一株产聚谷氨酸芽孢杆菌的分离与鉴定

一株产聚谷氨酸芽孢杆菌的分离与鉴定

惠明　马晓娜　贾洁　牛天贵

(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083)

收稿日期:2004211203

作者简介:惠明,博士研究生;牛天贵,教授,通讯作者,主要从事微生物资源发掘及发酵工程方面的研究,E 2mail :niutiangui @

https://www.wendangku.net/doc/8c14694057.html,

摘　要　从超高压灭菌的瓜汁中筛选出1株产高分子聚合物的芽孢杆菌B 53。经紫外扫描、高效液相色谱分析及

SDS 2PA GE 分子量表征,确定该高分子是由谷氨酸单一成分组成的聚合物,最大吸收波长为212nm ,分子质量集中

在570～669ku ,呈多分子质量聚集体形式,不具备典型肽或蛋白质特征。依据B 53的菌株形态、生理生化特征、G +

C 含量(摩尔分数)及16S rRNA 基因序列分析结果,将芽孢杆菌B 53菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。

关键词　芽孢杆菌;聚γ2谷氨酸;分离;鉴定

中图分类号　Q 939 文章编号　100724333(2005)0120006204 文献标识码　A

Isolation and identification of a Bacillus sp.producing

poly (γ2glutamic acid )

Hui Ming ,Ma X iaona ,Jia Jie ,Niu Tiangui

(College of Food Science and Nutritional Engineering ,China Agricultural University ,Beijing 100083)

Abstract A Bacillus strain is olate d from cantaloup e juice treate d by s up erhigh 2press ure sterile was shown to produce a high molecular polymer.The purifie d polymer ,was a homopolymer of glutamic acid and ha d an a bs orption p eak at 212nm.The molecular mass was 570-669ku detecte d by SDS 2PAGE electrophoresis and ha d no typical structure of pro 2tein.With the following identifications of colony morphology ,physiological and biochemistry exp eriments ,G +C content and 16S rRNA gene s equence as well ,the strain was identifie d as B.s ubtilis.

K ey words Bacillus sp.;poly γ2glutamic acid ;is olation;identification

聚谷氨酸(γ2P G A )主要是一些芽孢杆菌产生的

一种胞外氨基酸聚合物。1937年Ivanovic 等发现炭疽芽孢杆菌的荚膜物质的主要成分是D 2谷氨酸的聚合物[1]。1942年Bovarnick 等首次发现枯草芽

孢杆菌能够产生聚2γ2谷氨酸[2],以后进一步发现短

小芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌等也能产生聚2γ2谷氨酸。由于聚谷氨酸是一种水溶性可生物降解的高分

子生物材料,可作为药物载体、增稠剂和保湿剂应用于医药、食品和化妆品的生产,还可作为保水剂(抗旱)及水果、蔬菜的防冻剂,以及作为废水处理所需的生物絮凝剂及重金属螯合剂,等等,应用非常广泛[3-5];但由于生产成本较高,至今在世界范围内未有工业化大规模生产。目前国外用于研究聚谷氨

酸生产的典型菌株主要有B acill us lichenif orm is A TCC9945a (从土壤中分离得到)[6]和 B.subtilis IFO3335(从豆制品中分离得到)[7]等,我国有学者

从国外购得菌种进行研究[8,9],但未见分离筛选聚谷氨酸产生菌的报道。本研究旨在分离和鉴定本菌种。

1　材料与方法

111　材料

1)分离样品。超高压灭菌瓜汁(500MPa ,20min )、豆豉、酱豆、腐乳、腊肉、奶酪、中草药等。

2)培养基。

a 1筛选固体培养基(LB ):胰蛋白胨10g/L ,酵

中国农业大学学报　2005,10(1):6-9,63Journal of China Agricultural University

母膏5g/L,NaCl10g/L,琼脂20g/L,p H710。

b1种子培养基:在筛选培养基中添加1g/L的葡萄糖,不加琼脂。

c1发酵培养基[10]:柠檬酸12g/L,谷氨酸20g/ L,甘油80g/L,氯化铵7g/L,KH2PO4015g/L,Mg2 SO4?7H2O015g/L,MnSO4?H2O011g/L CaCl2 0115g/L,FeCl3?6H2O0104g/L,p H714。

112　筛选方法

将分离样品加适量无菌水稀释或浸泡30min,然后煮沸5min,经适当稀释涂布LB平板,37℃培养24h。选择表面光滑呈黏液状的单菌落,经平板划线分纯后保存于LB斜面。分别接种发酵培养基(300mL摇瓶装液量50mL),37℃200r/min条件下振荡培养96h,发酵液经离心除菌(4℃,000 r/min,20min)用SNB21型数字式黏度计测表观黏度,选择表观黏度较大的8株菌作为复筛菌种。113　目的产物的提取

复筛菌株的发酵液经离心除菌后,取上清液,加入4倍于上清液体积的乙醇,搅动后于6000r/min 离心20min,收集沉淀物。沉淀物用适量去离子水溶解,加入4倍于其体积的乙醇沉淀,此沉淀物用p H6198的磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲液溶解后,加入5倍于其体积、预冷的丙酮,6000r/min离心20min。将沉淀物倒入截留分子质量8～12ku的透析袋透析40min,换水2～3次,冷冻干燥得检测样品。

114　产物成分分析

1)紫外扫描光谱分析。将提纯产物0102g溶于10mL蒸馏水,在200～600nm扫描(TECH2 COMP UV7500),检验产物最大吸收波长。

2)HPLC分析。

a1酸水解。取样品012g放入水解管中,加入10mL6mol/L的HCl,抽真空,维持10min后封口, 110℃水解24h,冷却后移至100mL容量瓶中,用超纯水洗涤3次,定容,过滤后取滤液分析氨基酸含量。

b1色谱条件。固定相:Lichro CAR T superpher CH28,粒径4μm,250mm×4mm ID(Merk Dar2 mastand,F.R.G)。流动相:A液中V(乙腈)∶V(醋酸钠缓冲液)=20∶80,B液中V(乙腈)∶V(醋酸钠缓冲液)=70∶30,其中乙腈为色谱纯,醋酸缓冲液0105mol/L,p H412;A液和B液中各加入3滴三乙胺。荧光检测器:激发光波长λEX=260nm,发射光波长λEM=310nm。

c1柱前衍生。吸取1mL消化液或标准液,于25mL磨口烧瓶中60℃蒸干,加1mL超重水重复2次,加入2mL内标溶液(牛磺酸)。在10mL试管中依次加入014mL硼酸钠缓冲液(015mol/L,p H 717),011mL标准或样本溶液和016mL FMOC (fluorenyl methylchloroformate)溶液(155mg FMOC 溶于40mL丙酮,冰箱保存),摇动40s后加入2mL 正戊烷(HPLC级),提取过量的FMOC,重复3次。吸取衍生后的样品液011mL加入110mL洗脱液A 进行稀释,然后进样20μL。

3)用SDS2PA GE电泳法测定聚谷氨酸的分子质量。采用分离胶10%(m(胶)∶m(水),下同),堆积胶5%,电泳条件为操作电压80V,稳压3h,标准蛋白质用考马斯亮蓝R250染色,P G A用阿利新兰8GX染色。其他参照文献[11]进行。

115　菌株的生理生化鉴定

菌体形态特征和生理生化特征测定参照文献[12]进行。

116　遗传特性鉴定

1)G+C含量(摩尔分数)的测定。

采用PerkinElmer Lambda35UV/Vis Spec2 trometer测定,模式株:Escherichia coli K12(熔点温度θm=75℃),DNA提取方法参考文献[13]。

2)16S rRNA基因序列的测定。

a1细菌菌株基因组DNA的提取。使用赛百盛公司的基因组DNA提纯试剂盒提取。

b116S rRNA基因序列的PCR反应。以细菌基因组DNA为模板,选择细菌16S rRNA基因特异性引物,使用赛百盛公司的PCR相关试剂,根据产品说明设置反应体系和反应条件。PCR仪为PerkinElmer公司的PTC100型。引物:27f:5′2 G A G A GTTTG A TCCTGGCTCA G23′;530f:5′2GT2 GCCA GCA GCCGCGG23;1541r:5′2AA GG A GGT2 G A TCCA GCCGCA23′。

使用Q IA GEN公司的切胶回收试剂盒对PCR 产物进行回收。

c116S rRNA基因序列测定:采用AB I公司3730XL型DNA测序仪。

2　结果与讨论

211　聚谷氨酸产生菌的筛选

从超高压灭菌处理和辐照处理的哈蜜瓜汁、中

7

　第1期惠明等:一株产聚谷氨酸芽孢杆菌的分离与鉴定

国传统豆制品(干豆豉、豆瓣酱、腐乳、酱豆、辣豆等)、法国奶酪、香肠、腊肉、蟹酥、酱菜、中草药等34个样品中分离出131株产芽孢杆菌,经平板初筛和摇瓶发酵初步确定8株目标菌株。

提取8株目标菌株的摇瓶发酵产物,进行紫外扫描,发现B 53菌株的发酵产物最大吸收波长为212nm ,并且只有1个峰(图1),与聚谷氨酸的典型紫外吸收波长非常接近(214nm ),于是确定B 53菌株为下一步研究的出发菌株。该物质在260～280nm 没有吸收峰,表明其没有典型的肽链结构

。

图1　B 53菌株发酵产物的紫外扫描光谱

Fig.1　Ultraviolet absorbtion spectrum of the polymer

212　B 53菌株发酵产物的成分分析

对B 53纯化产物常规盐酸水解后,再经处理进行液相色谱分析(图2)。其中左侧第1个峰为内标物即牛磺酸(出峰时间5174min );第3个为溶剂峰即FMOC (出峰时间27126min ),可见此聚合物的水解产物只含有1种氨基酸;第2个峰(出峰时间9174min )与谷氨酸的出峰时间相同,推断此水解物为谷氨酸

。

图2　高效液相色谱分析

Fig.2　HPLC analysis of the polymer

采用SDS 2PA GE 变性电泳检测到B 53产生的聚

谷氨酸的分子质量570～669ku ,呈多分子质量分子聚集体形式,并非由单一分子质量组成(图3)

。

1号泳道为高分子质量标准蛋白质;2,3和4号为样品重复

图3　SDS 2PAGE 电泳图

Fig.3　Electrophoresis pattern of SDS 2PA GE

213　B 53菌株的鉴定

21311　形态特征　B 53菌株在LB 平板上菌落呈圆

形,乳白色,表面光滑,菌苔边缘整齐,中间突起。个体较大,细胞形状为杆状,革兰氏阳性,芽孢中生,不膨大。经运动性观察,该菌株具有运动性。21312　生理生化特征　以 B.subtilis CGM 2CC11943T 为参比菌株,对B 53菌株进行了部分生理

生化特征测定,结果见表1。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版(1994)对芽孢杆菌的阐述,确定B 53菌株为芽孢杆菌,命名为Bacillus sp.B 53。与模式株相比,生化特性基本一致。

表1　菌株B 53生理生化试验结果T able 1　Results of physiological and biochemistry experiments 项　目B acillus sp.B 53B acillus subtilis

CGMCC11943T

葡萄糖发酵++麦芽糖发酵++棉子糖发酵++木糖发酵++乳糖发酵++甘露醇发酵++阿拉伯糖发酵++2%NaCl 3++5%NaCl 3++7%NaCl 3++10%NaCl 3-+葡萄糖产气--厌氧生长--淀粉水解++酪阮水解++硝酸盐还原++H 2O 2酶试验++卵磷脂酶+-柠檬酸盐试验++石蕊牛奶还原++V 2P 测定

++明胶液化试验++x (G +C )/%

4319

43

注:3为体积分数;“+”为反应阳性,“-”为反应阴性;x (G +

C )为摩尔分数。

8

中国农业大学学报2005年第10卷

21313　遗传特征

1)B 53菌株基因组DNA G +C 含量的测定。测

定得到B 53菌株的θm 为7115℃,而模式株Es 2cherichia coli K 12的θm 为75℃,所以B 53菌株的G +C 摩尔分数

x (G +C )=5112+2108×(7115-75)=43192%

B.subtilis 的G +C 摩尔分数为43%,与B 53菌株比

较接近,因此2株菌可能同种。

2)B 53菌株16S rRNA 序列分析。将得到的16S rRNA 基因序列送G enBank 做Blast 比较(测定序列的G enBank accession number 为A Y808064),结果见图4

。

图4　B 53菌株与枯草芽孢杆菌16S r RNA 的基因序列

Fig.4　Comparison of 16S rRNA gene sequences between B 53and B.subtilis

根据G enBank 中提供的基因序列,同源性最高

的菌株为 B.subtilis (ACCESSION Z99104AL009126[14]),同源性为9716%,因此B 53菌株鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌种。因为该菌株是500MPa 超高压灭菌瓜汁中残存的典型菌株,分类鉴定的结果对解决瓜汁变质和进行安全性评价具有积极意义。

3　结　论

从分离得到的131株产芽孢细菌中筛选出1株高分子聚合物产生菌B 53。采用高效液相色谱及SDS 2PA GE 分析,确定B 53菌株所产的高分子聚合物为聚谷氨酸,其分子质量集中在570～669ku ,呈多分子质量分子聚集体形式,最大吸收波长为212nm ,

(下转第63页)

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　第1期

惠明等:一株产聚谷氨酸芽孢杆菌的分离与鉴定

别为01604,01576和01540W/(m?K);回归方程的计算结果分别为01610,01580和01534W/(m?K)。经显著性检测分析,实际测定结果与计算结果能很好地吻合,验证了所建立的预测模型的可靠性。

3　结束语

采用微热探针测试装置可方便、快捷地测试果汁的热导率。测试过程中,被测果汁的温升小,对试样的物性影响小,测试结果可较准确地反映果汁的实际状态。通过对同一外界温度(27℃)下不同质量分数苹果汁热导率的测试,得出了热导率与果汁质量分数的经验关系式,果汁质量分数0～70%时,热导率随果汁质量分数的增大而呈线性递减趋势,这一结果可为果汁加工业提供理论参考与测试方法。果汁热导率与外界温度的关系,将作为下一步的研究。

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(上接第9页)

不具备典型肽及蛋白质特征。依据B53的菌株形态、生理生化及遗传特征,鉴定B53菌株为枯草芽孢杆菌。

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　第1期张敏等:苹果汁热导率的试验研究