细胞克隆形成实验

细胞克隆形成实验

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：

一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

实验方法：

平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验

(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞

(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。

平板克隆形成实验基本步骤：

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%

平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料

瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：

(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。

(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。

软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆)

将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备0.6％的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于37℃，5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。

注意事项

1.接种时细胞密度适度，不可过高。

2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞；

软琼脂克隆形成实验步骤完整版

软琼脂克隆形成实验步 骤完整版 集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]

注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWESTREGULARArgroseG10 （4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和 0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅 中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入1.5ml 混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数， 用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7%Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2 ×1640+2×PS）+2ml0.7%Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO ，37℃，培养2－3 2周。 8、间隔2天补加200ul10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个 克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。 10、数据处理：每个视野的面积是1mm2,6孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数× 960，如果要比较﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就得到总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比较。

软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)

注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7% Argrose上胶，降温后 放入42℃水浴锅中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3 个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每 孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞， 作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需 先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3 周。 8、间隔2天补加200ul 10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数 视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。

细胞克隆形成实验

细胞xx形成实验 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。 每个克隆含有50以上的细胞，大小在之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软xx集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板xx形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。 置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 软xx培养xx形成试验基本步骤： (1)取对数生长期细胞，用%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出%和%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。 (3)按1:1比例使%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 (4)按1:1比例让%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入的细胞悬液，充分混匀，注入铺有%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。 待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。

(完整版)细胞集落形成实验

细胞集落形成实验方法介绍 非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。 集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100% （一）原理 细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。 （二）实验用品 1.材料：Hela细胞。 2.器材：（直径60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。 3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。 （三）方法 1.平板克隆形成试验 本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。 (1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。 (2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。 (3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。 (4)培养皿置37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。 (5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。 2.软琼脂集落形成试验

细胞实验操作流程

细胞冻存、复苏及传代操作流程 1. 试剂与仪器： 1.1 试剂 PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL； 青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL； FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL； DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL； DMSO：SIGMA公司，货号：D8418； PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 1.2 仪器 生物安全柜： 离心机： 37℃恒温水浴箱： -80℃冰箱： 4℃冰箱： 荧光倒置显微镜： 37℃恒温培养箱： 液氮罐： 2、实验方法： 2.1 细胞冻存 配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。 将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离

心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。 悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。 将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。 2.3 细胞传代 状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。 悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。 ①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。 ②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。 3、注意事项 1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常

细胞克隆形成实验

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细胞克隆形成实验

细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50 以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DME培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37°C预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37C 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2?3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10?30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)X100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验

Soft Agar Colony Formation Assay Darren Carpizo, M.D. Overview: This assay is designed to assay a cell's ability to grow unattached to a surface and therefore suspended in agar. The assays are done in 6cm plates. A bottom layer of enriched media + agar is poured first (2.5ml), after solidifying this is followed by a layer containing a lower amount of agar and containing a specified number of cells (cell layer = 5ml), after solidifying a top layer is poured. The plates are placed in the incubator and after two weeks or so, colonies are counted by naked eye. 1)Make sol'ns of 2X Iscove's Media (Gibco BRL, dissolve one 1L packet in 500ml of water) and filter sterilize, make about 100 ml of 1X by diluting the 2X, separate from this 100ml make 100 ml of 1X Iscove's containing 10% FBS 2)Make Noble Agar (Difco) at 1.3% and place in 55° C water bath to keep in liquid phase 3)Determine the number of sample pairs you will be making (a sample pair consists of one plate control and one plate experimental. I usually made 4 sample pairs or an n of 4. Add one to this, so n of 4 +1 = 5 4)The bottom and top layer solutions are made as one and divided in half. The cell layer solution is made separately. 5)Determine the volume of reagents that make up each of the above solutions according to the following formula: Bottom/Top layer - 2X Iscove's 5ml X n sample pairs (5) = 25 ml FBS - 1ml X n sample pairs (5) = 5ml 100X Glutamine .1 ml X n sample pairs = 0.5 ml 1.3% Noble Agar - 5ml X n sample pairs = 25ml pour these volumes into a 50 ml conical and separate the total volume in 1/2 into one tube for the bottom and the other for the top **Do Not add the Agar until you are just ready to pour, so separate the total (without the agar) into a bottom and top tubes (the volume of agar that will be added to each will be 12.5ml) Cell Layer media - 2X Iscove's 2 X n = 10ml 1X Iscove's 4 X n = 20ml FBS 1 X n = 5ml 100X glutamine 0.08 x n = .4 ml Noble agar 2 X n = 10ml (again do not add this until ready to pour) 6)Pour 12.5 ml of 1.3% Noble agar to the bottom layer tube, mix thoroughly and pipette 2.5 ml to each of 8 plates, place in 37° C incubator 7)Trypsinize cells, collect disattached cells and spin down, rususpend pellet in 5ml of 1X Iscove's + 10% FBS for counting. Determine the conc of cells in cells/ml and then calculate

软琼脂克隆形成试验

克隆形成试验-软琼脂克隆形成试验 克隆形成率 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。 1、平板克隆形成试验 基本步骤： (1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。 (2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。 (3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 (4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆数 克隆形成率= —————×100% 接种细胞数 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 2、软琼脂培养克隆形成试验 基本步骤： (1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。 (3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 (4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。 (5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超

细胞克隆形成实验

精心整理 细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力 正常 ?(a)? ?(b)? 1、10% 2 10mL37 3、2次。加4%10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：? (1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。? (2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。? (3)按 3mL温箱中备用。? (4)按0.2mL 置入37 (5) 不超过 将1.2 1.4ml10000个/ml 加1ml CO2的 1.接种时细胞密度适度，不可过高。 2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞； 3.琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装； 4.细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响； 5.细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%

软琼脂克隆形成实验

软琼脂克隆形成实验原理及步骤 原理：软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液态的情况，在此状态下检测细胞的增殖能力。单细胞处于soft agar中，就如胰酶消化后的状态，及圆形，此后细胞继续增殖、分裂，形成单克隆球形。半固体环境肯定是要求恶性程度高的容易生长，所以不会比平板克隆快，只要能够和对照比较即有意义。 步骤： 1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双 抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。

4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔板，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于 100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即 4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7%Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS+2ml0.7%Argrose）上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔板中，每孔1ml。一般每个实验组重复3个样本，待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3周。 8、间隔2天补加200ul10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。 10、数据处理：每个视野的面积是1mm2,6孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数×960，如果要比较﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm 的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就得到总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比较。 11.统计学分析：根据集落数和克隆形成率进行t检验，分析不同组别之间的差异。 注意：1）软琼脂克隆的操作相对复杂，在实验过程中一定要注意无菌操作。 2）在将琼脂于培养基混匀时，要注意琼脂温度，而且动作要迅速，避免局部结块。

细胞克隆形成实验

细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料

细胞克隆形成实验

1．2．3克隆形成分析 (1)药物处理 T25培养瓶中细胞以基础培养基洗1遍，并在基础培养基中饥饿2d'时，然后 换回条件培养基，以恩度(200ng／m1)、顺铂(8pM)以及两药联合使用，标准 条件下孵育细胞6d,时。其中，涉及到恩度处理时，在饥饿后半程即以相应浓度 的恩度预处理细胞1小时。实验设对照(contr01)。 (2)细胞接种 吸弃培养基，胰酶工作液分别收集细胞，以条件培养基洗2遍后，将细胞悬 浮于条件培养基中，计数3次，取均值，调整细胞悬液浓度至1 x103／ml。6孔培养板中加入2．6ml条件培养／孔，在C02培养箱中平衡后，每孔加入0．4ml细胞悬液(400个细胞)，终体积为3ml。接种时十字方向摇晃培养板，振动培养板边，使 细胞尽量均匀分布。其中，涉及到恩度处理过的细胞，在接种过程中使用含有 200ng／ml,恩,度的条件培养基。 (3)细胞培养 细胞在标准条件下培养2～3周，每3天更换条件培养基，观察克隆形成情况。 其中，以恩度干预的细胞，换液时使用含有该浓度恩度的条件培养基。 (4)克隆染色 当细胞形成肉眼可见的克隆(每个克隆细胞数在50'--'150个左右)时终止培 养。弃去培养基，用DPBS(O．01moUL，pH 7．4)小心浸洗细胞2次后，加入甲醇lml／孔，固定15min后，弃去固定液，以流水缓慢冲洗干净，每孔加入lml的姬姆萨使用液染色30min，以流水缓慢洗去染色液，通风橱中干燥。 (5)克隆计数 将培养板放置在凝胶成像系统，使用可见光条件，以随机所带软件计数克 隆数目，扫描并保存图像。克隆形成率(％)=克隆数目／接种细胞数x100％。调 整后的克隆形成率(％)=克隆形成率(％)／对照组克隆形成率(％)。每种药物 处理的细胞样本接种3个复孔，独立重复3次实验。

细胞克隆形成实验步骤及方法

细胞克隆形成实验步骤及方法 一、技术简介 细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。实验方法包括平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强；初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强。由于克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。 二、实验流程 A．平板克隆形成实验：适用于贴壁生长的细胞。 1. 取对数生长期的各组细胞，制备细胞悬液。 2. 将细胞悬液作梯度倍数稀释，分别接种含培养液的皿中，培养2-3周。 3. 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。 4. 弃去上清液，4%多聚甲醛固定，GIMSA染色液染10-30 min。 5. 计算克隆形成率，克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）× 100%。 6. 结果统计分析。 B．软琼脂克隆形成实验：适用于非锚着依赖性生长的细胞。 1. 制备细胞悬液，梯度倍数稀释。 2. 分别制备1.2%和0.7%琼脂糖溶液。 3. 下层琼脂凝固后放入37℃培养箱备用。

克隆形成实验

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 克隆形成实验 细胞生长状况有关指标的检测方法 一、细胞计数 这是细胞培养中常用的基本技术之一。所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。 细胞计数的基本步骤： (1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干. (2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡. (3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。 细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数 台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。 细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100% 细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。 在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。 二、细胞生长曲线和生长倍数 细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。 测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。 也可采用MTT法来进行生长曲线测定，较上述方法简便。 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期和生长稳定，最后衰老。 细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度，经一个生长周期达到最大活细胞浓度的比率。 生长倍数=培养后最大活细胞浓度/接种时的活细胞浓度 三、细胞分裂指数

Colony formation assay(细胞克隆形成)

Colony formation assay OG 1-14-2001 These assays are based on the principle that certain proteins when expressed stably cause either cell cycle arrest or cell death, hence a reduction in colony number. 1.Plate out SAOS-2 (p53 -/-. pRB -/-), H1299 (p53 -/-. pRB +/+) or U2OS (p53 +/+, pRB +/+) in p60 dishes for transfection next day. The cells should be approximately 60-70 % (SAOS-2), or appr. 40-60 % (H1299, U2OS) confluent, respectively, on the day of transfection. Use 5 ml of medium per p60 dish. 2.Transfect the cells. You can either use BES calcium phosphate or Fugene-6 (Roche) – either one works well. Probably Fugene has lower toxicity, though. 3.With Fugene-6 transfect as follows: A.Aliquot the DNA’s (2.5 μg) into Falcon 2054 tubes. B.Prepare a master mix in a separate Falcon tube for all the transfections (make enough for one more transfection than you need because of pipetting errors). Mix 117.5 μl DMEM (without serum, or antibiotics) with 7.5 μl Fugene-6 per transfection. Incubate 5 min. C. Add the DMEM/ Fugene mixture (125 μl) to each tube with DNA and mix by piptetting up and down gently. Incubate 15 min at RT. D.Add the DMEM/ Fugene/ DNA mixture to the cells dropwise. E.The transfection mixture can remain on the cells overnight, since it’s not very toxic. Note on DNA to use: The DNA you transfect must have a drug resistance marker, preferably puromycin (it’s faster) but neomycin or hygromcyin may also be used. For this assay, pBabe-puro works quite well as a vector for puromycin selection. 4.Th e next day after transfection pass the cells from p60’s into p100 dishes. 5.Two days after transfection start the selection by adding the appropriate amount of selection drug. E.g. add puromycin to a final conc. of 1-1.5 μg/ml (for pBabe-puro). For G418 selection, 500 μg/ml is a good starting point. 6.Every 3-4 days the medium should be replaced with fresh medium containing the selection drug. Most of the non-resistant cells are dead after 3-4 days of puromycin