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高效液相色谱仪的管理与维护

高效液相色谱仪的管理与维护
高效液相色谱仪的管理与维护

高效液相色谱仪的管理与维护

1引言

高精度的输液泵,应用广泛的色谱分离柱,低噪音、高灵敏度的各种检测器以及功能强大的数据处理软件系统的出现,都推动了液相色谱技术的迅猛发展。液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐,广泛地应用于生物医药研究、环境监测和食品检测等领域。我们在应用先进的HPLC技术进行各种科研工作中,为保证分析结果的科学性和准确性,必须重视和加强对液相色谱仪的管理和维护。只有良好规范的管理(GLp),才能使仪器处于最佳工作状态,保证各项分析工作顺利完成,得出的实验数据才最真实可靠。我们希望通过本文的技术交流,能使广大液相色谱工作者不仅掌握液相色谱技术,还能管理和维护好液相色谱仪。

2 液相色谱仪流路泵系统的管理与维护

液相色谱仪的流路系统主要是由输液泵和连接管道组成。输液泵的主要作用是把流动相和样品带人色谱柱中,使样品在色谱柱固定相和流动相之间作用并实现分离。因此,正确配制流动相,维护好泵体和连接管路,对保证输液泵的流量精度和保留时间(tR)的重复性十分重要。

2.1流动相的配制和准备

2.1.1溶剂的纯化

在高效液相色谱分析中,正相色谱以已烷作为流动相的主体,二氯甲烷、氯仿、乙醚作为改性剂;反相色谱以水作为主体,以甲醇、乙睛、四氢吠喃作为改性剂。HPLC分析均应使用HPLC级纯度的溶剂,AR级的溶剂可能会由于杂质的存在而出现鬼峰。正相色谱分析中使用的己烷、二氯甲烷、氯仿、乙醚中经常含有微量的水分,这会改变液固色谱柱的分离性能,使用前应用球形分子筛柱脱去水分。反相色谱分析中使用的甲醇、乙睛、四氢吠喃,不必脱除微量水,但甲醇、乙睛等使用前最好经硅胶柱净化,去除具有紫外吸收的杂质。要保证配制流动相用水的纯度足够高。由于去离子水通常含有一些有机物,所以不适合用于HPLc分析用,最好使用超纯水(电阻率18Mfl.cm)。如果条件有限,可将去离子水再次蒸馏,现用现蒸,保持新鲜,还能脱去CO:,使用效果也不错。

2.1.2缓冲溶液

有些分析需要用到缓冲盐的流动相,配制时盐试剂要用AR级以上、没有污染、过期;现用现配,不要储存时间过长,避免pH值发生变化和成分分解,影响色谱分离的效果。缓冲盐的流动相最好能在实验室自己配制,商品化的流动相可能会添加有硫代硫酸钠稳定剂,会影响缓冲液的光学和色谱性能。

2.1.3过滤

无论是有机水溶液还是缓冲盐溶液的流动相,配好后都要通过0.45卜m滤膜过滤后再上机使用,这样能够有效防止由于微粒的存在使流路管道堵塞。过滤后应把溶剂放在密闭容器中,以防止被重新污染。过滤后的溶液既可用于色谱分析,也可用于清洗诸如泵头、柱塞杆、单向阀和密封圈等仪器部件,保持输液泵的性能良好。

2.1.4脱气

所有的流动相在进人HPLC系统之前都应该首先脱气(即使仪器上有在线脱气),因为没有脱气的流动相进人到高压系统后·,存在的气泡会导致系统的流速和压力不稳定,出现鬼峰等间题。从溶液中排除气泡的方法主要有:真空脱气、氦气脱气和超声波脱气实际工作中真空抽滤的方法很有效,它既能脱气又能过滤,但必须在上机前完成。在线连续脱气可以防止气体随温度的变化重新溶解在溶剂中。

2.1.5流动相的化学特性

流动相一般不要使用强酸或强碱溶液。因为pH值过高或过低会损坏输液泵中的密封圈和柱塞杆,除非流路需要钝化(用Zm心L的硝酸溶液),也应用后立即用纯水冲净。

在使用含水较高的流动相时,应注意不同色谱柱使用方面的限制,因为传统的烷基键合固定相在有机溶剂含量低于5%的流动相中容易发生碳链断裂一些新型键合固定相可以在纯水为流动相的条件下使用。

2.2系统管路和连接

2.2.1管路

根据承受压力的大小和流动相、样品性质的差异,液相色谱仪需采用不同材质的管路,常有不锈钢管和聚四氟已烯管。管路材质选择不当将导致谱带展宽,甚至引起样品变性,直接影响到分析结果。不锈钢管耐腐蚀,一般用于有高压的部分,即连接从泵出口到检测器人口段处,使用前应先经甲醇*水*硝酸溶液处理;塑料聚和物管柔韧性好,化学惰性强,多用于从储液器到泵、检测器出口和泄液阀出口,使用前应先用甲醇冲洗即可。另外,流路管线应保持通畅,不要存在硬性弯曲部分。

2.2.2连接

理想的HPLC系统应是死体积最小、密封性好不漏液。为减少死体积,降低柱外效应(会使色谱峰展宽),从进样器到柱及柱到检测器之间,应尽可能采用较短且较细内径的连接管。此外,采用较大内径、较长的色谱柱时,柱内峰展宽较大。对于其它位置连接管的长度和直径要求不十分严格,只要在换溶剂时达到快速、干净的目的即可。管路选择的基本原则为有样品通过的管路内径要细,而排放用的管路可以稍粗。

3 色谱分离柱的使用与维护

色谱柱是高效液相色谱仪实现分离过程的核心部件,使用和维护好色谱柱是保持柱效、延长柱寿命的重要措施。色谱分析中具备稳定高效的色谱柱和固定相是建立适合范围广、重现性理想的分析方法的基本保证。色谱柱在使用过程中常出现的问题主要涉及到:色谱柱的寿命、保留时间与分离度的重现性色谱峰脱尾等方面。

3.1色谱柱的使用寿命

色谱柱使用过程中,会由于各种原因导致分离失败或色谱柱失效,主要表现有:色谱柱反压增高、峰脱尾、塔板数下降、保留值降低等。造成这些问题的原因主要有柱滤板问题、强保留组份影响和化学影响等,下面将分别讨论:

3,1.,色谱柱筛板问题及对策

色谱柱人口筛板堵塞是色谱柱最常见的问题之一,筛板堵塞会导致柱压升高,色谱峰脱尾、塔板数降低。注射样品中含有微粒杂质,最有可能堵塞色谱柱人口,降低柱寿命,故要在注样前,将样品过滤或离心;进样器与泵密封垫的磨损也会带来微粒,故可在进样阀与色谱柱之间用在线过滤器,常可避免色谱柱滤板堵塞问题。当筛板部分堵塞或进口处填料塌陷形成异常峰形时,可用强溶剂反冲色谱柱(低速)。如不见效,则需更换筛板,或重新填补填料后更换筛板

3.1.2强保留样品组份影响及控制

强吸附性的样品组分吸附在柱头填料上,能严重地缩短色谱柱寿命,在分析生物体液时尤为突出。这时,可在色谱柱加一保护柱,能够有效减少强吸附组分的污染。保护柱(预柱)是内装填料与分离柱性质相近的短柱,接在分离柱之前,可代替流路过滤器。保护柱的作用是吸附强保留组分,收集和阻塞化学垃圾进人分离柱,这些垃圾如果直接进人分离柱会逐渐堆积在柱头,最终降低柱效能。保护柱是消耗品,如分析血浆样品,一般分析50个样品后需更换新柱芯。另外,每次分析结束后可用强溶剂冲洗分离柱(应卸下保护柱),以除去可能吸附在分离柱柱头的污物,有效延长色谱柱的使用寿命。

3.1.3化学影响

在分离过程中色谱柱固定相的流失会显著降低柱的使用寿命,应避免使用对固定相侵蚀性强的固定/流动相组合。短链硅烷基基团反相柱稳定性最差在低pH条件下可很快流失有机相,而长链烷基反相柱(C18、CS)较稳定。我们应合理选择分离柱。选择色谱分离柱主要根据两点,一是根据待测组分的分子量的大小,二是根据流动相条件,包括pH值、离子强度和溶剂极性等。完全经化的硅胶基质的键合相柱,其表面的硅经基分布均匀单一,稳定性好,通常要求流动相pH值在3一7之间,极端pH值(<2或>8)的流动相会溶解硅胶,使键合相流失。而目前利用先进的杂化颗粒技术研制的高纯硅胶颗粒填料(如Waters公司的XTer-ra色谱柱),集硅胶和多孔聚合物填料的优点为一体使有机硅烷单元取代了相当一部分占据颗粒内部和表面位置的硅经基,使这种新型填料具有分辨率高稳定性强、pH范围宽(1一12)的优势,其性能突破了传统高效液相色谱柱的极限。所以一定要根据分析的对象、流动相的条件选择合适的分离柱,茫然时可向公司的技术人员咨询。

3.2保留时间与色谱柱选择性的关系

由于色谱柱不同硅胶基质的物理化学性质存在差异,如比表面积、孔径、纯度等,以及键合相存在交联与非交联、密度和封尾程度的差异,会使官能团相同(C18、cs),键合相不同的色谱柱的保留值发生变化。硅胶基质表面积增加,则有机固定相的量也增加,使保留值提高;非交联型键合固定相色谱柱的重现性好于交联型键合固定相色谱柱;致密键合填料比低硅烷浓度键合相的重现性好,也更稳定;硅烷化条件的不同也会导致不同品牌键合相之间保留行为的不同。

3.3色谱分离条件与保留值的关系

在实际分析过程中,除了色谱柱不重复带来的问题外,流动相、流速、进样量、温度等因素均会带来色谱柱分离性能的差异。如缓冲液的选择和配制不正确,导致保留值重现性不好,流速的变化、基线漂移、柱反压波动大,对色谱柱的性能均有影响。进样量过大能引起柱超载,使峰的保留时间降低,一般内径约4.6mm色谱柱的进样量为ro一50林9。当使用自动进样时,应保持环境温度的恒定,避免柱温的波动,引起保留时间的不稳定。色谱柱在使用过程中,保留时间和分离度会随使用时间的延长而逐渐降低,可通过调整流动相的溶剂强度恢复分离。

3.4谱峰脱尾及处理办法

色谱分析中经常见到色谱峰脱尾现象,特别是用过的柱子,其原因主要是:柱效下降、筛板堵塞、床体塌陷、柱头污染、进样超载、流动相不匹配、柱外效应等。为防止柱头堵塞污染,使用中最好加保护柱,如果柱头被污染,可用强溶剂反冲色谱柱,会恢复一定的柱效。样品最好用流动相稀释,防止谱峰变形、样品沉淀和大溶剂峰。与高效液相色谱仪有关的柱外效应,如:流路的管线过长、检测器流通池的体积过大,也会使峰性脱尾,应尽量选择细内径的短连接管、小体积检测池。另外,流动相中加人三乙胺等改善剂可消除流动相,固定相与样品之间的不匹配,改善峰型。

3.5日常工作中怎样维护好色谱分离柱

1)及时冲洗分离柱。每次分析工作结束时,先用水冲洗缓冲盐,然后后要过度到用强溶剂冲洗柱子,如:可用色谱纯甲醇、乙腊冲洗反相Cl:柱,目的是冲去吸附在柱上的强保留组分。如果用甲醇/水为流动相也应这样冲洗柱子,在一定程度上可恢复柱效;平时不做分析时也要定期冲洗和再生柱子。

2)做好样品纯化,最大限度减少柱的污染。我们在多年的分析工作中发现,凡是样品纯化的越干净,分离柱的寿命就越长;反之,只是提取没有纯化的样品,分离柱柱效下降较快。建立一个理想的色谱分析方法应该有一套有效的样品前处理方法,特别是在分析血浆和尿液样品时,要特别注意样品的提取与纯化,尽量使处理过的样品中杂质(如大分子蛋白、有机物等)降到最低,保护柱头和柱子。

3)提取纯化好的样品最好用流动相来溶解,一方面减少色谱图中的溶剂峰干扰,另一方面也是检查样品在流动相中的溶解性,如果样品进样后在流动相中沉淀,会堵塞进样器和柱头,甚至样品分解,出现怪峰。如果出现样品与流动相不溶要设法改变溶解条件,如更换样品溶剂,或改进处理样品的方法,或过滤,去除不溶性物质。

4 几种检测器的管理与维护

作为液相色谱仪的三大关键部件(输液泵、色谱柱、检测器)之一的检测器,主要用于监测经色谱柱分离后的组分浓度的变化,将样品组成和含量变化转化为可供检测的信号,完成定性、定量分析。常用的检测器主要有紫外吸收检测器(UVD)、荧光检测器(FLD)和电化学检测器等。

4.1紫外检测器

使用紫外检测器时要注意环境因素带来的干扰由于静电的作用,检测器在使用时易于从周围环境中吸附尘埃,覆盖在光学元件上的尘埃能降低光的传播效率,加大了光的散射,对检测不利。故紫外检测器周围的环境要清洁,经常打扫,保持干净。强紫外照射还会使一些光学材料涂层降解,慢慢增加噪声,故检测器应避免阳光直射。同时,要远离热源、暖气管道等。检测器产生噪音的来源主要是由于池内气泡和灯的寿命,其中检测池内气泡的存在是产生噪声的主要来源。为减少气泡的产生,应使流动相充分脱气或提高检测池压力(在检测器出口设置限制器保持一定的反压)。长时间不用检测器时,应定期冲洗流路赶走池内产生的气泡。使用氛灯作光源时,由于随时间的延长,氖灯光强降低、噪声会不断加大,故检测器要用时再打开,用完尽快关闭,延长氖灯的使用寿命。

4.2荧光检测器的使用与维护

荧光检测器的灵敏度比紫外吸收检测器高100倍,当要对痕量组分进行选择性检测时,它是一种有力的检测工具。使用中应注意以下几点:

1)测定中不能使用可熄灭、抑制或吸收荧光的溶剂作流动相仁’〕。

2)溶剂的极性和溶液的温度对荧光强度有明显的影响。增大溶剂的极性,可导致荧光增强。通常荧光物质溶液的荧光效率和荧光强度,随着温度的升高而降低,故在液相色谱分析中,荧光检测器通常在室温下操作,以保证足够的灵敏度。

3)当样品浓度过高时,荧光物质分子易与溶剂分子或其它溶质分子相互作用,引起溶液的荧光强度降低,是荧光强度不再与浓度呈线性关系,即荧光碎灭效应。因此,在进行荧光检测时,样品要配成低于1ug/mL浓度的样品。

4.3安培电化学检测器的管理与维护

电化学检测器具有较高的灵敏度高和较强的选择。其最低检测限可达ro一9一10一’29;由于只对电活性物质有响应,不受非电活性物质的干扰,因此有较强的选择性。由于电极精密易损,使用时要十分仔细和爱惜,对仪器的管理与维护就更加重要。

1)工作电极的保护:工作电极表面在测定完样品后容易被污染,需要经常进行清洗甚至抛光,以保持电极表面的光洁度,从而来保证检测器的灵敏度。清洁工作电极的方法有化学法和物理抛光法。

2)气泡的影响:工作电极在分析时对流路中的气泡非常敏感,如有气泡存在,不仅基线会出现噪音尖峰,还会影响信号的采集。故使用安培检测器时,配制流动相的水要新鲜,充分脱气,以消除流路中气泡的干扰。

3)金属离子的影响:如果使用的是不锈钢材料的输液泵和金属连接管道,可先用ZmoFLHNO。溶液钝化系统(注意要断开分离柱),以减少金属离子的干扰,减少平衡时间,还可在流动相中加EDTA隐蔽剂。

4)对流动相的要求:用于安培电化学检测器的流动相中必须含0.01一0.lm0FL的电解质(如含盐的缓冲溶液),以确保流动相具有导电能力,因此,以水溶液为流动相的反相色

谱及离子色谱大多适合于安培检测器。

5)专用性:安培检电化学测器对仪器系统、流动相的流速、柱温、pH等因素变化较敏感,使用时最好专用一套液相色谱仪,减少外界的干扰,流动相的组成和分析方法保持稳定。

5 液相色谱仪对环境的要求和日常维护

5.,仪器的环境要求

液相色谱仪和大多数分析仪器一样,对仪器周围的环境有一定的要求,但没有太特殊的的要求,满足一般分析仪器室的基本条件,就能保证仪器的稳定运行和安全操作。

1)照明:室内照明要光线适中,避免阳光直射。为避开直射光线对仪器操作、观测的影响,仪器(显示屏)应侧向光线。实验室窗户要挂窗帘,以便随时调节光照强度。

2)通风:使用液相色谱仪分析过程中,由于流动相中含有挥发性有机溶剂(甲醇、乙睛等)会产生有害气体,对仪器中的光学元件带来腐蚀,应注意仪器室的通风,以排除室内有害气体、保持空气清新。通风主要有两种方式:一种自然通风,定时打开门窗,让内外空气对流;另一种是强制通风,如用通风柜、排风扇等,及时将有害气体排出室外。

3)环境温度和湿度:适宜的温度和湿度是保障HPLC仪正常运行、性能稳定的必要条件。HPLC 仪一般要求室温在20一30℃之间,日温度变化2一3℃,不要波动太大,否则,在开机分析时会影响色谱分离;夏季一定要控制室温不要超过30℃,温度太高会使流路系统产生气泡,影响检测器的正常工作(如荧光检测器)。室内相对湿度应控制在60%以下。

4)供电:液相色谱室应设有照明电源和动力电源,动力电可供仪器运行使用。为减少噪音的干扰,仪器应远离瞬时供电的大功率电器设备,如:大型电动设备(超低温冰箱、电烤箱等)、电梯、空调系统等。为保证HPLC输液泵的精度,必须要保证稳定的输人电压,为此,建议色谱室应设有和仪器负荷相当的稳压电源。室内墙上应安装有接地电阻符合要求的地线,用于仪器设备保护性接地的公用地线接地电阻≤4Ω[4]。

5)洁净度:悬浮于空气中的颗粒物质会对色谱仪器分析带来干扰,使本底和噪声升高,成为分析测试的污染源,直接影响高纯物质的纯度与痕量杂质的分析。HPLC仪器为台式,检测器及光路系统封闭在仪器内部,受地面和空气中尘埃干扰较小,一般不需要缓冲间隔离,但也要注意保持室内清洁,特别是当仪器放在一层时,由于空气中的灰尘较大,为截住颗粒物污染源,要经常清扫地面、桌面,使仪器不积尘、不吸附尘土。特别是在开机之前,要把仪器周围环境打扫干净,防止仪器通电后会吸附周围的灰尘,对分析带来干扰。

5.2液相色谱仪的日常维护

1)建立仪器档案。主要记录仪器的型号、制造厂家、购人日期、启用日期和放置地点,保护好开箱资料、验收文件、仪器手册及使用记录和维修记录。

2)液相色谱仪要有专业技术人员负责管理和使用。分析前要检查仪器是否处于正常状态,如输液泵是否工作正常、流路中是否有漏液现象、反压是否过高等。分析时严格按使用说明进行操作。用完仪器后要做好使用记录,特别是发现异常和故障,一定要及时登记,为以后的维修提供参考依据。

3)仪器不用时,定期冲洗系统(用平衡溶液),一是为赶走流路中的气泡,二是用新鲜流动相置换柱中的旧液,防止柱内填料因长期静止不流动形成的沉淀物堵塞色谱柱。

4)做好仪器的日常维护和保养,及时更换已老化、损坏了的仪器部件,确保仪器始终处于正常运转状态。

高效液相色谱仪维护规程

1 目的 建立本实验室高效液相色谱仪的保养维护操作,确保仪器能正常使用。 2 适用范围 适用于本实验室高效液相色谱仪的保养维护操作。 3 责任者 本实验室所有操作高效液相色谱仪人员。 4 操作规程 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品,由流动相带入柱内,各组分在柱内被分离,并依次进入检测器,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1 对仪器的一般要求和色谱条件 所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。 4.1.1 色谱柱 反相色谱系统使用非极性填充剂,常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷相等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂; 分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含炭量和键合类型等)以及色谱柱的填充,直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm (1nm=10A)以下的填料,分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm 以上的填料。除另有规定外,普通分析柱的填充剂粒径一般在3~10um之间。粒径更小(约2um)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。 使用微径柱时,输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要,色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时,应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃,为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度,但不宜超过60℃。

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的:明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作,确保数据的准确性。 2. 范围:适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责:检验人员对此负责。 4.操作规程: 系统组成 本系统由1个溶剂二元输送泵(分主/A泵和副/B泵)、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。 准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相,用合适的μm滤膜过滤,超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱(柱进出口位置应与流动相流向一致)和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常 将待测样品按要求前处理,准备HPLC 所需流动相,检查线路是否连接完好,废液瓶是否够用等。 开机: 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后,双击[Instrument 1 Online]图标,化学工作站自动与1200LC 通讯,进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏],[ 显示状态工具栏],[系统视图],[样品视图],使其命令前有[√]标志,来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。

4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标,点击[设置泵…]选项,进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速:5ml/min,点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标,点击[控制…]选项,选中[启动],点击[确定] ,则系统开始冲洗,直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止,切换通道继续冲洗,直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标,点击[控制…]选项,选中[关闭],点击[确定]关泵,关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标,点击[设置泵…选项],设流速:min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标,如下图所示(以单元泵为例),输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积,点击[确定]。 数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法:从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项,如下图所示选中除[数据分析]外的三项,点击[确定],进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息(如:测试方法)。 4.4.2.2 点击[确定],进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min,在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定],进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如:40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同],使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定],进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定:检测波长:一般选择最大吸收处的波长。样品带宽:一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长:一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区 域。参比带宽:至少要与样品信号的带宽相等,许多情况下用100nm作为缺省

高效液相色谱法简介

高效液相色谱法简介 “色谱”一词是由俄国科学家斯威特提出的。色谱法是基于补充物质在相对运动物的两相之间分布时,物理或物理化学性质的微小的差异而使混合物相互分离的一类分离或分析方法。发展与上世纪初,飞速发展于五十年代,有超过30位科学家家因为它而获得诺贝尔奖,其有自己的理论和研究方法,同时也有众多的应用领域。 色谱法常见的方法有:柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。 柱色谱:柱色谱法是最原始的色谱方法,这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中,将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端,以流动相洗脱。常见的洗脱方式有两种,一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱,一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法,一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液,另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带,以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。柱色谱法被广泛应用于混合物的分离,包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。 薄层色谱:薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法,这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层,用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点染于薄板一端,之后将点样端浸入流动相中,依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。薄层色谱法成本低廉操作简单,被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。

气相色谱:GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体(即载气,也叫流动相)带入色谱柱,柱内含有液体或固体流动相,由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同,每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的,这种平衡实际上很难建立起来。也正是由于载气的流动,使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附,结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱,而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后,立即进入检测器。检测器能够将样品组分的与否转变为电信号,而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比。当将这些信号放大并记录下来时,就是气相色谱图了。气相色谱被广泛应用于小分子量复杂组分物质的定量分析。 高效液相色谱:高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9-107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。高效液相色谱(HPLC)是目前应用最多的色谱分析方法,高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成,其整体组成类似于气相色谱,但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳;进样系统要求进样便利切换严密;由于液体流动相粘度远远高于气体,为了减低柱压高效

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤: 1).过滤流动相,根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2).对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3).打开HPLC工作站(包括计算机软件和色谱仪),连接好流动相管道,连接检测系统。 4).进入HPLC控制界面主菜单,点击manual,进入手动菜单。 5).有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵,直接在泵的出水口,用针头抽取。冲洗进样阀,需要在manual菜单下,先点击purge,再点击start,冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6).调节流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不要超过2000。点击injure,选用合适的流速,点击on,走基线,观察基线的情况。 7).设计走样方法。点击file,选取select users and methods,可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法,点击new method。选取需要的配件,包括进样阀,泵,检测器等,根据需要而不同。选完后,点击protocol。一个完整的走样方法需要包括:a.进样前的稳流,一般2-5分钟;b.基线归零;c.进样阀的loading-inject转换;d.走样时间,随不同的样品而不同。 8).进样和进样后操作。选定走样方法,点击start。进样,所有的样品均需过滤。方法走完后,点击postrun,可记录数据和做标记等。全部样品走完后,再用上面的方法走一段基线,洗掉剩余物。 9).关机时,先关计算机,再关液相色谱。 10).填写登记本,由负责人签字。 注意事项: 1).流动相均需色谱纯度,水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2).柱子是非常脆弱的,第一次做的方法,先不要让液体过柱子。 3).所有过柱子的液体均需严格的过滤。

液相色谱仪结构及原理

液相色谱仪结构及原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达 4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。 一、特点: 1.高压:液相色谱法以液体为流动相(称为载液),液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通过色谱柱,必须对载液施加高压。一般可达150~350×105Pa。 2. 高速:流动相在柱内的流速较经典色谱快得多,一般可达1~10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多,一般少于1h 。 3. 高效:近来研究出许多新型固定相,使分离效率大大提高。 4.高灵敏度:高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外,用样量小,一般几个微升。 5.适应范围宽:气相色谱法与高效液相色谱法的比较:气相色谱法虽具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75% ~80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计,在已知化合物中,能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占70~80%。 二、性质及原理:高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好,且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同,高效液相色谱法可分为下述几种主要类型: 1 .液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶(极性不同,避免固定液流失),有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱,溶质在两相间进行分配。LLPC与GPC有相似之处,即分离的顺序取决于K,K大的组分保留值大;但也有不同之处,GPC中,流动相对K影响不大,LLPC流动相对K影响较大。a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液—液分配色谱法的缺点:尽管流动相与固定相的极性要求完全不同,但固定液在流动相中仍有微量溶解;流动相通过色谱柱时的机械冲击力,会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相(见后),可克服上述缺点。现在应用很广泛(70~80%)。 2 .液—固色谱法 流动相为液体,固定相为吸附剂(如硅胶、氧化铝等)。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是:当试样进入色谱柱时,溶质分子(X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附(未进样时,所有的吸附剂活性中心吸附的是S),可表示如下:

高效液相色谱仪使用注意事项[1]全解

岛津液相色谱仪使用注意事项 1.流动相必须用HPLC级的试剂,使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气,脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相,这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时,做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时,然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上,以充分洗去离子。对于柱塞杆外部,做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 5.长时间不用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存,注意不能用纯水保存柱子,而应该用有机相(如甲醇等),因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品,血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大,按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法;①以异丙醇作溶剂冲洗:②放在异丙醇中间用超声波清洗;⑧用10%稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳,重现性差,所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时,要使用注射器吸液:通常在输液前要进行流动相的清洗。 11.要注意柱子的pH值范围,不得注射强酸强碱的样品,特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗,然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 液相色谱柱使用经验谈 色谱柱在使用前,最好进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理: a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点: a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法

高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法 1 高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言,柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 2 常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器,如果在使用过程中不按照正确操作的话,就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。 2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方,柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI( 3.3 Bar)之间(在使用梯度洗脱时,柱压平稳缓慢的变化是允许的)。压力过高、过低都属于柱压问题。 2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题,指的是压力突然升高,一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时,我们应该分段进行检查。 (1).首先断开真空泵的入口处,此时PEEK管里充满液体,使PEEK管低于溶剂瓶,看液体是否自由滴下,如果液体不滴或缓慢滴下,则是溶剂过滤头堵塞。处理方法:用30%的硝酸浸泡半个小时,在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下,溶剂过滤头正常,在检查;

(2).打开Purge阀,使流动相不经过柱子,如果压力没有明显下降,则是过滤白头堵塞。处理方法:将过滤白头取出,用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下,过滤白头正常,在检查; (3).把色谱柱出口端取下,如果压力不下降,则是柱子堵塞。处理方法:如果是缓冲盐堵塞,则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞,则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降,则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上,用流动相冲洗柱子。这时,如果柱压仍不下降,只有换柱子入口筛板,但一旦操作不甚,很容易造成柱效下降,所以尽量少用。 2.1.1 压力过低压力过低的现象一般是由于系统泄漏,处理方法:寻找各个接口处,特别是色谱柱两端的接口,把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气,但此时表现的往往是压力不稳,忽高忽低,更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法:打开Purge阀,用3~5ml/min的流速冲洗,如果不行,则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。 2.2.漂移问题主要包括基线漂移和保留时间漂移。 2.2.1基线漂移一般说来,机器刚起动时,基线容易漂移,大概要半个小时的平衡时间,如果你用了缓冲溶液或缓冲盐,还有就是在低波长下(220nm)平衡时间相对会比较长,但如果你在实验过程中发现基线漂移,则你要考虑下面的原因:

agilent高效液相色谱仪使用维护保养操作规则

优胜美特制药有限公司&浙江巨泰药业有限公司 --------药物研究所-------- 变更内容及定期审核 制定Agilent 1260型高效液相色谱仪操作维护规程,使操作维护规范化,保证检测结果准确可靠。

二、适用范围 本规程适用于Agilent 1260型高效液相色谱仪的操作维护。 三、职责 QC对本规程的实施负责,项目主管、研发总监对本规程实施进行监督。 四、程序内容 4.1仪器配置 本仪器由梯度泵,自动进样器,柱温箱,VWD检测器或DAD检测器和操作软件工作站组成。 4.2操作前的准备 色谱纯的试剂配制流动相,必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查,应符合要求;水为新鲜制备的重蒸馏水。对规定pH值的流动相,应使用精密pH计进行调节,配制好的流动相应通过0.45μm以下的滤膜滤过,用前脱气,应配制足量的流动相。 4.2.2 供试溶液的配制供试品用规定溶剂配成供试溶液。定量测定时,对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前,一般应经0.45μm以下的滤膜滤过,必要时,在配制供试溶液前,样品需经提取净化,以免对色谱系统产生污染。 4.2.3 检查上次使用记录和仪器状态,检查色谱柱是否适用于本次试验,色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致,原保存溶剂与现用流动相能否互溶,流动相的pH值与该色谱柱是否相适应,仪器是否完好,仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4.3仪器的操作 4.3.1 接通电源,打开计算机及工作站其他各部件开关,约30秒后,各部件进入待机状态,指示灯为橘黄色,启动完成。 →梯度泵→柱温箱→检测器的状态,橘黄色为未就绪状态,绿色为空闲状态,粉色为进样状态,蓝色为运行状态,红色为出错状态。 显示所有数据:即打开运行样品时所有记录运行状态的数据图谱。 平铺数据:即将所有运行状态图谱平铺。 重叠数据:即将所有运行状态图谱重叠。 4.4色谱条件的设定及数据采集操作过程 一模块图标中的控制来开或关。把泵上的Purge阀逆时针松开,调流速为3.0ml/min,启动泵,系统开始排气泡,直到管线内(由容器瓶到泵出口)无气泡为止,切换通道继续Purge,直到所用流动相通道中无气泡为止,调流速为1.0ml/min,再把Purge 阀顺时针旋紧。 “与泵和进样器一致”使柱温箱温度一致,单击确定进入下一画面。 “最大压力限度”处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子,单击确定进入下一画面。VWD检测器参数的设定

高效液相色谱仪的结构

四、高效液相色谱仪的结构 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成(图3-1-2)。分析前,选择适当的色谱柱和流动相,开泵,冲洗柱子,待柱子达到平衡而且基线平直后,用微量注射器把样品注入进样口,流动相把试样带入色谱柱进行分离,分离后的组分依次流入检测器的流通池,最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时,检测器把组分浓度转变成电信号,经过放大,用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。 图3-1-2 高效液相色谱仪的结构示意图 1.高压输液系统 高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。 (1) 溶剂贮存器。溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成,容量为1~2L,用来贮存足够数量、符合要求的流动相。 (2) 高压输液泵。高压输液泵(图3-1-3)是高效液相色谱仪中关键部件之一,其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统,使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细,所填固定相粒度很小,因此,对流动相的阻力较大,为了使流动相能较快地流过色谱柱,就需要高压泵注入流动相。对泵的要求:输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动,流量精度和重复性为0.5%左右。此外,还应耐腐蚀,密封性好。高压输液泵,按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵,其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定,而流量随外界阻力变化而变化,如果系统阻力不发生变化,恒压泵就能提供恒定的流量。

图3-1-3 恒流柱塞泵 (3) 梯度洗脱装置。梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例,从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化,达到提高分离效果,缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类: 一类是外梯度装置(又称低压梯度),流动相在常温常压下混合,用高压泵压至柱系统,仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置(又称高压梯度),将两种溶剂分别用泵增压后,按电器部件设置的程序,注入梯度混合室混合,再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度,来调整混合样品中各组分的k值,使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温,所不同的是,在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的,而不是借改变温度(温度程序)来达到。 2.进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等,它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。六通进样阀是最理想的进样器,其结构如图3-1-4。 图3-1-4 六通进样阀装置 3.分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成,如图3-1-5。其内径为2 ~ 6mm,柱长为10 ~50cm,柱形多为直形,内部充满微粒固定相,柱温一般为室温或接近室温。 图3-1-5 常见色谱柱外形

Waters 600 Controller高效液相色谱仪维护保养规程

1 使用前 1.1 保持贮液瓶清洁,对专用贮液瓶应定期清洁;用试剂瓶作贮液瓶时,要经常更换。 1.2 定期(如半个月)在稀硝酸溶液中超声、清洁过滤器,保持过滤器畅通无阻。 1.3 使用HPLC试剂和新蒸二次蒸馏水作流动相,所使用的溶剂其截止波长一定要低于检测波长,对不是HPLC级的试剂要进行过滤(HPLC试剂出厂前已用0.02μm滤膜过滤)。对流动相一定要脱气。 1.4 每天开始使用仪器,注意放空排气,确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。 1.5 保持仪器使用环境20℃-30℃,湿度30%-70%。 2 使用中 2.1 珍惜保护色谱柱,避免柱头突然产生大的波动,扰动损伤柱床。如避免泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压力的波动。 2.2 采用保护(警戒)柱,延长柱寿命。如污染物堆积于保护柱柱头,造成柱压升高,柱效下降,峰型变差时,卸下用强溶剂反冲后再用或更换新保护柱。 2.3 避免超负荷进样,对250*4.6mm的柱子,绝对进样量应不超过100μg。在灵敏度允许的前提下,应尽量将试样浓度降低,减少绝对进样量(进样体积可保持不变),这是保持HPLC 柱性能持久良好的重要举措之一。 2.4 经常用强溶剂冲洗柱子,将柱内强保留组分及时洗脱出。反相柱用异丙醇-二氯甲烷(1:1)冲洗,正相(硅胶柱)用纯甲醇或异丙醇冲洗,时间均不少于1h。 2.5 以硅胶为基质的柱子,如C-18、C-8等,要控制好流动相的pH值,一般不要低于2.5,不高于7.0。 2.6 尽量用流动相溶解样品,一是避免出现拖尾峰、怪峰,二是避免试样在系统中由于溶解度降低而析出。 2.7 对于阻塞或受伤严重的柱子,必要时,可卸下不锈钢滤板,超声洗去滤板阻塞物,对塌陷污染的柱床进行清除、填充、修补工作,此举可使柱效恢复到一定程度(80%),有继续使用的价值。 2.8 色谱仪检测器输出和积分仪(处理机)要匹配,要合理设置参数如斜率、半峰宽、阈值、AUFS值、衰减等。将适宜的进样量和合适的参数结合起来,使主峰峰高达到记录仪满量程的80%左右。 2.9 如仪器突发故障,应立即停机并报告,由专业人员排除故障后经校准方可重新使用。 3 使用后 3.1 做完实验,及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀,尤其是对过夜的柱子和进样阀,一定要

高效液相色谱法习题答案

第二十章高效液相色谱法 思考题和习题 1.简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 相同点:均为高效、高速、高选择性的色谱方法,兼具分离和分析功能,均可以在线检测不同点: 分析对象及范围流动相的选择操作条件 GC 能气化、热稳定性好、且沸 点较低的样品,占有机物的20% 流动相为有限的几种“惰 性”气体,只起运载作用,对 组分作用小 加温常压操作 HPLC 溶解后能制成溶液的样品, 高沸点、高分子量、难气化、离 子型的稳定或不稳定化合物,占 有机物的80% 流动相为液体或各种液 体的混合。它除了起运载作用 外,还可通过溶剂来控制和改 进分离。 室温、高压下进行 2.何谓化学键合相常用的化学键合相有哪几种类型分别用于哪些液相色谱法中 采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上,所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失,化学性能稳定,热稳定性好,适于作梯度淋洗。 目前常用的Si-O-Si-C型键合相,按极性分为非极性,中等极性与极性三类。①非极性键合相:常见如ODS键合相,既有分配又有吸附作用,用途非常广泛,用于分析非极性或弱极性化合物;②中等圾性键合相:常见的有醚基键合相,这种键合相可作正相或反相色谱的固定相,视流动相的极性而定:③极性键合相:常用氨基、氰基键合相,用作正相色谱的固定相,氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。 3.什么叫正相色谱什么叫反相色谱各适用于分离哪些化合物 正相色谱法:流动相极性小于固定相极性的色谱法。用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质,用于含有不同官能团物质的分离。 反相色谱法:流动相极性大于固定相极性的色谱法。用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。4.简述反相键合相色谱法的分离机制。 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相,常用十八烷基(ODS或C18)键合相;流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统,用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。 反相键合相表面具有非极性烷基官能团,及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能,剩余硅醇基的多寡,视覆盖率而定。对于反相色谱的分离机制目前,保留机制还没有一致的看法,大致有两种观点,一种认为属于分配色谱,另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂(水十有机溶剂)中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面,组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制可用疏溶剂理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相,看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的"分子毛",这种"分子毛'有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时,一方面,非极性组分分子或组分分子的非极性部分,由于疏溶剂作用,将会从水中被"挤"出来,与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用,其结果使组分分子在固定相得到保留。另一方面,被分离物的极性部分受到极性流动相的作用,使它离开固定相,减小保留值,此即解缔过程,显然,这两种作用力之差,决定了分子在色谱中的保留行为。一般说来,固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越大,或者流动相表面张力及介电常数越大,则缔合作用越强,分配比k'也越大,保留值越大。不难理解,在反相键合相色谱中,极性大的组分先流出,极性小的组分后流出。 5.离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别

Waters_2695_型高效液相色谱仪操作方法

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统,四通道在线真空脱气机(或氦气脱气机),可容纳120 个样品瓶的自动进样系统,柱温箱,内置的柱塞杆密封垫清洗系统,溶剂瓶托盘,液晶显示器,键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后,约20s 仪器开始自检,约1min 后,显示主屏幕,此时继续各部件的初始化,待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时,仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂,按【Menu/Status 】,进入“Status (1 )”屏幕,光标选“Degasser ”,按【Enter 】,显示选项屏幕,光标下移选“Continuous ”,按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动,当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时,在“Status (1 )”屏幕下,按【Direct Function 】,光标选“Dry Prime ”,按【Enter 】,显示“Dry Prime ”屏幕,按欲启动的溶剂管路的屏幕键,如【OpenA 】,光标选“Duration ”,按数字键输入5min ,按【Continue 】,待限定时间结束后,重复操作,使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status (1 )”屏幕下,光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相,输入10 0%,按【Direct Function 】,光标选“Wet Prime ”,按【Enter 】,显示“Wet Prime ”屏幕,输入7.5Ml/min 和6min ,按【OK 】,待限定时间结束后,对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status (1 )”屏幕下,光标选“Composition ”,输入流动相的组成,按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”,按【Enter 】,按【Direct Function 】,光标选“Wet Prime ”,输入0.000mL/min 和10min. ,按【OK 】。待限定时间结束后,按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status (1 )”屏幕下,光标选“Composition ”,输入流动相的组成。按【Direct Function 】,光标选“PurgeInjector ”,按【Enter 】,显示“Purge Injector ”屏幕,输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”,光标下移“Compression Check ”,按任意数字键,按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下,按【Diag 】,显示“Diagnositcs ”屏幕,按【Prime Ndl Wash 】,显示“Prime Needle Wash ”屏幕,按【Start 】,30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下,按【Diag 】,显示“Diagnosities ”屏幕,按Prime Seal Wash ,显示“Prime Seal Wash ”屏幕,按【Start 】,待排放口有水流出,按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置,打开样品仓门,显示“Door is Open ”屏幕,装入样品盘,按【Next 】,直至所有样品盘装毕,关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下,按【Develop Methods 】,显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下,按【New 】、【Separation Methods 】,输入方法名,按【Enter 】,显示分离方法屏幕,该屏幕共有6 页,通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度,在第( 1 )页按【Gradient 】,输入后按【Exit 】;如需设定色谱柱的温度,在第( 4 )页输入后按【Exit 】;在第(6 )页设定检测器的种类,光标选“Absorbance Detector ”,按【Enter 】,光标选“48 6﹨2487 ”,按Abs (1 )图标,设定检测波长,按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下,光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标,按【Edit 】,编辑\ 改各种分析参数,按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下,按【New 】、【Sample Set 】,输入样品组名,按【Enter 】,显示方法组屏幕,在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位

岛津LC-2030型自动进样高效液相色谱仪使用、维护及保养标准操作规程

岛津LC-2030型自动进样高效液相色谱仪使用、维护及保养标准操作规程 1

修订记载

目的:建立岛津LC-2030型自动进样高效液相色谱仪使用、维护及保养标准操作规程,供化验员标准操作。 范围:应用于岛津LC-2030型自动进样高效液相色谱仪。 职责:由质控实验室仪器负责人编写; 质控实验室经理、质量管理QA 审核;质量负责人批准; 质控实验室相关化验员执行。 内容: 1 编制依据:《岛津LC-2030型自动进样高效液相色谱仪使用说明书》、《药品生产质量管理规范》( )。 2 仪器组成:本仪器主要由溶剂瓶柜、自动进样器、紫外检测器、荧光检测器、柱温箱、脱气机组成。如图1所示: 图1 溶剂瓶自动进脱气 柱温箱 荧光检 紫外检

3 操作方法: 3.1 开机: 3.1.1 准备好流动相并安装好色谱柱:将配制好的流动相用孔径为0.45μm的滤膜过滤,超声脱气处理15分钟后方可使用;色谱柱按箭头指示方向连接到液相色谱仪上。 3.1.2 打开液相色谱仪电源,液相色谱仪仪器开始自检。 3.1.3 电脑开机进入WINDOWS桌面后,双击LC-2030色谱工作站图标,进入工作站登陆界面。如图2所示: 图2 3.1.4 单击【确定】进入主项目界面。如图3所示:

图3 3.1.5 单击【仪器】图标,双击,进入仪器操作界面在线系统, 出现在线控制主界面。如图4所示: 图4 3.1.6 打开排放阀(逆时针旋转﹤180°),单击【自动排气】,进入排气操作界面,根据需要选择流路及排气时间,完成设

置后单击【下载】。如图5所示: 图5 3.2 数据采集方法编辑: 3.2.1 常规参数设置: 3.2.1.1 单击[常规],进入常规操作界面,运行时间、泵流速、检测器波长和柱温箱温度(5℃~85℃)等,完成设置后单击[下载],将该方法下载至液相色谱仪。如图6所示: 图6 3.2.1.2 单击【时间程序】,进入该操作界面,若进行等度洗脱,则不需要修改。如图7所示: 图7 3.2.2 高级参数设置: 3.2.2.1 单击[高级],进入该操作界面,设置相关检测参数,完成设置后单击【下载】,将该方法下载至液相色谱仪,如图8所示:

气相色谱仪由哪几部分组成

气相色谱仪由哪几部分 组成 Company Document number:WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998

1、气相色谱仪由哪几部分组成 答:基本包括六个基本单元:气源系统、进样系统、柱系统、检测系统、数据采集及处理系统、温控系统。 2、在环已烯成分检测的实验中,我们所使用的气相色谱仪的固定相和流动相分别是什么? 答:固定相为:PEG毛细管柱。流动相为:氮气 3、在环已烯成分检测的实验中,我们所使用的液相色谱仪的检测器是什么检测器 答:为氢火焰离子化检测器。 4、气相色谱仪的适用范围是什么 答:气相色谱仪可以应用于分析气体试样,也可分析易挥发或可转化为易挥发的液体和固体。如:环境检测,食品检测,有机化合物的质量检测等范围。 5、高效液相色谱仪由哪几部分组成 答:主要包括:高压泵、进样阀、色谱柱、检测器、数据采集和处理系统等部分。 6、在反相高效液相色谱法分离芳香烃化合物的实验中,我们所使用的液相色谱仪的固定相和流动相分别是什么 答:固定相为:十八烷烃;流动相为:80%甲醇和20%水的混合溶液。 7、在反相高效液相色谱法分离芳香烃化合物的实验中,我们所使用的液相色谱仪的检测器是什么检测器 答:紫外吸收检测器。 8、什么叫反向高效液相色谱仪,什么叫正向液相色谱仪

答:固定相的极性小于流动相的极性叫做反向高效液相色谱仪;固定相的极性大于流动相的极性叫做正向高效液相色谱仪。 9、液相色谱仪的适用范围是什么 答:只要被分析物在流动相溶剂中有一定的溶解度,便可以分析。特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物。如:环境检测,食品检测,有机化合物的含量检测等范围。 10、色谱仪进行定性分析和定量分析的依据分别为什么 答:定性分析的依据为:各检测物的保留时间;定量分析的依据为:峰面积与浓度成正比。 实验操作部分: 1、该实验中气相色谱仪的操作步骤是什么 打开氮气阀门——打开主机电源——设置温度(气化室150℃、色谱柱室75℃、检测器180℃)——打开空压机开关——打开氢气阀门——点火——待基线稳定后——进样——分析结束后读取数据。 2、在反相高效液相色谱法分离芳香烃化合物的实验中的操作步骤是什么 答:流动相的配制(超声脱气过滤);开机预热30分钟;进样(以微量注射器吸取适量试样并排气泡——将微量注射器插入六通阀——旋转六通阀——注入试样——旋转六通阀——拔出微量注射器);在计算机上读取数据——关机(先关泵后关电源)。

高效液相色谱法(HPLC)的概述

此帖与GC版的对应,是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括: 1.高效液相色谱法(HPLC)的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍(1——13楼) 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法(HPLC)的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法(HPLC)。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱,经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器,由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广(样品不需气化,只需制成溶液即可)、色谱柱可反复使用的特点,在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法,已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法;按色谱原理不同可分为分配色谱法(液-液色谱)和吸附色谱法(液-固色谱)等。 目前,化学键合相色谱应用最为广泛,它是在液-液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上,形成的固定相称为化学键合相,不易流失是其特点,一般认为有分配与吸附两种功能,常以分配作用为主。C18(ODS)为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同,液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法,当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法,主要用于极性物质的分离分析;当流动相

的极性大于固定相的极性时称反相色谱法,主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中,大多采用反相键合相色谱法。 系统组成: (一)高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体,以保持输液静压差,使用过程应密闭,以防止因蒸发引起流动相组成改变,还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈-水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气,否则很易在系统的低压部分逸出气泡,气泡的出现不仅影响柱分离效率,还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一,用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是:耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定,且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类,常使用恒流泵(其压力随系统阻力改变而流量不变)。 (二)进样系统 常用六通阀进样器进样,进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置(L OAD),此时进样口只与定量环接通,处于常压状态,用微量注射器(体积应大于定量环体积)注入样品溶液,样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置(INJECT),使定量环接入输液管路,样品由高压流动相带入色谱柱中。 (三)色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶(又称ODS柱或C18柱)、辛烷基硅烷键合硅

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