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cDNA文库的构建

cDNA文库的构建
cDNA文库的构建

一、cDNA文库的构建在细胞分化方面的知识

(一)在某种特定细胞中的某个特定时期提取总RNA(mRNA 与micro-RNA、NATs、long no-coding RNA):

以小鼠股骨组织为例;

以小鼠骨髓巨噬细胞系RAW264.7为例;

以原代小鼠骨髓巨噬细胞(纯度70%?)为例;

cDNA文库(百度)

以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中,在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因,因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

目录

1概述

2定义

3原理

4注意事项

5 mRNA

?制备

?来源

?完整性

?丰度

?分离

6 TRNA

7 cDNA

?第一链

?第二链

?自身引导

?置换合成

8克隆

9筛选鉴定

10载体制备

11鸟枪法

12物化方法

13分离基因

14化学合成

15 PCR

1概述

cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板,逆转录形成的互补DNA(cDNA)与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中,在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因,因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同,基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量

的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA 为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。

高等生物一般具有10^5种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都仅有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA 克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。

cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势,从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值,是研究工作中最常使用到的基因文库。

2定义

(cDNA Library)某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组,并将其引入到相应的宿主细胞中(一般为E.coli.)繁殖和扩增,理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息,称该生物基因组的cDNA文库。(所有发育阶段?)

3原理

经典cDNA文库构建的基本原理:用Oligo(dT)作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基本步骤包括:(1)mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。(2)cDNA第一条链的合成。(3)cDNA第二条链的合成。(4)双链cDNA的修饰。(5)双链cDNA 的分子克隆。(6)cDNA文库的扩增。(7)cDNA文库鉴定评价。

4注意事项

构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库,二者大同小异。无论怎样,应当注意如下几个方面:

获得起始RNA

构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多,在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录,这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好,虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右,这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库,但这是针对材料极为稀缺者而言,但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量,如果采用纯化总mRNA后反转录,则对总RNA的杂质方面要求稍松,但对RNA的完整性则一丝不苟,要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录,则对总RNA的质量要求非常高,不仅要求RNA相当完整而无降解,而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少,最好是试剂盒抽提的。

反转录

这是构建cDNA文库中最贵的一步,也是核酸质变的一步,它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功,说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了,但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转,总的全长cDNA

太少,这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大,但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术(可参考其GeneRacer说明书)从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法,但对mRNA的完整性要求非常高,理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全,才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。

层析柱cDNA分级

这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心,尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作,cDNA的加入和收集要精力集中。获得的每一级的cDNA量很少,检测时带型很暗,所以要用新鲜做的透明薄胶检测,根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA(一般400bp以下就不要了,因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量)。

连接载体

噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高,也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功,更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接,而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接,目的基因cDNA长的有10kb以上,短的只有500bp或更短。一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果,不同长度cDNA的连接效率就不一样。有的专家的经验是,根据分级结果,有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接,再分别转化或转染大肠杆菌,分别完成滴度检测,最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。

5 mRNA

制备

动物细胞mRNA的制备

植物细胞mRNA的制备

来源

选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等方法提高mRNA的含量

完整性

1、mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translation system),又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统"。

无细胞提取物的制备:

用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心除去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.

常见的体外无细胞翻译系统:

兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白. (一个血红蛋白由四条珠蛋白组成,即两个α肽链,两个β肽链。)

缺点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA 。

麦胚系统。用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23 ;将S23分装,保存于-20°C冰箱中.

利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA。

优点:适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.

缺点:不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止. (哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译

*SDS-PAGEanalysis of proteins translated by cell-free translation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation products of total mRNA from mammalian cells)

2、mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力

3、mRNA分子的大小

哺乳动物mRNA长度为500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.

4、总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力

利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA

*Lane 1: -HindIII-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA;

Lane 3: the second chain of cDNA; Lane 4: -HindIII

丰度

1)高丰度mRNA

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA .

2) 低丰度mRNA

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下.

5、mRNA的富集方法

典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝.

mRNA的丰度与文库克隆子数的关系

ln(1-P)

N= ln(1-1/n)

N: 所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例

1) 按大小对mRNA进行分级分离

* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低.

* 蔗糖梯度离心:加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.

2) cDNA的分级分离

* mRNA通过反转录形成cDNA,在插入到克隆载体前,通过琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的cDNA分子分离开来.

* 优点:

a)避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解

b)增加了获得全长cDNA克隆的概率

c)获得更准确的分级分离效果(分子量)

3)多聚核糖体免疫学纯化法

* 使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱(A蛋白-Sepharose柱)上,随后用EDTA将多聚核糖体解离下来,并通过Oligo(dT)层析分离mRNA, 利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍. 目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝.

分离

1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN)法

准备工作:

1).将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中,旋转混匀,溶解Oligotex., 然后置于室温。2).将OBB Buffer置于37℃水浴中,旋转混匀,重溶沉淀物,然后置于室温。

3).将OEB Buffer 置于70℃水浴中,待用。

试验步骤:

表3:加入试剂量据此表

Total RNA RNase-free Water

to:

Buffer OBB

(ul)

Oligotex

Suspension (ul)

Prep size

<=0.25mg 250ul 250ul 15 Mini

0.25-0.5mg 500ul 500ul 30 Midi

0.5-0.75mg 500ul 500ul 45 Midi

0.75-1.00mg 500ul 500ul 55 Midi

1). Total RNA 量不要多于1mg,用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中,加RNase-free water 补足到500ul

2). 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension,轻弹1.5ml离心管彻底混匀

3). 置于70℃水浴中3min

4). 取出置于室温(20℃-30℃)10min

5). 13000rpm室温离心2min,用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中,保留上清直到polyA被结合上。

6). 用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物,将混合物转移到Spin Column中,RT ,13000rpm,离心1min

7). 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中,加400ul OW2,RT,13000rpm,离心1min

8). 取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温13000rpm,离心1min。

9). 测OD,并电泳定量。

2. 磁珠法分离mRNA

1). 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.

2)65℃加热10分钟。

3)加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中,轻轻混合,室温放置逐渐冷去至室温,一般需10 分钟左右。

4)同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.

5) 将磁珠(SA-PMPs)轻晃散开,放入磁性分离架上,使SA-PMPs集中于管的一侧(约30sec),小心去上清,切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠,去除上清,重复3次。

6). 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc, 注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。

7). 将(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中,轻轻摇匀,室温下放10 分钟。

8). 用磁性分离架捕获SA-PMPs, 小心去上清,但不要弃去。

9). 用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次,每次都晃至SA-PMPs悬浮,最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相,而不损坏SA-PMPs.

10) 将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中,反复颠倒,使SA-PMPs散开,洗脱mRNA。

11) 用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。

12) 将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中,洗脱,与(11)步洗脱液合并。

13) 将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳,若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录,则需将得到的mRNA溶液浓缩(浓缩步骤见14-18)。

14) 加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中,-20℃沉淀过夜。

15).4℃,13000g离心60 分钟。去上清,加入500ul 70%乙醇混匀。

16).4℃,7500g离心10 分钟。

17).去上清,真空或空气中自然风干,但不要太干,加适量RNase-free水溶解。

18).重复步骤5-12,将步骤8保留下的样品重新上柱

注意事项:

(1.所有操作均需要严格戴手套,戴口罩进行

(2.如果total RNA质量高,杂质少,就选择Oligotex的方法分离mRNA,相反则可以用磁珠法。

(3.mRNA的电泳图是smear。

6、TRNA

TRNA提取

试剂配制

准备工作:

1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部,置于烤箱内,180℃,烤6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后,121℃20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方:

▲DEPC水:在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳:PH=4~5

三水合柠檬酸纳22.94g

加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠:

肌氨酸钠10g

加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。

▲变性裂解液:

0.78M柠檬酸钠8.25ml

10%肌氨酸钠12.375ml

异硫氰酸胍118.05g

加DEPC水定容至250ml,室温放置备用

临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%(v/v)

▲ 2M 醋酸钠PH=4.5

NaAc·3H2O 13.6g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用

▲3M醋酸钠PH=5

NaAc·3H2O 20.4g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用

▲ 4M LiCL:

LiCL 24.164g

加DEPC水定容至100ml,高压灭菌,室温放置备用

▲0.5M EDTA PH=8.0

EDTA 18.61g

用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温放置备用▲10X MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸):

MOPS 41.86g

NaAC·3H2O 4.10g

0.5MEDTA(PH 8.0)20ml

用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L,室温避光放置备用。▲ 1x MOPS:

10x MOPS 30ml

加DEPC水270ml,用时现配。

▲4x RNA Loading buffer:

10x MOPS 400ul

甘油(高压过)200UL

溴酚兰10ul

甲醛(37%) 72ul

去离子甲酰氨310ul

EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul

ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul

在4℃可保持3个月

▲ 10x PBS

pH=7.4

NaCl 80g

KCl 2g

Na2HPO4 14.4g

KH2PO4 2.4g

定容至1000ml

▲变性电泳胶:

称取0.5g琼脂糖,加入47.5ml 1x MOPs,加热至琼脂糖熔化后,冷却至50℃左右,加入2.5ml 甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上。

▲变性电泳缓冲液:

在250ml容量瓶内加入5ml甲醛,用1x MOPS定容至250ml

2.动物组织t RNA的提取

1.根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量,将变性裂解液分装到RNase-free 的50ml无菌离心管中,冰浴5分钟。

2.将组织样品放入变性裂解液中,在高速下匀浆15-30秒/次,直到看不见组织和细胞碎片。

3.根据表1加入适量2M的乙酸钠(pH4.0),反复颠倒混匀4-5次。

4.根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。

5.冰浴10分钟。

6.4°C,12000g离心20分钟。

7.小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。

8.加入等体积的异丙醇,-20°C沉淀30分钟以上。

9.4°C,12000g离心20分钟。

10.根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。

11.加等体积的氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。

12.4°C,12000g离心20分钟。

13.小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇,-20°C 沉淀至少30分钟。

14.4°C,12000g离心20分钟。

15.弃上清,加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C,12000g离心10分钟。

16.弃上清,空气中干燥RNA沉淀,直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA 沉淀。

17.取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80°C冰箱中保存。

表1

Mg# of tissue 500 800 1000

变性裂解液(ml) 5 8 10

2M NaOAC pH 4 (ml) 0.5 0.8 1

水饱和酚(mL) 5 8 10

氯仿(mL) 1 1.6 2

异丙醇(mL) 4 6 8

变性裂解液(mL) 0.5 0.8 1

异丙醇(mL) 0.5 0.8 1

75% 乙醇(mL) 1 1 1

DEPC-treated H20 (mL) 0.5 0.8 1

3.植物组织t RNA的提取

1. 先将研钵于-80℃冰箱中预冷,然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。

2. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中,充分匀浆。(1g样品加入3ml变性裂解液)。

3. 加入0.3ml(1/10体积)2M的NaAc(ph4-5)颠倒混匀。

4. 加入3ml(等体积)的水饱和酚,充分振荡,再加入1ml(1/3)的氯仿,振荡。

5. 冰浴10min。4℃,12000g离心10min

6. 小心转移上清于另一离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀至少1小时。

7. 4℃,12000g离心20min。

8. 去上清,取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀(1mlLiCl/g组织),并转入1.5ml离心管中。

9. 4℃,13000rpm离心15min。

10. 用0.4ml DEPC水溶解沉淀,加1/2体积的水饱和酚,1/2体积的氯仿,颠倒混匀。

11. 4℃,13000rpm离心10min。

12. 取上清,加1/10体积的3MNaAc(ph5)和2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

13. 4℃,13000rpm离心15min。

14. 弃上清,用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀,4℃,13000rpm离心10min。

15. 弃上清,取沉淀,空气中干燥RNA沉淀,直至无乙醇味。

16. 用40-60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。

17. 取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80℃冰箱中保存。

4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)

1.查表2根据样品量选择适当的TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中,注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。

2.将组织样品放入TRIzol Reagent中,高速下匀浆15-30秒/次,直至看不见组织和细胞碎片。

3.室温温育10分钟。

4.据表2加入适量体积的氯仿,剧烈震荡15秒钟,然后室温下温育3分钟。

5.4ºC,12000g离心15分钟,形成淡红色的苯酚/氯仿有机相,中间相和上层水相,水相约占TRIzol体积的60%。

6.转移上清于另一个Rnase-free的50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇,-20℃沉淀1小时以上。

7.4℃,12000g离心10分钟。

8.去上清,据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。

9.4℃,7500g离心5分钟。

10.去上清,空气中干燥或真空抽干RNA沉淀,但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。

11.取少量RNA用于测定其OD值和电泳,其余置-80℃冰箱中保存。

表2

组织量TRIzol Reagent 氯仿异丙醇75%乙醇

50~100mg 1ml 0.2ml 1ml 1ml

7 cDNA

cDNA双链合成

1. Superscipt II—RT合成第一链:

1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入

xul mRNA(大约500ng)

1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)

11-x ul RNase-free water

(大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.)

2. 混匀后,70℃反应10分钟;

3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;

4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:

4ul 5×first strand buffer

2ul 0.1M DTT

1ul 10mM dNTP(自己配制)

5. 混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;

6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;

7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.

2. cDNA第二链的合成

1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):

20ul 10×DNA Polymerase I buffer

6ul 10mM dNTP(自己配制)

xul dd H2O

1ul RNase H(2U/ul)

10ul DNA Polymerase I(10U/ul)

总体系为200ul;

2. 混匀后,16℃反应2.5小时;

3. 70℃灭活10分钟;

4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;

5.取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder,确定双链的大小范围。

注:一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些。

3. 双链cDNA末端补平

1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):

6ul 10mM dNTP

2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)

2ul BSA(10mg/ml)

2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;

3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;

4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;

5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;

6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;

7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;

8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.

注:第3,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。

PCR纯化试剂盒操作流程:

1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。

2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB,混匀。

3.加入spin column中,13000rpm离心1min。

4.加入0.75ml buffer PE,13000rpm离心1min。

5.13000rpm,再离心1min。

6.将spin column放入一新的离心管中,加入50ul buffer EB,静置10min。

7.13000rpm离心2min。

8.加入30ul buffer EB,静置10min。

9.13000rpm离心2min。

10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。

4 EcoR I adaptor 加接

1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;

2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:

1.2ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)

3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;

5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切

1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;

2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:

1ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

6ul dd H2O

1ul T4 PNK(10U/ul)

3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;

4. 稍微离心使反应物集中至管底;

5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:

4ul Xho 10×Buffer

2ul BSA

5ul ddH2O

8ul Xho I (10U/ul)

6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;

7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。

6.胶回收cDNA

1.配制小胶数板(每个样品一板):1%琼脂糖凝胶,2ul EB/300ml 胶

2.取4℃保存样品上样,40ul/孔。

3.电泳50V;1hr

4.紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.,分别放入已做标记的1.5ml离心管中。

5.称取胶重,加入三倍体积buffer QXI(例如,100mg胶中加入300ul buffer QXI)6.50℃水浴数分钟,至胶完全融化。用手指弹QIAEX II 使重悬,每管中加入5ul QIAEXII 7.50℃水浴10min,每隔2min 取出颠倒混匀数次,使QIAEX II 保持悬浮

8.4℃,13000rpm,30sec。(弃上清,离心机中甩一下,吸取上清)

9.加入500ul buffer QXI,轻弹管底使QIAEX II 重悬

10.离心并去上清(同操作8)

11.加入500ul buffer PE,重悬QIAEX II,离心30sec,去上清

12.再加入500ul buffer PE,重悬QIAEX II,离心30sec,弃上清,离心机中甩一下,吸去上清

13.超净台上吹干(至无乙醇味),加入10ul elution buffer,重悬QIAEX II,静置5min,13000rpm,30sec。吸上清,冰上放置。

14.取1ul上清上样电泳,同时做分子量标准(1kb ladder)及DNA含量标准(10ng,20ng)作对照。

15.将收回的cDNA置于-20℃内保存,据电泳结果,取适量DNA进行连接。

注意事项:

1.胶回收前电泳槽,电泳板,梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。

2.胶回收时电压要稳定。

第一链

第一链的合成

oligo(dT)引导的DNA合成法:

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.

缺陷:

因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.

随机引物引导的cDNA合成法(randomly primed cDNA synthesis) :

根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.

第二链

第二链的合成

第一链的合成反应完成后,得到DNA/RNA杂交分子,在DNA聚合酶的作用下,以第一链为模版,合成cDNA的第二链。

自身引导

变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.

缺点:

在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.

自身引导法合成双链cDNA

置换合成

原理:

以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA 链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA 的第二链.

优点:a)合成cDNA的效率高

b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化

c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA

3,引物-衔接头法

8克隆

将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠杆菌寄主细胞增殖.

1,同聚物加尾法

利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个片段连接成重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞.

同聚物加尾法克隆双链cDNA

2,接头-衔接头法

3,mRNA-cDNA克隆法

方法:

在mRNA反转录合成cDNA第一链后,将dA残基加到mRNA:cDNA杂交体上,然后与带dT 尾的克隆载体连接,转化受体细胞,在宿主细胞内,mRNA被降解并代之以DNA.

缺点:

克隆的效率低(为双链cDNA克隆的1/10)

4,Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA

9筛选鉴定

1 核酸杂交

是最常用,最可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子.

1)同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA 文库中的全长克隆.

2)部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.

3)总cDNA探针:

通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.

4)cDNA扣除探针:

从第一种mRNA制备cDNA探针, 连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交;

回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的第一种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.

* 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆.

5)合成寡核苷酸探针

2 特异性免疫学检测

在cDNA表达文库中,目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测

3 cDNA克隆的同胞检测

将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA 文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆.

4 cDNA克隆的确证

cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.

第四节目的基因的分离

外源基因:

插入到载体内的那个特定的片段基因.

目的基因:

那些已被或者准备要分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA片段.

10载体制备

1.pBlueScriptII的提取

1.取1ul商品的pBlueScriptII,转化入大肠杆菌宿主菌中,取5ul转化产物均匀涂布在含

AMP的LB平板上,37℃培养过夜。

2.第二天取一只无菌的50ml离心管,加入10ml AMP抗性的LB液体培养基,挑单克隆于离心管中,37℃,250rpm,培养过夜。

3.第三天取200µl小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中,37℃,250rpm培养6 hr左右,使OD值达到0.6-0.8。

4.将菌液移入250ml离心管中,4℃,3000rpm,离心15min。取出离心管,菌团朝上倒掉上清,将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。(注意离心前需配平)

5.加入10ml溶液Ⅰ(50mM Glucose ,25mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH8.0),加入RNase至终浓度100µg/ml,晃动摇菌,使菌体充分悬浮,静置10min。

6.按NaOH(0.4N):SDS(2%)--1:1的比例新鲜配制溶液Ⅱ,加入20ml溶液Ⅱ,静置3-5min。

注:静置时间勿超过5min,提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。

7.加入15ml冰浴的溶液Ⅲ,冰浴15-30min。

8.4℃,5000rpm,离心15min。

9.取上清于两个50ml离心管中,弃去原离心管中的沉淀。

10.每管加入0.6倍体积的异丙醇,充分混匀,室温下放置10min。

11. 20℃,12000g,离心20min回收质粒沉淀。

12.弃上清,用70%的乙醇洗2次。

13.弃上清,倒扣于吸水纸上,尽量空干液体。

14.用3ml TE(pH8.0)溶解沉淀,移入1.5ml Eppendorf离心管中。

15.电泳检查DNA质量并定量。(必要的话,可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。)

2.pBlueScriptII的双酶切消化

1.以如下体系进行EcoRI酶切:

pBSK(+) X µl(6µg)

ddH2O 174-X µl

10×Buffer E 20 µl

混匀,加入限制性内切酶:

EcoRI (10U/ µl)6 µl

总体积为200 µl。

2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下。

3.37℃,水浴1hr。

4.加入200ul 1:1的酚/氯仿,混匀。4℃,13000rpm,离心15min。

5.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min。

6.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min。

7. 4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

8.加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。

9.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

10.自然风干沉淀,至无乙醇味,加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。

11.加入以下试剂进行XhoI酶切:

ddH2O 74 µl

10×Buffer D 20 µl

混匀,加入限制性内切酶XhoI:

XhoI (10U/ µl)6 µl

总体积为200 µl。

12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下

13.37℃,水浴1.5hr。

14.加入200ul 1:1的酚/氯仿,混匀。

15.4℃,13000rpm,离心15min。

16.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min。

17.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min。18. 4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

19.加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。

20.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

21.自然风干沉淀至无乙醇味,加入40ulddH2O充分溶解沉淀,得到双酶切载体。3.载体去磷酸化

1.在40ul双酶切载体中加入以下试剂:

6ul 10×buffer

6ul CIAP(0.01U/ul)

8ul ddH2O

总体积60ul。

2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下。

3.37℃,水浴1hr。

4.70℃,15min,灭活酶。

5.电泳分离,胶回收双酶切载体,定量。

4.载体效率检测

1.按以下所示作4个连接反应:

DNA 连接酶

1 pBlueScriptII/E/X /CIAP - 检测酶切效率

2 pBlueScriptII/E/X /CIAP + 检测脱磷效率,载体自连效率

3 商品Vector加标准Insert + 对照

4 自制Vector加标准Insert + 检测载体效率

14℃连接过夜。

2.各取1ul连接产物作电转化(具体流程见电转化)

3.计算克隆数,计算载体相对脱磷效率及连接效率。

11鸟枪法

又叫霰弹法,其特点是绕过直接分离基因这一关.由于目的基因在整个基因组中太少太小,在相当程度上靠"运气".

原理:

基因组DNA

物理(剪切力,超声波等) 或生化方法(限制性内切酶)切割

长度与一般基因大小相当的DNA片段的混合物

随机地重组入适当的载体

转化

大肠杆菌中扩增

适当的方法筛选

要求有简便的筛选方法:

利用特定基因缺陷型(如营养缺陷型等)的受体细胞,或特定的寡核苷酸DNA 片段探针以特定基因产物的抗体,可通过双表型的筛选或用分子杂交技术,免疫筛选技术检出目的基因.

示例:面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取

EcoRI 载体

酵母DNA 片段基因重组DNA

转化

"吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型"大肠杆菌

基本培养基

筛选,分离菌株

目的基因

12物化方法

基因工程初始阶段所用的方法,已不用.利用核酸双螺旋之间存在着碱基G C,A T配对特性,分离目的基因.

例如:海胆rDNA分子内其G C含量可以达63%(其稳定性高,溶解温度高),通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA,最后经氯化铯平衡梯度离心,得到相对分子量为1.9X107Dal的高纯rDNA.

从基因文库中分离目的基因

13分离基因

如果手中有足够量可产生抗体的来源于真核细胞的蛋白质,可以通过双抗体免疫法分离出此蛋白的基因.

基本原理:

核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体,而具有不同长度的新生肽链在核糖体上不断延伸;

将从细胞匀浆液中制备出的多聚核糖核蛋白体同特定抗体一起保温,形成多聚核糖体同抗体的复合体;

当加入特定蛋白的抗体产生的第二抗体时,产生沉淀,就可以通过不连续蔗糖梯度离心,将所要的含有特定的mRNA的多聚核糖体同总多聚核糖体分离;再通过酚,氯仿抽提去除蛋白及oligo-dT柱亲合层析,就可以得到为特定蛋白编码的mRNA,再通过反转录得到cDNA.

14化学合成

基因的化学合成

基因片段的全化学合成

首先合成一个基因的所有片段,相邻的片段间有4—6个碱基的重叠互补,退火后,用T4DNA连接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基因.

基因的化学—酶促合成

不需要合成完整基因的所有寡核苷酸片段,而是合成其中一些片段,相邻的3'-末端有一短的顺序相互补,在适当的条件下通过退火形成模板—引物复合体,然后在存在四种的条件下,用大肠杆菌DNA聚合酶I大片段填补互补片段之间的缺口,最后用T4DNA连接酶连接及适当的限制性内切酶.

15 PCR

PCR技术的应用

目的基因的直接克隆

与常规的基因克隆方法相比,PCR的优点是快速,简单,但是用PCR克隆目的基因的限制是必须知道侧接靶序列的核苷酸序列,以制备引物.因而该法具有很大的局限性.

可直接利用具有平端的PCR产物进行克隆,但利用合适的引物,在待克隆的目的基因二侧引入不同的限制性酶切点,则可将扩增之后的目的基因定向克隆到载体中,避免载体的自身环化,提高克隆效率.

cDNA的克隆

利用PCR技术,只需增加一步逆转录反应,便可从少数mRNA的构建cDNA文库,以mRNA为模板,以oligo(dT)为引物,在依赖于RNA 的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA第一链之后,可通过PCR扩增此链.

如在此链的3'端再加上一段鸟苷酸残基同聚物,则可以使用oligo(dT)和oligo(dC)作为后续PCR扩增的引物,也可酌情在这些引物的5'端加上限制性酶切点,以利于将所得的双链DNA 克隆到适当的载体中.

在某些情况下,如已知RNA(或其基因)两端的核苷酸序列,mRNA5'端核苷酸序列或其编码的蛋白质N端的氨基酸序列,便可设计特定的两端引物,用于直接克隆特定的目的基因cDNA,从而省略从cDNA文库中筛选cDNA克隆等序列费时的操作.

分子遗传学

?脱氧核糖核酸?核糖核酸?核糖核苷?脱氧[核糖]核苷?寡核苷酸

?反义寡核苷酸?反义肽核酸?核酶?中心法则?夏格夫法则

?沃森-克里克模型?沃森-克里克碱

基配对

?碱基配对?碱基比?互补碱基

?碱基对?核苷酸对? B型DNA ? Z型DNA ?反向平行[核苷酸]链

?发夹结构?发夹环? A型DNA ?超螺旋?双螺旋?互补性?十字形环?互补链?回文序列?共有序列

?环状结构域? D环?滑卡?无嘌呤嘧啶位

?双链体

?同源双链体?异源双链体?环状DNA ?共价闭合环状

DNA

?线状DNA

?单链DNA ?双链DNA ?双链RNA ?常居DNA ?叶绿体DNA

cDNA文库构建原理以及技术路线

CDNA文库 1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA,重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势,从而使它在个体发育,细胞分化,细胞周期调控 2. CDNA文库得质量 (1)文库的代表性 CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息(即mrna种类),它是体现文库质量地最重要标本。文库地库容量,它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数 N=ln(1-p)/ln(1-n/t),P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率,通常设为99%,N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数,n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数,t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数,以人类细胞为列,人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种,具体到某一特定类型地细胞中,表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15%。因此对于巨大部分地人类细胞,每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种,全体mrna序列地总拷贝约为500000个,而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。因此,用人类细胞来构建CDNA文库时候,要以99%概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息,构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为 N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5) 一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10(6)以上的库容量 3.MRNA是由5‘端非编码区,中间地编码序列和3’端非翻译区。非翻译区地序列特征对基因地表达具有重要地调控作用,其中编码产生地蛋白质产物都具有在结构上相对独立地结构域,存在与同一分子上地结构域对体现出蛋白产物在细胞中所行使地生物学功能。因此要从CDNA文库中分离获得目的基因完整地序列信息和功能信息,要求文库中地重组CDNA片断应尽可能完整获得目的基因结构 4.构建文库的载体系统 (1)入噬菌体载体系统是在CDNA文库构建中最早使用地载体系统,在载体本身地设计方面已经相当成熟,其主要优点是插入片断地装载容量大,适合与全长CDNA地克隆。重组子经专门地体外包装系统包装成有感染力地噬菌体颗粒,对宿主大肠杆菌地转染效率高,通常1ugCNDA构建出地CDNA文库,转染宿主菌后,都可以得到10(6)-10(7)以上地原始库容量,同时对重组克隆是否含有CDNA文库地插入片断地实际情况,有较好地质量控制指标,因此用这类载体地系统构建地CDNA文库质量高,代表性好,此外这类载体系统构建出地CDNA文库以重组噬菌体颗粒形式存在,这些重组噬菌体颗粒地感染活性在4度环境比较稳定,非常适合长期保存,但是可以采用地文库筛选方法很有限,文库中地CDNA 片断在宿主细胞无法功能性表达。 (2)质粒载体系统 可以功能性筛选:利用基因在体内体现其生物学活性所依据地生化基础,从文库中分离鉴定

简述cDNA文库构建的方法

简述cDNA文库构建的方法 1.1 mRNA纯化 构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%~5%,因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷,这个序列被称为poly(A)尾巴,是mRNA分子特有的而其他主要RNA 没有,poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸(oligo(dT))杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。 方法有三种: ·寡脱氧胸苷酸亲和层析:即分离mRNA的标准方法,将一个寡脱氧胸苷酸(12~18碱基)连接到纤维素的亲和层析柱法,总RNA混合物上样后,mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱,己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交:本方案也用寡脱氧胸苷酸-纤维素,但不用层析柱,而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠:本方案中,一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火,然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠,用磁分离器从大量溶液中分离球珠-mRNA复全体。移去磁分离器,加入洗脱缓冲液,并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下,寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 1.2cDNA的合成与克隆 1.2.1 cDNA第一条链的合成 所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应,有两个关键的因素,一个是mRNA模板,另一个反转录酶。 目前商业化的反转录酶主要有两种:一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase),另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’-5’外切酶活性,但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性,鼠源的具有相对较弱的RNAaseH酶活性。RNAase H酶活性在反应中起负作用,可降解mRNA分子末端的poly(A)序列和cDNA-RNA杂交分子中的RNA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。GIBCO-BRL公司出品一种鼠源反转录酶,称为SUPERSCRIPT反转录酶,缺少C-末端180个氨基酸,完全去除了其 RNAase H酶活性,保持完整的DNA聚合酶活性。 1.2.2 cDNA第二条链的合成 合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”,即将第一条链合成过种中形成的cDNA/RNA杂交分子变性,降解RNA,则单链cDNA分子的3’末端自身环化,形成发卡结构。以此为引物,在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链cDNA,在其相当于mRNA5’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环,得到可供克隆的双链cDNA分子。由于SI酶的消化反应难以控制,不可避免地导致对应于mRNA5’的序列出现缺失和重排,并造成克隆效率偏低,故该法基本上己被一些改进的方法所代替。主要的改进之处是在合成第一条链的反应体系中加入4mmol/L的焦磷酸钠,以抑制发卡结构的形成,这样便避免了使用SI 核酸酶。然后再用其他方法合成第二条链的引物。 1.2.3 cDNA的克隆 dscDNA(双链cDNA)合成后,将此DNA与载体(质粒或噬菌体)组成重组分子,然后转化到受体菌中进行扩增。cDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。质粒文库

cDNA文库的构建方法与原理

c D N A文库的构建方法与原理 蛋白质是细胞的功能分子:它们构成结构和调控分子,动力和泵蛋白,酶和受体。然而,如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列,或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。如果只限于将基因组DNA作为材料来源,由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质,那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。如果分析仅局限在编码序列,那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板,所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。不幸的是,现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。因此,产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA,由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。 1.基本原理 cDNA(Complementary DNA)是以mRNA为模板,在反转录酶作用下合成的互补DNA,它的顺序可代表mRNA序列。cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组,然后去转化克隆载体DNA 的宿主细胞,从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。其过程可概括为:(1)通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA;(2)cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。 cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途: 首先,cDNA克隆以mRNA为起始材料,这对于有些RNA病毒来说非常适用,因为它们的增殖并不经过DNA中间体,研究这样的生物有机体,cDNA克隆是唯一可行的方法。 第二,cDNA基因文库的筛选简单易行,恰当选择mRNA的来源,使所构建的cDNA基因文库中,某一特定序列的克隆达到很高的比例,简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。 第三,每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列,在选择中出现假阳性几率比较低,从阳性杂交信号选择出来的阳性克隆一般含有目的基因序列。 第四,cDNA克隆的另一用途是用于基因序列的测定,读码框(ORF)的界定,只有通过对mRNA5’核苷酸序列才能获得。 2.基本方法 2.1 mRNA纯化 构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%~5%,因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷,这个序列被称为poly(A)尾巴,是mRNA分子特有的而其他主要RNA没有,poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸(oligo(dT))杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。方法有三种: ·寡脱氧胸苷酸亲和层析:即分离mRNA的标准方法,将一个寡脱氧胸苷酸(12~18碱基)连接到纤维素的亲和层析柱法,总RNA混合物上样后,mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱,己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交:本方案也用寡脱氧胸苷酸-纤维素,但不用层析柱,而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠:本方案中,一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火,然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠,用磁分离器从大量溶液中分离球珠-mRNA复全体。移去磁分离器,加入洗脱缓冲液,并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下,寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 2.2 cDNA的合成与克隆

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库。 其基本步骤包括:(1)mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。(2)cDNA第一条链的合成。(3)cDNA第二条链的合成。(4)双链cDNA的修饰。(5)双链cDNA的分子克隆。(6)cDNA文库的扩增。(7)cDNA文库鉴定评价。 一、Superscipt II—RT合成第一链 1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul) (5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water (大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链,第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。)。

2. 混匀后,70℃反应10分钟。 3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5 min。 4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂: (1)4 ul 5×first strand buffer (2)2 ul 0.1 M DTT (3)1 ul 10 mM dNTP(自己配制) 5. 混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。 6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀。 7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶。 二、cDNA第二链的合成

cDNA文库构建简易流程

1、紫茎泽兰第一链cDNA的合成 取2 u1提取的紫茎泽兰mRNA,加入适量的CDSIII primer和SMART IV Oligo寡 核苷酸以及其它相应试剂,在适当的条件下,经反转录酶进行反转录合成紫茎泽兰第一链cDNA. 2、LD-PCR合成紫茎泽兰第二链cDNA 取合成的紫茎泽兰第一链cDNA加入其它试剂,通过LD-PCR进行双链cDNA的合成3、紫茎泽兰双链cDNA的酶切及分离纯化 双链cDNA经蛋白酶K消化去除DNA聚合酶活性,经氯仿:异戊醇抽提,酒精沉淀后,用限制性内切酶sfi I进行酶切消化。酶切后,过CHROMA SPIN-400柱进行分级分离纯化,以去除小的片段和杂质,依次收集16管,经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测后,收集cDNA 含量最高的几管。 4、双链cDNA片段的克隆和体外包装 分级分离纯化的双链cDNA,定向克隆到试剂盒提供的经sfi I酶切的去磷酸化的入λTripIEx2载体上,在载体量不变的前提下,设定了3个连接梯度反应,连接结束后,3个连接产物分别用Promega公司的Packagene Lambda DNA受Packaging System包装,体外包装条件按试剂盒说明进行。 5、文库的滴定与重组率检测 用常规方法检查文库的滴度。3个连接反应包装后,分别取1ul用1X Lambda dilution buffer按1:10稀释,稀释后的入噬菌体裂解物再分别取0. 5ul 加入到150ul预先过夜培养的XL1-BLue菌液,在37 C进行20min的吸附后,再加入到1. 5m1熔化的LB/MgSO4顶层软琼脂,迅速混匀倒到预热至37℃的平板上,快速摇动平板使顶层软琼脂分布均匀,顶层软琼脂凝固后在37℃培养箱中倒置培养,每相隔一段时间后,检查噬菌斑生长情况。根据长成的噬菌斑的数目进行文库的滴度计算,公式如下 : 文库的重组率则利用蓝白斑互选进行,在每1. 5m1的顶层琼脂加入50ul X-gal (20mg/ml) , 50ul IPTG (200mg/Ml),待噬菌斑长成后,统计蓝白斑的数量,算出重组率。 6、cDNA的PCR快速鉴定 从平皿中直接挑取噬菌斑,用5' PCR primer和3' PCR primer分别进行PCR扩增检查插入片段的长度。 初步结果:按l : 10的比例稀释后滴定,过夜后统计噬菌斑数目并计算滴度。1号和2号连接反应的噬菌斑很少,滴度很低,而3号连接反应的滴度为2.47X106pfu/ml, 滴度很高,符合建库标准。所以3号连接反应的cDNA与载体的比例最理想,连接效率最高。 紫茎泽兰cDNA的PCR快速鉴定,随机挑取10个透明噬菌斑,PCR扩增均有大于500bp的插入片段,进一步说明已成功获得了紫茎泽兰cDNA重组噬菌体。

构建cDNA文库应注意的事项

构建全长cDNA文库时应当注意事项 构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库,二者大同小异。但都应当注意以下四个方面: 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。 构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多,在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录,这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好,虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右,这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库,但这是针对材料极为稀缺者而言,但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量,如果采用纯化总mRNA后反转录,则对总RNA的杂质方面要求稍松,但对RNA的完整性则一丝不苟,要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录,则对总RNA的质量要求非常高,不仅要求RNA相当完整而无降解,而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少,最好是试剂盒抽提的。 二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。 这是构建cDNA文库中最贵的一步,也是核酸质变的一步,它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功,说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了,但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转;二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处,而很大一部分mRNA没有反转录完全,总的全长cDNA太少,这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大,但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术(可参考其GeneRacer说明书)从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法,但对mRNA的完整性要求非常高,理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全,才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。

cdna文库构建流程

cDNA文库组标准流程 一. Total RNA的提取 (2) 二. mRNA的分离 (5) 三.cDNA双链合成 (8) 四.载体制备 (11) 五. cDNA双链和载体的连接 (13) 六.电转化流程 (14) 七.快速鉴定、菌落PCR (16) 八.pBlueScript cDNA库扩增 (18)

一.Total RNA的提取 1.试剂配制 准备工作: 1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部,置于烤箱内,180℃,烤6小时。 2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后,121℃20mins 高压灭菌。 3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。 4、常用试剂及其配方: ▲DEPC水:在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。 ▲0.78M柠檬酸纳:PH=4~5 三水合柠檬酸纳22.94g 加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。 ▲10%肌氨酸钠: 肌氨酸钠10g 加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。 ▲变性裂解液: 0.78M柠檬酸钠8.25ml 10%肌氨酸钠12.375ml 异硫氰酸胍118.05g 加DEPC水定容至250ml,室温放置备用 临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%(v/v) ▲2M 醋酸钠PH=4.5 NaAc·3H2O 13.6g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用 ▲3M醋酸钠PH=5 NaAc·3H2O 20.4g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用▲4M LiCL: LiCL 24.164g 加DEPC水定容至100ml,高压灭菌,室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g 用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温 放置备用 ▲10X MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸):

CDNA文库构建的注意

构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库,二 者大同小异。无论怎样,应当注意如下几个方面:一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot 的要多,在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录,这比直接采用总RNA 进行反转录而构建的cDNA文库好,虽然后者也并不 是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子 要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右,这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库,但这 是针对材料极为稀缺者而言,但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量,如果采用纯化总mRNA后反转录, 则对总RNA的杂质方面要求稍松,但对RNA的完整性则一丝不苟,要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录,则对总RNA的质量要求非常高,不仅要求RNA相当完整而无降解,而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少,最好是试剂盒抽提的。二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。这是构建cDNA文库中最贵的一步,也是核酸质变的 一步,它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。 反转录不成功,说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了,但还有相 当一部分本该反转录的mRNA未被反转;二是只有少 部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处,而 很大一部分mRNA没有反转录完全,总的全长cDNA太少,这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手

cDNA文库的构建

cDNA文库的构建 https://www.wendangku.net/doc/8f14269511.html, 时间:2006-9-10 来源:生命经纬 分为六个阶段: 阶段1:反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2:cDNA第二链的合成 阶段3:cDNA的甲基化 阶段4:接头或衔接子的连接 阶段5:Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6:cDNA与λ噬菌体臂的连接 [阶段1:反转录酶催化合成cDNA第一链] 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成:poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl22μl dNTP溶液(含4种dNTP,每种5mmol/L)10μl 0.1 mol/L DTT 2μl

RNase抑制剂(选用)25单位 加H2O至48μl 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。 在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP(400 Ci/mmol, 10mCi/ml)。 3.大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。 4.温育接近结束时,在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA,然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min,然后转移至冰上。 5.参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法,测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸(TCA)沉淀的放射性活度。此外,用合适的DNA 分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。 6.按下述方法计算cDNA第一链的合成量(推算方法略): [掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg) 7.尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。 [阶段2:cDNA第二链的合成] 1.将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中: 10 mmol/L MgCl270μl 2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl 10 mCi/ml[α-32P] dCTP(400 Ci/mmol)10μl 1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl RNase H (1000单位/ml) 1μl 大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl 温和振荡将上述试剂混合,在微量离心机稍离心,以除去所有气泡。在16℃温育2~4

简述cDNA文库构建的方法(推荐文档)

简述cDNA文库构建的方法 1.1 mRNA纯化 构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%~5%,因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷,这个序列被称为poly(A)尾巴,是mRNA分子特有的而其他主要RNA 没有,poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸(oligo(dT))杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。 方法有三种: ·寡脱氧胸苷酸亲和层析:即分离mRNA的标准方法,将一个寡脱氧胸苷酸(12~18碱基)连接到纤维素的亲和层析柱法,总RNA混合物上样后,mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱,己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交:本方案也用寡脱氧胸苷酸-纤维素,但不用层析柱,而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠:本方案中,一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火,然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠,用磁分离器从大量溶液中分离球珠-mRNA复全体。移去磁分离器,加入洗脱缓冲液,并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下,寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 1.2cDNA的合成与克隆 1.2.1 cDNA第一条链的合成 所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应,有两个关键的因素,一个是mRNA模板,另一个反转录酶。 目前商业化的反转录酶主要有两种:一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase),另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’-5’外切酶活性,但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性,鼠源的具有相对较弱的RNAaseH酶活性。RNAase H酶活性在反应中起负作用,可降解mRNA分子末端的poly(A)序列和cDNA-RNA杂交分子中的RNA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。GIBCO-BRL公司出品一种鼠源反转录酶,称为SUPERSCRIPT反转录酶,缺少C-末端180个氨基酸,完全去除了其RNAase H酶活性,保持完整的DNA聚合酶活性。 1.2.2 cDNA第二条链的合成 合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”,即将第一条链合成过种中形成的cDNA/RNA杂交分子变性,降解RNA,则单链cDNA分子的3’末端自身环化,形成发卡结构。以此为引物,在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链cDNA,在其相当于mRNA5’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环,得到可供克隆的双链cDNA分子。由于SI酶的消化反应难以控制,不可避免地导致对应于mRNA5’的序列出现缺失和重排,并造成克隆效率偏低,故该法基本上己被一些改进的方法所代替。主要的改进之处是在合成第一条链的反应体系中加入4mmol/L的焦磷酸钠,以抑制发卡结构的形成,这样便避免了使用SI核酸酶。然后再用其他方法合成第二条链的引物。 1.2.3 cDNA的克隆 dscDNA(双链cDNA)合成后,将此DNA与载体(质粒或噬菌体)组成重组分子,然后转化到受体菌中进行扩增。cDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。质粒文

关于cDNA文库

1 cDNA 文库的构建 1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括:RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的cDNA 文库,获得高质量的mRNA 是至关重要的,所以处理mRNA 样品时必须仔细小心。由于RNA 酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA 很重要。在获得高质量的mRNA 后,用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成cDNA 第1链,cDNA 第2链的合成(用RNA 酶H 和大肠杆菌DNA 聚合酶I,同时包括使用T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA 连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链DNA 克隆到载体中去、分析cDNA 插入片断,扩增cDNA 文库、对建立的cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择,常规用的是λ 噬菌体,这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源DNA。 1.2 cDNA 全长文库 经典cDNA 文库的构建虽然高效、简便,但文库克隆的片段一般较小,单个克隆上的DNA 片段太短,所能提供的基因信息很少,大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNA。为了克隆到真正的cDNA 全长,建立富含全长的cDNA 文库具有重要意义。为此,必须克服仅用mRNA 的PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长cDNA 文库,是指从生物体内一套完整的mRNA 分子经反转录而得到的DNA 分子群体,是mRNA 分子群的一个完整的拷贝。全长cDNA 文库不仅能提供完整的mRNA 信息,而且可以通过基因序列比对得到mRNA 剪接信息,此外,还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国CLONTECH 公司的SMART cDNA Library Construction Kit 方法或GeneRacer 试剂盒(Invitrogen,USA) 使用说明进行。判断一个cDNA 文库中的cDNA 序列是否是全长基因的cDNA,主要方法有以下几种。 1.2.1 直接从序列上评价

cDNA文库及其构建.

cDNA文库 科技名词定义 中文名称:cDNA文库 英文名称:cDNA library 定义:含一种生物体所有基因编码的cDNA分子的克隆群。 应用学科:遗传学(一级学科);分子遗传学(二级学科) 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 概述 cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板,逆转录形成的互补DNA (cDNA)与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌形成重组DNA 克隆群,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中,在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因,因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。 cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA 文库获得的不同,基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。 cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势,从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值,是研究工作中最常使用到的基因文库。 定义 (cDNA Library)某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组,并将其引入到相应的宿主细胞中(一般为E.coli.)繁殖和扩增,理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息,称该生物基因组的cDNA文库。原理 经典cDNA文库构建的基本原理:用Oligo(dT)作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基本步骤包括:(1)mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。(2)cDNA第一条链的合成。(3)cDNA第二条链的合成。(4)双链cDNA的修饰。(5)双链cDNA的分子克隆。(6)cDNA文库的扩增。(7)cDNA文库鉴定评价。 cDNA文库构建的注意事项 构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库,二者大同小异。无论怎样,应当注意如下几个方面: 保证获得数量足够的高质量的起始RNA 构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多,在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录,这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好,虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右,这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA 也可以构建cDNA文库,但这是针对材料极为稀缺者而言,但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量,如果采用纯化总mRNA后反转录,则对总RNA的杂质方面要求稍松,但对RNA的完整性则一丝不苟,要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录,则对总RNA的质量要求非

cDNA文库构建方案

植物生理学与生物化学国家重点实验室(浙江大学) 实验室Protocol汇编 实验室主任:吴平 参编人员:寿惠霞,毛传澡,吴忠长,王首峰,莫肖蓉,刘洪家,易可可,李靖,黄方亮,周洁,何晓薇等 文本编辑:陈铭 (2005年12月15日) ?本实验室版权所有

一. cDNA文库构建方案 mRNA的纯化(PolyATtract mRNA Isolation systemIII Z5300) 准备:65℃水浴或heating block ;灭菌的无Rnase 1.5 ml 塑料试管;灭菌的无Rnase枪头 一.Annealing of probe 1.在一支干净的1.5ml 管中加入0.1-1.0 mg 总RNA,补无Rnase的水到500 ul; 2.65℃,10 min; 3.在RNA管中加 3ulBiotinglated-Oligo (dT) Probe 和 13 ul 20×SSC ,在适温下温和混匀,直到冷却,约要10 min;同时准备0.5×SSC和0.1×SSC. 二.Stock solution Preparation 1.在无Rnase试管中准备1.2 ml 无菌的0.5×SSC(30 ul20×SSC,+1.170ml Rnase-free water); 2.在无Rnase试管中准备1.4 ml 无菌的0.1×SSC(7.0 ul20×SSC,+1.393 ml Rnase-free water); 三.Washing of streptavitin paramagnetic particles 1.温和悬浮塑料试管中的颗粒至颗粒全部被分散,将小管放到Magnetic Stand 使SA-PMPS颗粒层积在管的一边(-30sec) 2.小心去除悬液,不要离心! 3.用0.5×SSC(每次0.3 ml)洗SA-PMPS颗粒三次,每次用Magnetic Stand 固定,小心移去悬液; 4.用0.1 ml 0.5×SSC 悬浮洗过的SA-PMPS颗粒颗粒。 四.Capture and washing of Annealed Oligo(dT)-mRNA hybrids. 1.将处理的RNA全部加入已经洗过的含SA-PMPS管中; 2.适温沉淀10 min,每1-2 min 温和地颠倒混合一次; 3.将SA-PMPS管放到Magnetic Stand固定,小心去处悬浮液,不要摇动SA-PMPS沉淀; 4.用 0.1 ×SSC 洗颗粒(轻轻将颗粒从管底弹起使所有颗粒悬浮)4次,每次0.3 ml; 最后一次洗颗粒后在不搅动颗粒沉淀的前提下尽可能去除悬浮液。 五.Elution of mRNA 1.用0.1 ml 无Rnase 水将洗过的颗粒沉淀轻轻弹起悬浮; 2.用Magnetic Stand 固定颗粒,将洗脱的mRNA 转移到灭菌的无Rnase 小管,不要将颗粒丢弃!

cDNA文库构建

cDNA文库构建 cDNA文库 [原理]: cDNA文库不同于基因组文库,被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始,在此基础上,通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链,然后除掉mRNA,以第一条DNA 链为模板复制出第二条DNA链(双链);再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 分为六个阶段: 阶段1:反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2:cDNA第二链的合成 阶段3:cDNA的甲基化 阶段4:接头或衔接子的连接 阶段5:Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6:cDNA与λ噬菌体臂的连接 [阶段1:反转录酶催化合成cDNA第一链] 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成: poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl

250 mmol/L MgCl 2μl 2 dNTP溶液(含4种dNTP,每种5mmol/L) 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂(选用) 25单位 O至 48μl 加H 2 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP(400 Ci/mmol, 10mCi/ml)。 3.大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。 4.温育接近结束时,在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA,然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min,然后转移至冰上。 5.参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法,测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸(TCA)沉淀的放射性活度。此外,用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。 6.按下述方法计算cDNA第一链的合成量(推算方法略): [掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg) 7.尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。 [阶段2:cDNA第二链的合成] 1.将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中: 10 mmol/L MgCl 70μl 2 2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl 10 mCi/ml[α-32P] dCTP(400 Ci/mmol) 10μl

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