效果良好。硫酸铵与浓碱作用可游离出氨,借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中,硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低,然后用标准无机酸滴定,直至恢复溶液中原来H

实验三食品中粗脂肪含量的测定(索氏抽提法)

实验三食品中粗脂肪含量的测定(索氏抽提法) 一、目的与要求 1、学习索氏抽提法测定脂肪的原理与方法. 2、掌握索氏抽提法基本操作要点及影响因素. 二、原理 利用脂肪能溶于有机溶剂的性质,在索氏提取器中将样品用无水乙醚或石油醚等溶剂反复萃取,提取样品中的脂肪后,蒸去溶剂,所得的物质即为脂肪或称粗脂肪。 三、仪器与试剂 1、仪器 (1)、索氏提取器如图3-3所示 (2)、电热恒温鼓风干燥箱 (3)、干燥器 (4)、恒温水浴箱 2、试剂 (1)无水乙醚(不含过氧化物)或石油醚(沸程30-60°C) (2)滤纸筒 四、测定步骤 1、样品处理 (1)固体样品: 准确称取均匀样品2-5g(精确至0.01mg),装入 滤纸筒内。 (2)液体或半固体: 准确称取均匀样品5-10g(精确至0.01mg), 置于蒸发皿中,加入海砂约20 g,搅匀后于沸水浴上蒸干,然 后在95-105°C下干燥。研细后全部转入滤纸筒内,用沾有 乙醚的脱脂棉擦净所用器皿,并将棉花也放入滤纸筒内。 2、索氏提取器的清洗 将索氏提取器各部位充分洗涤并用蒸馏水清洗后烘干。脂肪烧瓶在103°C±2°C的烘箱内干燥至恒重(前后两次称量差不超过2mg)。 3、样品测定 (1) 将滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内,连接已干燥至恒重的脂肪烧瓶,由抽提器冷凝管上端加入乙醚或石油醚至瓶内容积的2/3处,通入冷凝水,将底瓶浸没在水浴中加热,用一小团脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口。 (2) 抽提温度的控制:水浴温度应控制在使提取液在每6-8min回流一次为宜。 (3) 抽提时间的控制: 抽提时间视试样中粗脂肪含量而定,一般样品提取6-12h,坚果样品提取约16h。提取结束时,用毛玻璃板接取一滴提取液,如无油斑则表明提取完毕。 (4) 提取完毕。取下脂肪烧瓶,回收乙醚或石油醚。待烧瓶内乙醚仅剩下1—2mL时,在水浴上赶尽残留的溶剂,于95—105°C下干燥2h后,置于干燥器中冷却至室温,称量。继续干燥30min后冷却称量,反复干燥至恒重(前后两次称量差不超过2mg)。

粗蛋白测定方法

粗蛋白测定方法一凯式定氮法 粗蛋白crude protein ;crude matter (DM)食品、饲料中一种蛋白质含量 的度量。不仅包括蛋白质这一物质,它涵盖的范围更广,包括含氮的全部物质,及真蛋白质和含氮物(氮化物)。换句话说,粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称,食物中以大豆的粗蛋白含量最高,肉类次之。所以说,粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物,后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而,不同蛋白质的氨基酸组成不同,其氮含量不同,总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之,粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量,测量步骤如:蛋白质含氮量约为16% (这已通过多次试验得出),再用凯氏法测 出总氮量,再乘以就可求得粗蛋白的含量。 一、实验原理 蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量 都有一定比例关系,其中含碳50?55%、氢6?8%、氧20?23%、氮15?17% 和硫?%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。 由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征,而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近,一般恒定在15?17%,平均值为16%左右,因此在蛋白质的定量分析中,每测得1克氮就相当于克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量,再乘以,就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热,被氧化成二氧化碳和水,而氮则转变成氨,氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。 由大分子分解成小分子的过程通常称为”肖化”为了加速消化,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290C-400C ),加入硫酸铜作为催化剂,过氧化氢作为氧化剂,以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成,反应(3) 在凯氏蒸馏装置中进行,其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小,节省能源,本仪器使用方便,效果良好。 硫酸铵与浓碱作用可游离出氨,借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中,硼酸吸收氨后使溶液中的度降低,然后用标准无机酸滴定,直至恢 复溶液中原来H+浓度为止,最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。 二、仪器和试剂

蛋白质含量测定方法及其比较资料2

蛋白质含量测定法(一) 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较

值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(Biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材

粗蛋白测定方法

粗蛋白测定方法 什么是粗蛋白,粗蛋白跟蛋白质又有什么区别,如何测量饲料中粗蛋白的含量,粗蛋白的含量高是不是一定代表着蛋白质的含量高。我想,当你看到这个题目时,肯定会联想到这一连串的问题中的其中几个。那么接下来,我就来详细介绍下粗蛋白的概念、粗蛋白测量 和其他关于饲料中粗蛋白含量的问题。 粗蛋白概念: 粗蛋白不仅包括蛋白质这一物质,它涵盖的范围更广,包括含氮的全部物质。包括真蛋白质和含氮物(氨化物)。食物中粗蛋白含量以大豆最高,肉类次之。粗蛋白英文为crude protein。粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。由于一般蛋白质中含氮量约为16%,故在概略分析中,常用凯氏(Kjeldahl)法测出总氮量,再乘以系数6.25来求得。实际上,它是食品、饲料中含氮化合物的总称,既包括真蛋白又包括非蛋白含氮化合物,后者又可能包括游离氨基酸、嘌呤、吡啶、尿素、硝酸盐和氨等。此外,不同蛋白质的氨基酸组成不同,其氮含量不同,总氮量换算成蛋白质的系数也不同,如小麦和多数谷物的换算系数为5.80,水稻5.95,大豆5.7,多数食用豆和坚果5.3,牛奶6.38等。粗蛋白只是一个粗 略的概念。 粗蛋白含量: 下面我介绍几种常见物质的粗蛋白含量,仅供大家参考。 薏苡仁粗蛋白含量:13%-14% 棉粕粗蛋白含量:可达40%以上 农大白早糯玉米粗蛋白含量:3.41% 蠡玉168 粗蛋白含量:9.63% 台湾大青枣粗蛋白含量:0.86% 上文介绍了几种农产品或水果的粗蛋白含量情况,如果需要更多的资料,大 家可自己查阅。 粗蛋白测定: 方法一:最简便也是最快键的方法,就是用蛋白质测定仪来测量。 本标准参照采用ISO 5983—1979 《动物饲料──氮含量的测定和粗蛋白含量 计算》。 1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。 2 引用标准 GB 601 化学试剂滴定分析(容量分析)用标准溶液的制备

脂肪含量的测定

脂肪含量的测定 ———索氏提取法 一、实验目的与要求 (1)学习并掌握索氏抽提法测定脂肪含量的方法。 (2)学会根据食品中脂肪存在状态及食品组成,正确选择脂肪的测定方法。 (3)掌握用有机溶剂萃取脂肪及溶剂回收的基本操作技能。 二、原理 利用相似相溶原理用有机溶剂(乙醚)将游离的脂肪萃取出来,然后回收除去溶剂并干燥,残渣即为脂肪。残渣中除脂肪外,还包括其他挥发油、树脂、部分有机酸、色素等,故称为粗脂肪。 三、试剂、仪器及样品 试剂:无水乙醚 仪器: 1.恒温水浴一台/4组 2.索氏抽提器一套/组 3.定性滤纸2张/组直径15cm 4.小烧杯50ml 量筒100ml 5.脱脂棉 6.镊子一个/组 7.薄线手套(同学自备) 8.干燥箱 9.粉碎机公用 10.干燥器公用 样品:名称:方便面(油炸);厂家: 四、操作步骤 1清洗脂肪瓶,然后置于烘箱干燥,干燥后放入干燥器内冷却到室温。然后称其重量(精确到0.1克,注意记住编号) 2准确称量经干燥后的样品5.0克左右(精确到0.1克)于小烧杯中。 3将样品无损地转移到滤纸上,按“纸卷法”把样品包装好。样品一定要做到定量转移。 4置样品纸卷于抽提管中,然后把抽提管同冷凝器、脂肪瓶连上,固定于恒温水浴的支架上(检查样品的上端面是否超过提取管的上端)。 5用漏斗在冷凝管顶端开口缓缓加入无水乙醚,加入量为脂肪瓶容积的三分之二左右(100ml)。然后用一小团脱脂棉把冷凝管上开口轻轻塞上。加乙醚前,应接通冷却水。 6抽取脂肪 调整水浴温度在60~70℃,使抽提管中的乙醚可在3~5分钟虹吸一次,提取2~6小时。样品含有脂肪是否抽提完全,可以用滤纸来粗略判断。 7抽提效果检验 从提取管内吸取少量的乙醚并滴在干净的滤纸上,待乙醚干后,滤纸上不留有油脂的斑点则表示已经抽提完全,可停止提取。 8回收乙醚 将纸筒抽出,再将乙醚蒸到提取管内,待乙醚液面达到虹吸管的最高处以前,取下提取管,回收乙醚。取下脂肪瓶,置于通风橱水浴上挥发剩余的乙醚。9将脂肪瓶中的乙醚全部蒸干,洗净外壁,置于100~105℃烘箱内干燥1~2小时,干燥初期烘箱门应虚掩,取出后放入干燥器中冷却30分钟,然后称重(精确至0.1g),并重复操作至恒重。 五、计算

蛋白质测定方法之双缩脲法(Biuret法)

一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材 1.试剂: (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05N NaOH配制。 (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4?5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6?4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。 2.器材: 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 (三)操作方法 1.标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定:取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法(Lowry法) (一)实验原理

几种蛋白质含量测定方法的比较

几种蛋白质含量测定方法的比较 【摘要】:蛋白质含量测定方法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常 用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford),Folin —酚试剂法(Lowry)杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以在本公司订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替,杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ℃),通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。这6种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,每种方法都有其优缺点,在选择方法时应考虑:⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度;⑵蛋白质的性质;⑶溶液中存在的干扰物质;⑷测定所要花费的时间 【关键词】:凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法 Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法 一、凯氏定氮法 1.1原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 1.2特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一,被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL;硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素;用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min;与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。 凯氏定氮法适用范围广泛,测定结果准确,重现性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品,节省时间,提高了工作效率,适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。 二、双缩脲法(Biuret ) 2.1原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

粗脂肪含量的测定

粗脂肪含量的测定 -xx抽提法 摘要: 测定脂肪的含量,可以作为鉴别其品质优劣的一个指标.脂肪含量的测定有很多方法,如抽提法、酸水解法、比重法、折射法、电测和核磁共振法等.目前国内外普遍采用抽提法,其中索氏抽提法是公认的经典方法,也是我国粮油分折首选的标准方法.通过本实验的学习,掌握索氏抽提法测定粗脂肪含量的原理和操作方法. 一、目的 脂肪广泛存在于许多植物的种子和果实中,测定脂肪的含量,可以作为鉴别其品质优劣的一个指标.脂肪含量的测定有很多方法,如抽提法、酸水解法、比重法、折射法、电测和核磁共振法等.目前国内外普遍采用抽提法,其中索氏抽提法(Soxhlet extractor method)是公认的经典方法,也是我国粮油分折首选的标准方法.通过本实验的学习,掌握索氏抽提法测定粗脂肪含量的原理和操作方法. 二、原理 本实验采用索氏抽提法中的残余法,即用低沸点有机溶剂(乙醚或石油醚)回流抽提,除去样品中的粗脂肪,以样品与残渣重量之差,计算粗脂肪含量.由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外,还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质,因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪. 三、实验材料、主要仪器和试剂 1、实验材料 油料作物种子、中速滤纸 2、仪器: 1)索氏脂肪抽提器(图1)或YG-Ⅱ型油分测定器 2)干燥器(直径15-18cm,盛变色硅胶)

3)不锈钢镊子(xx20cm) 4)培养皿 5)分析天平(感量0.001g) 6)称量瓶 7)恒温水浴 8)烘箱 9)样品筛(60目) 3、试剂 无水乙醚或低沸点石油醚(A.R.) 四、操作步骤 1、准备工作 将滤纸切成8cm×8cm,叠成一边不封口的纸包,用硬铅笔编写顺序号,按顺序排列在培养皿中.将盛有滤纸包的培养皿移入105±2℃烘箱中干燥2h,取出放入干燥器中,冷却至室温.按顺序将各滤纸包放人同一称量瓶中称重(记作a)、称量时室内相对湿度必须低于70%. 2、包装和干燥 在上述已称重的滤纸包中装入3g左右研细的样品,封好包口,放入105±2℃的烘箱中干燥3h,移至干燥器中冷却至室温.按顺序号依次放入称量瓶中称重(记作b). 3、抽提 将装有样品的滤纸包用长镊子放入抽提筒中,注入一次虹吸量的 1.67倍的无水乙醚,使样品包完全浸没在乙醚中.连接好抽提器各部分,接通冷凝水水流,在恒温水浴中进行抽提,调节水温在70-80℃之间,使冷凝下滴的乙醚成

索氏抽提法测粗脂肪

索氏抽提法测粗脂肪 作者XX 2、脂类组成及分类 食品中脂肪的存在形式有游离态的,如动物性脂肪和植物性油脂;也有结合态的,如天然存在的磷脂、糖脂、脂蛋白及其某些加工食品(如焙烤食品、麦乳精等)中的脂肪与蛋白质或碳水化合物等形成结合态。 脂类是脂肪酸和醇所组成的酯类及其衍生物。他包括脂肪、蜡、磷脂、糖脂、类固醇等,其元素组成主要是碳、氢、氧,有的还有氮、磷、硫。 按脂类的化学组成,可将其分成三类。 (1)单脂类 单脂类大由脂肪酸与醇类所形成的脂。脂肪酸与甘油所形成的酯称为脂肪,脂肪酸与高级一元醇形成的酯称为蜡。 (2)复合脂类 复合脂类是有脂肪酸、醇和其他基团组成的酯。重要的复合脂类有磷脂、糖脂、硫脂和蛋白脂等。 (3)脂肪伴随物 指能溶于油脂的非酯物质,因常与油脂伴随在一起而得名。比较重要的有脂肪酸、高级醇类、色素和脂溶性维生素等。 二、脂类的提取及样品预处理 脂类不溶于水,但能溶于有机溶剂,脂类的测定大多是利用脂类的这一化学性质进行的。由于脂类包括单脂类、复合脂类和脂肪伴随物,其化学性质及在各种食品中的存在状态不同。因此,对于不同种类、性状的食品所选用的有机溶剂也不同。对于结合态脂类或由于被食品中其他组分所包裹不易被有机溶剂直接提取的脂类,需要在提取前经过一定的预处理,破坏结合态或分解包裹组分,使脂类游离出来。提取脂类常用的有机溶剂有乙醚、石油醚、氯仿-甲醇等。 1、提取剂的选择 (1)乙醚对脂肪的溶解能力强,是脂肪测定的最常用的试剂。但乙醚中约含2%的水分,含水乙醚回同时食品中的非脂类物质(如糖类等)提取出来,使结果偏高,所以测定时应使用有、无水乙醚,待测样品应预先干燥。乙醚只适于游离态脂肪的提取,对于复合脂类的提取效果不是很好,对于结合态脂肪则需要先将结合态破坏,游离出脂肪,再用乙醚提取。(2)石油醚提取脂肪的能力低于乙醚。用石油醚作提取剂时,允许样品中含有微量水分,它没有胶溶现象,不会夹带胶态的淀粉、蛋白质等物质。石油醚也只适于游离态脂肪的提取。(3)氯仿-甲醇是提取磷脂、蛋白脂、脂蛋白的有效溶剂,适用范围很广,特别适用于鱼、肉、家禽、蛋等食品中脂类的测定。 2、样品的预处理 (1)乙醚提取脂肪时,样品应预先干燥。乙醚渗入细胞中的速度与样品的含水量有关,样品很潮湿时,乙醚不能渗入组织内部,而且样品被水分饱和后,提取脂肪的效率降低。(2)对于面粉及其焙烤制品,如点心、鸡蛋面等,由于脂类被淀粉包裹,乙醚不能充分渗入样品内部,或由于脂肪与蛋白质、糖类形成结合脂,不能用非极性溶剂直接提取。因此,需将包裹的糖类水解,或将结合脂破坏 (3)牛乳中的脂肪并不呈溶解状态。而是以脂肪球呈乳浊液状态存在,它周围有一层膜,

粗蛋白测定仪的原理及功能

粗蛋白测定仪的原理及功能 粗蛋白测定仪也叫蛋白质测定仪,是专门用来测定蛋白质含量的仪器设备,该仪器的应用可以很好地帮助工作人员解决蛋白质含量测定上的苦恼。半自动测定,不仅测定过程得到了很大程度上的简化,对于目前标准化、严格化的蛋白质测定工作而言更是带来高效与严谨。我们都知道,蛋白质是动植物和人类生存重要的营养成分,其中氮是蛋白质构成的特有元素。根据含氮量可以换算出食品中蛋白质的含量。而采用粗蛋白测定仪以及配套使用的多功能高温消解仪测定蛋白质的含量,与其它测定方法比较,该方法则更省时、省力、数据准确可靠、便于检测分析。 托普云农KDN-08C粗蛋白测定仪也叫蛋白质测定仪,是以国际凯氏定氮法为依据进行设计制造的,仪器的工作原理具体如下:此仪器主机采用蒸气自动控制发生器,在液位稳压器的配合下,使蒸气在数十秒时间内平稳输出供蒸馏器使用。第一执行机关控制下的碱液流经蒸馏管进入定量消化管,使固定在酸液里的氨在碱性条件下挥发。第二执行机关控制下的蒸气对碱性条件的试样再进行蒸馏,使氨彻底挥发,挥发的氨被冷凝器冷凝下来,完全地被固定在硼酸之中,然后用标准酸对其滴定到终点,计算出氮的含量,再乘以换算蛋白质的系数得出蛋白质的含量。 以上就是粗蛋白测定仪的原理介绍,经过近几年的发现,粗蛋白测定仪已经拥有了快速、准确、自动、环保等优势,以快速这点优势为例,以前在对蛋白质检测时,可能需要几个小时,而现在只需要短短的几分钟就能够得到准确的检测结果,并且检测时间的缩短,更是带来了效率的提升,极大的提高了蛋白质实验检测的效率。据了解,目前粗蛋白测定仪已经广泛的应用于食品、肥料、土壤、谷物、化工等诸多行业领域内。 粗蛋白测定仪功能特点: 1、KDN凯氏定氮仪,采用微电脑进行过程控制。 2、自动式蒸馏控制、自动加水、自动水位控制、自动停水。 3、各种安全保护:消化管安全门装置,蒸汽发生器缺水报警,水位检测故障报警。 4、仪器外壳采用特制喷塑钢板,工作区域采用ABS防腐面板,防化学试剂腐蚀和机械损坏表面,耐酸耐碱。 5、水位检测,低水位报警,仪器控制系统故障能自动断电。 6、采用自来水水源,适应性广,对实验要求低。

饲料中粗脂肪的测定方法

饲料中粗脂肪的测定方法 1.主题内容与适用范围 本标准规定了饲料粗脂肪测定方法 本标准适用于各种单一、混合配合饲料和预混料。 2.原理 索氏脂肪提取器中用乙醚提取试样,称提取物的重量,除脂肪外还有有机酸,磷脂,脂溶性维生素,叶绿素等,因而测定结果称为粗脂肪或乙醚提取物。 3.试剂 无水乙醚(分析纯) 4.仪器设备 实验室用样品粉碎机或研钵 分样筛:孔径0。45毫米。 分析天秤:感量0。0001克。 电热恒温水浴锅:室温~100℃。 恒温烘箱:50~200℃。 索氏脂肪提取仪。 滤纸或滤纸筒:中速,脱脂。 干燥器:用氯化钙(干燥级)或变色硅胶为干燥剂。 5.试样的制备 选取有代表性的试样,用四分法将试样缩减为500克,粉碎至

40目,再用四分法缩减到200克,于密封容器中保存。 6.分析步骤 仲裁法:使用索氏脂肪提取器测定 索氏脂肪提取器,应干燥无水,抽提瓶中有沸石数粒,在105±2℃烘箱中烘干60分钟,干燥器中冷却30分钟,称重,再烘干30分钟,同样冷却称重,两次重量之差小于克为恒重,称取试样1~5克准确至克,于滤纸筒中,或用滤纸包好,放入105℃烘箱中,烘干120分钟,(或称水分后的干试样,折算成风干样品重)滤纸筒应高于提取器虹吸管的高度,滤纸包长度应以可全部浸泡于乙醚中为准,将滤纸包或滤纸筒放入抽提管,在抽提瓶中加入无水乙醚60~100ml,在60~75℃的水浴上加热,使乙醚回流,控制乙醚回流次数为每小时约10次,共回流约50次,含油高的试样约70次,或检查抽提管流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。 取出试样,仍用原提取器回收乙醚直至抽提瓶全部收完,取下抽提瓶,在水浴上蒸去残留学乙醚,擦拭干净瓶外壁,将抽提瓶放入105±2℃烘箱中烘干120分钟,干燥器中冷却30分钟稳重,再烘干30分钟,同样冷却称重,两次重量之差小于克为恒重。 推荐法,使用脂肪提取仪测定,依仪器操作说明书进行操作。7.测定结果的计算: 粗脂肪(%)=(m2-m1)×100/m

粗脂肪含量的测定

粗脂肪含量的测定-索氏抽提法 摘要:测定脂肪的含量,可以作为鉴别其品质优劣的一个指标.脂肪含量的测定有很多方法,如抽提法、酸水解法、比重法、折射法、电测和核磁共振法等.目前国内外普遍采用抽提法,其中索氏抽提法是公认的经典方法,也是我国粮油分折首选的标准方法.通过本实验的学习,掌握索氏抽提法测定粗脂肪含量的原理和操作方法. 一、目的 脂肪广泛存在于许多植物的种子和果实中,测定脂肪的含量,可以作为鉴别其品质优劣的一个指标.脂肪含量的测定有很多方法,如抽提法、酸水解法、比重法、折射法、电测和核磁共振法等.目前国内外普遍采用抽提法,其中索氏抽提法(Soxhlet extractor method)是公认的经典方法,也是我国粮油分折首选的标准方法.通过本实验的学习,掌握索氏抽提法测定粗脂肪含量的原理和操作方法. 二、原理 本实验采用索氏抽提法中的残余法,即用低沸点有机溶剂(乙醚或石油醚)回流抽提,除去样品中的粗脂肪,以样品与残渣重量之差,计算粗脂肪含量.由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外,还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质,因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪. 三、实验材料、主要仪器和试剂 1、实验材料

油料作物种子、中速滤纸 2、仪器: 1)索氏脂肪抽提器(图1)或YG-Ⅱ型油分测定器2)干燥器(直径15-18cm,盛变色硅胶) 3)不锈钢镊子(长20cm) 4)培养皿 5)分析天平(感量0.001g) 6)称量瓶 7)恒温水浴 8)烘箱

9)样品筛(60 目) 3、试剂 无水乙醚或低沸点石油醚(A.R.) 四、操作步骤 1、准备工作 将滤纸切成8cm×8cm,叠成一边不封口的纸包,用硬铅笔编写顺序号,按顺序排列在培养皿中.将盛有滤纸包的培养皿移入105±2℃烘箱中干燥2h,取出放入干燥器中,冷却至室温.按顺序将各滤纸包放人同一称量瓶中称重(记作a)、称量时室内相对湿度必须低于70%. 2、包装和干燥 在上述已称重的滤纸包中装入3g 左右研细的样品,封好包口,放入105±2℃的烘箱中干燥3h,移至干燥器中冷却至室温.按顺序号依次放入称量瓶中称重(记作b). 3、抽提 将装有样品的滤纸包用长镊子放入抽提筒中,注入一次虹吸量的1.67 倍的无水乙醚,使样品包完全浸没在乙醚中.连接好抽提器各部分,接通冷凝水水流,在恒温水浴中进行抽提,调节水温在70-80℃之间,使冷凝下滴的乙醚成连珠状(120-150 滴/min 或回流7次/h 以上),抽提至抽取筒内的乙醚用滤纸点滴检查无油迹为止(约需6-12h).抽提完毕后,用长镊子取出滤纸包,在通风处使乙醚挥发(抽提室温以12-25℃为宜).提取瓶中的乙醚另行回收. 4、称重

常见蛋白质测定方法的总结与比较

分析化学 结课作业 常见蛋白质测定方法的总结与比较 材料科学与技术学院 林化13-1班 刘旺衢 130534106

常见蛋白质测定方法的总结与比较 刘旺衢 (北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班 130534106,10083) 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。准确精密的测定蛋白质,关乎人类的生产、生活、生存。目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。 一、凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收,再以标准酸滴定,就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量,即含氮量*6.25=蛋白含量。 凯氏定氮法具有灵敏度高, 样品用量少,最低可检出0.05mg氮;精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%;应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品;仪器装置简单,试剂廉价的优点。 但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定;定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量;在蛋白质氨基酸构成有差异的

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