破壁绿藻粉的加工及细胞生长因子的提取研究

食品科技

Ｆ００ＤＳＣ｝ＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

碹壁绿藩彩饷咖互及细胞硅长固孑钓腥取研究

朱江１赖达雄２欧阳邦进３

１江西省食品工业研究所（３３００２９）

２江西品生源生物工程有限责任公司（３４２１００）

３安远县科学技术局

摘要：绿藻是高蛋白含量的营养

较全面的可食藻类，含有细胞生长因

子。以绿藻菌体为原料，经纤维素酶、

果胶酶的酶解作用，可一定程度提高

细胞蛋白抽提率；进一步用冻融法，可

使绿藻细胞壁的破坏率达９７％。以破

壁绿藻粉为原料，通过膜技术分离，真

空冷冻干燥，可得到高纯度的绿藻细胞生长因子（ＣＧＦ）。

关键词：绿藻；细胞生长因子；酶解；冻融；膜分离；真空冻干

绿藻为绿藻门小球藻属单细胞绿藻，生态分布广，生物量大。我国常见的种类有蛋白核小球藻（ｃｈｌｏｒｅｌｌａｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）椭圆小球藻（ｃｈｌｏｒｅｌｌａｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）和普通小球藻（ｃｈｌｏｒｅｌｌａｍｌｇ撕ｓ）等。研究表明，绿藻含丰富的蛋白质、脂质、多糖、食用纤维、维生素、微量元素和活性代谢产物，具有防治消化性溃疡、抗肿瘤、增强免疫力等功效。绿藻粉破壁后可直接食用。近年来对绿藻提取物的研究日渐深入。特别是对其中所含细胞生长因子（ｃｈＩｏｒｅｉＩａｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）简称ＣＧＦ的研究，有了很大进步。实验证明，ＣＧＦ中含大量核苷酸类物质，具有使生物细胞活化的功能，可提高机体的免疫力。细胞生长因子（ＣＧＦ）是绿藻特有的细胞活性物质，它是一种混合物，主要包括核苷酸、多肽、多糖、植物激素以及特殊酶类。它有着广泛的应用范围，可作为保健品原料，功能食品添加剂、良好的医药前体和用于生产美容化妆品，具有广泛的国际市场。

绿藻细胞壁进行酶解处理的效果，并且进一步结合冻融法研究破壁处理的作用，生产出破壁绿藻粉。同时，研究以破壁绿藻粉为原料，经过膜分离处理和真空冷冻干燥，试制出高纯度细胞生长因子（ＣＧＦ）。

１主要材料与设备

本文研究纤维素酶和果胶酶对

１．１主要材料

１．１．１绿藻菌体：江西品生源生物工程有限责任公司提供

１．１．２纤维素酶：粉状，１．５万Ｕ／ｇ，无锡酶制剂厂

１．１．３果胶酶：粉状，３万Ｕ／ｇ，无锡酶制剂厂

１．２主要设备

恒温水浴器，压力喷雾干燥塔、酶反应器、无机陶瓷微滤装置，有机超滤浓缩装置，大孔树脂吸附装置，真空冻干机。

２工艺流程示意图

２．１破壁绿藻粉生产工艺流程

绿藻菌体一复水＿＋调酸＿酶解反应＿冻融＿过滤叶喷雾干燥＿破壁绿藻粉＿成品

２．２细胞生长因子提取工艺流程

破壁绿藻粉＿＋浸提。微滤＿超滤＿纳滤一纳滤浓缩＿大孔树脂纯化＿＋冻干＿ＣＧ卜—，成品

３操作步骤

３．１破壁绿藻粉的制作步骤

３．１．１复水：将绿藻粉用纯水配成５％浓液在６０℃热水中维持ｌ小时进水复水。取样ｌＩＩｌｌ稀样５００倍，在１０００倍显微镜下观察细胞复水情况。

３．１．２调酸酶解：在绿藻复水的浓液中，用柠檬酸调ＰＨ至４．５。按每克绿藻的量，添加纤维素酶／果胶酶０．４万Ｕ／０．５万Ｕ。于４５℃恒温搅拌作用３小时。酶解完成后，按１００℃钝酶处理。

３．１．３冻融：将酶解液置４℃冰机预冻２小时，再置一２２℃冰机中冷冻１２小时。取出加水融化，融化至一半时剧烈振摇３０分钟，再放回一２２℃冰机冷冻１２小时，重复３次过滤。

３．１．４喷雾干燥：在干燥塔顶部导入热风，同时将绿

■食品科技

Ｆ＝００ＤＳＣｌＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

气相色谱法一质谱法分析蜂胶中醇溶性物质的化学成分

余兰平盛文胜喻建辉

（江西汪氏蜂业集团技术中心江西新建３００１００）

Ｙｕ—ＬａｎｐｉｎｇＳｈｅｎｇ—ＷｅｎｓｈｅｎｇＹＵ—Ｊｉａｎｈｕｉ

ＫｅｙｗＯｒｄ：ＰｍｐｏｌｉｓＧＣ—ＭＳＡｎａｌｙｓｉｓ

摘要：用ＧＣ—ＭＳ分析方法对蜂胶中醇溶性物质进行

了分离鉴定，经提取、除蜡、浓缩，采用ＨＰ一５石英细管柱

进行分离，共鉴定出８６个化合物，其中有９个黄酮类化

合物，含量达到３９．７３％，还有大量的有机酸、萜烯类化合

物，对于评价蜂胶类产品的保健功能和质量标准制定起

到一定的指导作用。

关键词：蜂胶ＧＣ—ＭＳ分析

蜂胶是蜜蜂从植物芽孢及树干上采集的树胶，并混

入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡等加工而成的一种具有芳香

气味的胶状固体物，其中含５０—５５％树脂，３０一４０％蜂蜡，

５—１０％花粉，还有油脂、氨基酸等（１）（２）。蜂胶中含有大ＧＣ／ＭＳＡｎａｌｙｓｉ８ＴｈｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏⅡｌｐｏｓｉｔｉｏｎＯｆＳ０１一量萜烯类、黄酮类、脂肪酸类物质，具有抗菌、降血脂、降ｕｂｌｅＰｒｏｐｏｌｉｓＷｉｔｈＥｔｈａｎｏｌ血糖、降血压、抗氧化、增强免疫力等功能，素有“紫黄金”

１００Ｄａ的纳滤膜，反渗透膜和真空蒸发浓缩对比实验。结果（如表３），从表３可以看出，膜浓缩比真空蒸发浓缩具有低温短时等优点，并且纳滤浓缩在时间、操作压力和生产效率方面伏于反渗透浓缩。因此，分离与富集细胞生长因子（ＣＧＦ）的浓缩工艺选用截留分子量为１００Ｄａ的纳滤膜在３０℃左右，操作压力３．０ＭＰａ的技术参数是理想的浓缩工艺技术。

表３不同浓缩工艺的效果比较

浓缩，料液温度

时间（ｈ）

操作压ＣＧＦ损失方法重（ｋｇ）（℃）力（ＭＰａ）率（％）纳滤１００３００．８３．Ｏ３．１８

反渗透１００３０１．２４．２２．９３

真空

１００５８２．６０．２５．８４蒸发

参考文献

【１】天津轻工业学院，无锡轻工业学院编。食品工艺学［Ｍ］，北京：中国轻工业出版社，１９８２

［２】姚红娟、王晓琳、丁宁。膜分离在蛋白质分离纯化中的应用，食品科学［Ｊ】，２００３（１）

［３］何扩、张秀垦、李玉峰。小球藻破壁技术及其藻片研制，食品工业科技［Ｊ】，２００６（２）

［４】宁正祥等食品成分分析手册［Ｍ】北京：中国轻工业出版社，１９９８

［５】钟瑞敏酶解小球藻保健饮品工业研究，食品科学［Ｊ］２００２（９）

［６】胡开辉周山勇。小球藻细胞活性物质的提取及对啤酒酵母的生理效应，应用生态学报［Ｊ】，２００５（８）［７］高福成等，冻干食品【Ｍ】，北京：中国轻工业出版

藻类的分离和培养

藻类的分离和培养 微型藻类的分离和培养方法基本上与菌类的方法相似，但还需加上光照条件，并以液体培养为主。在大量培养时，可不必考虑无菌条件。 一、目的 学习藻类的分离和培养方法 二、药品、材料和用具 水生生物培养槽，玻璃片（面积稍大于培养槽），橡皮管，显微镜，三角烧瓶，试管，筛绢，棉塞，微吸管，凹玻片，灭菌锅，载玻片，吸管，培养皿，人工光源，木盆（或小型实验池），充二氧化碳气钢瓶，抽气泵，离心机。 土壤抽出液，青霉素，链霉素，琼脂，硝酸钙，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，过磷酸钙，硫酸镁，氯化钾，碳酸钠，三氯化铁，硅酸钠，葡萄糖，蛋白胨，硫酸铵，硝酸铵，氯化钙，碳酸氢钠，钼酸，氯化钠，柠檬酸铁，硫酸锰，人尿，海泥抽出液，食盐。 三、操作 生长在静水或水流缓慢河流中的藻类，培养比较容易。取到实验室后，要立刻从材料瓶中移到宽大的水生生物培养槽内。为了培养大的丝状藻，要利用宽的、不高的容器。这些容器要用玻片盖住，以防止培养物受灰尘沾污。倒入容器的水要达到容器高度的一半，或稍多些，使水面上还有充分空气。在容器边缘，要用一小块纵切橡皮管垫住，可使玻片不致紧贴容器，空气才能进入容器中。细微的藻类如团藻目、硅藻门能很好地生活于培养皿中。很多藻类如颤藻属、水绵属的若干种、轮藻属等可在实验室中保存很多年。 在迅速流动水中生长的藻如丝藻属、毛枝藻属等比较难于培养，因为它们要求经常输入氧气。在水层较高水中，在高容器中，这些藻类迅速地死亡。为了把这些藻类保存到实验时，应当把它们分成一些小部分，放在水层较薄的、宽的容器内，并须常常换水，把空气吹入水中。还可以用橡皮管把水生生物培养槽和水龙头连结起来，建立有流水的水生生物培养槽。 在水生生物培养槽中培养藻类时，应尽可能创造和保持藻类天然生存条件。把藻类培养在从采集藻类那一水域取来的水中，或其他天然水（尤其不能用自来水，因其中含很多氯气，必要的话，也须置较长时间，或加以煮开），或在水中加入混合养料，这些养料是由制造有机物质所必需的矿质盐构成。

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。 【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定 0.引言 巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。 1.材料与方法 1.1实验对象 清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。 1.2实验方法 1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养 随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。 1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定 （1）台盼蓝染色计算存活率。 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）；

实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察

实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察 姓名：李思露 学号：131140040 一、实验目的 1.通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察,加深理解细胞吞噬作用的过程； 2.了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法 二、实验原理 吞噬作用也称为胞吞作用（cellular eating），指细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的较大固体物质（直径一般大于250mm）的过程。许多原生动物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。不同动物来源的巨噬细胞或同一动物来源的不同巨噬细胞吞噬功能强弱不同，个体吞噬细胞的平均吞噬能力是机体非特异性免疫功能强弱的重要反映。 吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。 内吞 内吞体 吞噬溶酶体 胞吐 巨噬细胞吞噬自身衰老凋亡细胞而不吞噬正常细胞，原因是，凋亡细胞细胞膜内侧面的磷脂酰丝氨酸反转到胞膜外侧面而被巨噬细胞模式识别受体识别。 吞噬功能一般用吞噬百分率和吞噬指数两个指标反映。 吞噬百分率＝吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100％

吞噬指数＝吞噬的鸡红细胞总数/吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数 三、实验材料、试剂及器材 （一）材料： 1.健康小白鼠：6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，每只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL。 2.抗凝鸡血 （二）试剂: 1.4%淀粉肉汤 2.D-Hanks液 3.0.85％生理盐水 4.180IU/mL肝素钠生理盐水溶液 （三）用品 普通光学显微镜、10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37℃）、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等 四、实验操作 1.巨噬细胞收集：脱颈处死小鼠；腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤， 暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。 2.体外吞噬。0.3mL腹腔液+0.3mL鸡红细胞悬液，37℃吞噬。 3.制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min 制备细胞混合液临时装片，观 察现象并作图。 五、实验结果 图1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞装片（不染色） 0min15min30min45min 时 间 现 象 巨噬细胞吞噬物的变化亦具有与时间相关的特点，巨噬细胞吞噬物在形态上易于观察和检测，这些特征使得巨噬细胞在损伤时间推断过程中具有重要的法医学意义。 六、作业与思考题

(完整版)实验3藻类培养2014.111.10

实验3淡水藻类植物的采集和培养 一、实验目的 1 藻类植物的分布很广，种类也很多，学生通过对淡水生藻类植物进行调查、采集和培养，可以增加学生藻类植物工作的经验，培养学生参加科研工作的积极性，提高学生科研工作的能力。 2 学生在课前必须大量阅读与藻类植物相关的知识，特别是淡水藻类的一些知识。 二、实验原理 藻类植物是自然界中非常重要的一大类生物类群，它们不仅是用于科学研究的良好材料，在医药、食品、精细化工、环境保护、水产养殖等方面都有着广泛的应用。研究观察藻类不但有一定的理论意义，也具有重要的应用价值。淡水藻类以其生长环境不同可分成两类：一类是水生藻类；一类是气生藻类。 三、实验材料、试剂与仪器设备 显微镜、显微图像采集系统、采集瓶、培养瓶、吸管、镊子、刀、标签、记录本、浮游生物网等，相关工具书；4％的甲醛溶液、碘液 四、实验步骤 1 淡水藻类标本的采集方法 (1) 水生藻类标本的采集 水生藻类依其形体大小可分为丝状种类和微小浮游种类。丝状种类可用镊子采集。对固着于石块等物体上的藻可用刮刀将藻从基部刮下或连同附着物一起采集。将采集到的标本放入标本瓶中并加入一些水，但水不要加得太满，应留有一定的空间，标本瓶盖应注意密封，防止样品流失。标本瓶上要贴上标签，标签上须用铅笔注明该标本采集的地点、日期和采集者。 浮游种类要用专用的浮游生物网采集，如无专用工具，也可用市售的300目尼龙筛绢对水体进行过滤，滤出的藻体可用少量水冲洗入标本瓶中。 标本采集时还应用记录本记下各标本的采集环境、气温、水温、pH值、藻的附着基质、水体透明状况、藻体的手感是否滑腻等，这些都是鉴定藻类的参考条件。因此应注意详细记录。 新鲜的藻标本不宜久存，应尽快对标本进行观察鉴定，好的标本可用4％的甲醛溶液（福尔马林溶液）固定保存。 (2) 气生藻标本的采集 气生藻类多生长在阴湿的地面、墙壁以及树干的背荫面。这类藻可用小铲刀采集，用牛皮纸包好，风干后保存。对气生藻进行观察时，可用镊子镊取少许藻体，放在载玻片上，滴一小滴水浸润后在显微镜下观察形态。 2 几种常见藻类的采集、观察和保存 (1) 水绵在春秋季较清洁的水体中较常见，用手指捻摸有滑腻感，在显微镜下观察藻丝无分枝，叶绿体呈典型的螺旋带状，如在样品上加一点碘液（或碘酒）可见排列于叶绿体上的淀粉颗粒染成深褐色。鞘藻和刚毛藻也是很常见的丝状绿藻，与水绵不同的是这两种藻多生长于污染水体中。鞘藻不分枝但手摸无滑

小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取

小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取 实验动物： 6-8周的SPF级雄性BALB/C小鼠，小鼠取细胞前三天每天腹腔注射0.5-1mL淀粉肉汤，或者取细胞前一小时注射1mL淀粉肉汤。 试剂：75% 乙醇、RPMI 1640 （Gibcol/BRL，美国）、含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)步骤： 1、取6周左右的小鼠，剃去腹部的毛并消毒。 2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入75%酒精中3～5秒。 3、倒立小鼠，置动物于解剖台上，固定四肢，75%酒精擦洗腹膜壁后，用9号针头5ml注射器沿腹中线将预冷的不含小牛血清的PBS5mL注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。轻轻按摩腹部2-3分钟，静置5-7分钟。 4、无菌条件下，剪开腹壁，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。再用75%酒精擦洗腹壁。 5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸入注射器内。小心拔出针头。把液体注入50ml离心管中。再用同样容量的PBS冲洗腹腔2～4次。合并渗出液于50 mL离心管中。直至冲洗液变澄清。 6、4℃ 250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 7、用PBS培养液洗涤细胞3次，每次4℃ 250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 8、用含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)悬浮细胞。将调整细胞浓度调整至 5×106cells/mL 加入培养皿中培养9、将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养3 h，然用37℃预温的RPMI-1640培养液清洗培养皿2-3次，去除未贴壁的细胞，即得到纯化的贴壁巨噬细胞。 种96孔板。2h细胞贴壁。换液。墨汁（时间短，可以不灭菌）染色。观察。

藻类的培养

一、藻种的两种培养类型 一般藻种的培养有两种方式：一种是长期保存所需要的培养方法，一种是以实验为目的，短期内保藏藻种的培养方法。 长期培养最主要的问题是选择一种合适的培养基，可以在3个月到一年的时间内连续培养藻种。最适合长期培养藻种的培养基是agar（固体琼脂培养基），但是使用agar有一个弊端，即培养物保持无菌的问题；我们可以加一层蒸馏水（咸水的藻类可以加灭菌过人工的海水）在agar上，这种做法可以保证在长期保种的过程中减少agar水分和营养的流失。长期保种使用的培养基，不要选择营养过于丰富的，因为多数的藻，尤其是丝状藻，在营养丰富的环境生长，会发生形态结构上的变化，如果要做生理生态方面研究，实验材料的形态结构是不能异常的。 适合长期保种的贫营养的培养基有这些：Bold’s基础培养基，以及该培养基加上蛋白胨或者琼脂制成的agar，适合长期培养绿藻；Allen及其改良后的配方可以长期培养一般常见的蓝藻和绿藻；土水培养基和它的一个改良的系列也实用培养多数藻种。对于我库提供的藻种，由于藻种长期习惯的原因，建议使用我们提供的原配方来培养，在长期培养的时候，可以适当稀释原培养基，在藻种培养过程中，生长速率会变慢，可以保持其形态结构不变。 另外，长期培养的时候，除了选择适当的培养基，还可以降低温度5～8C（降温的过程最好能循序渐进，突然改变环境温度，可能会导致藻种不适应而死亡）。光照强度可以减小为原先的一半。在实验之前3到4周，将长期培养的藻种接种到我们提供的培养基中（培养基必须灭菌），按照我们给予的培养条件培养，在实验前6天左右，再次接种。 短期培养则可以直接按照我们提供的培养基和培养条件培养。由于试验的需要，常常要求在短期时间内获得大量的培养物，我们可以采用通气培养和摇床培养。通气培养可以通CO2或洁净的空气，视培养物的多少来决定通气泵的大小，在通气的硅胶管中设置一个缓冲瓶，塞上灭菌后的脱脂棉，帮助净化空气，如果对通气有更高的要求，可以在通气管中加上一层滤膜。使用摇床培养，需要注意藻种的生理周期。 二、培养基的选择和配制 1、培养基的选择 ①BG11是我库培养蓝藻使用最广泛的培养基。除了极少部分蓝藻，大部分都使用BG11。按照我们给的配方配制好后 高压灭菌，BG11经常会产生絮状沉淀。这是因为其中有Ca+和CO32???-,我们可以在灭菌后再超净台上用灭菌过的注射器来加两者之中的另外一种。通常我们建议将氯化钙的母液单独灭菌后在无菌室保存，在配置好BG11的工作液并灭菌之后，在超净台上用注射器将氯华钙加入。 ②SE是我库用来培养常见的绿藻所使用的培养基。一般来说，如果配制了母液，用母液来配培养基，灭菌后是不会产生 沉淀的。配置的时候注意先将所需要的蒸馏水准备好，将需要的药品逐个加入，等到一种药品充分溶解之后再加入第二种。 另外，土水在蒸馏过滤后，是不需要灭菌的，因为高压灭菌的过程会让其中的一些营养成分损失。 ③水是培养基成分中很重要的一个方面。配培养基，可以取蒸馏水、自来水、去离子水，也可以取藻种采集地的水。使

藻类培养与利用研究进展

Journal of Water Resources Research水资源研究, 2013, 2, 76-83 doi:10.12677/jwrr.2013.21012 Published Online February 2013 (https://www.wendangku.net/doc/8415059514.html,/journal/jwrr.html) Research Progress of Algae Cultivation and Utilization* Buhui Chang, Lan Li, Lei Yao School of Water Resources and Hydropower Engineering, Wuhan University, Wuhan Email: changbuhui@https://www.wendangku.net/doc/8415059514.html, Received: Dec. 7th, 2012; revised: Dec. 24th, 2012; accepted: Dec. 29th, 2012 Abstract: More than half a century, with the development of various of biological cultivation system, people have done a lot of improvements and structural innovation around the process of using the bioreactor to optimize the environments of biological reaction processes. There are also have a lot of breakthroughs in the development of special reactors on the basis of the existing reactor structure. This article mainly focuses on the structure and the advantages and disadvantages of the closed and open cultivation system at home and abroad, meanwhile, achieve the cultivation of bio-energy biomass. Summarized the utilization of algae, provided the necessary reference for the future realization of the ecological chain cycle, waste water, waste gas-algae absorption and utilization-algae reuse. Keywords: Closed Algae Cultivating System; Open Algae Cultivating System; Algae Utilization 藻类培养与利用研究进展* 常布辉，李兰，姚磊 武汉大学水利水电学院，武汉 Email: changbuhui@https://www.wendangku.net/doc/8415059514.html, 收稿日期：2012年12月7日；修回日期：2012年12月24日；录用日期：2012年12月29日 摘要：半个多世纪以来，随着各类生物培养系统的发展，人们紧紧围绕着生物反应器为生物过程提供最优化反应环境而对其进行了大量的改进和结构上的创新，在现有反应器结构基础上开发特殊的反应器也取得了一定的突破。本文重点介绍了国内外密闭式与开放式培育系统的结构与优缺点，同时实现生物能源生物质的培育。对藻类利用进行了总结，为将来实现以废水、废气–藻类吸收利用–藻类再利用为循环的生态链条的实现提供必要的参考。 关键词：密闭式藻类培育系统；开放式藻类培育系统；藻类利用 1. 前言 随着社会经济与科技的发展、人口的增加、资源的枯竭、环境与气候的恶化，人类社会面临着前所未有的难题——资源、能源、人口、环境、土地等的压力日益加剧。为了满足日益增长的各方面的需求，人们加大了在能源、食物等方面的研究。藻类以其独特的生态特征和生活习性成为了研究的热点，人们针对其不同的用途进行了大量的研究，并取得了丰富的成果。 藻类分布的范围非常广，生长繁殖快，对环境的要求不严，适应性极强。从热带到两极，从积雪的高山到温热的泉水，从潮湿的地面到不很深的土壤内，几乎到处都有藻类分布。另外藻类中含有大量的蛋白质、油脂、糖类、色素以及各种维生素等，具有很大的应用前景。 *基金项目：水利部“948”项目：日本碳素纤维生态草河湖直接净化技术的引进及研发(编号：201112)。 作者简介：常布辉(1986-)，男，硕士研究生，研究方向：水资源水环境。

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察 一、实验目的 a)通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬大肠杆菌活动的观察,加深理解细胞吞噬 作用的过程； b)了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法。 二、实验原理 吞噬作用是细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的固体物质（直径一般大于250nm）的过程。 吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。 许多原生动物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。 三、实验仪器及试剂 a)材料：健康小白鼠：6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，一部分腹腔 注射4％淀粉肉汤1mL另一部分不注射，大肠杆菌悬液。 b)试剂:4%淀粉肉汤，D-Hanks液，0.85％生理盐水，180IU/mL肝素钠生理 盐水溶液 c)普通光学显微镜、 10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37℃），5mL 一次性注射器、 10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等 四、实验步骤 a)巨噬细胞收集：分别用脱颈法处死一只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL的小 鼠和一只不注射的小鼠。然后都在腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开 腹部皮肤，暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。 b)体外吞噬。在两支10mL玻璃离心管分别加入0.3mL注射淀粉肉汤的腹腔 液+0.3mL大肠杆菌悬液和0.3mL不注射淀粉肉汤的腹腔液+0.3mL大肠杆 菌悬液，放在37℃水浴锅中吞噬。 c)制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min 制备细胞混合液临 时装片，观察现象并作图。 d)在0min和45min时在两管中分别取两滴混合液滴于载玻片上，用次甲基 蓝染色5分钟后装片观察。 五、实验结果 a)0min时注射肉汤（左）与未注射肉汤（右）图片（次甲基蓝染色）

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养2013

细胞工程综合实验报告 小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 班级 xxxx 姓名 xxxx 学号 xxxxxxxxxx 指导教师 xxxx 实验时间 xxxx 成绩

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 姓名学号班级 一、实验目的 1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。 2.初步掌握培养过程中的无菌技术。 3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培

藻类的实验室培养

微藻的实验室培养 学生：林晓生学号：2120180414导师：杨缜教授 一、藻类的概述 藻类是原生生物界一类真核生物(有些也为原核生物，如蓝藻门的藻类）。主要水生，无维管束，能进行光合作用。藻类植物共约为2100属,27000种。根据所含色素、细胞构造、生殖方法和生殖器官构造的不同，分为绿藻门、裸藻门、轮藻门、金藻门、黄藻门、硅藻门、甲藻门、蓝藻门、褐藻门和红藻门。色素的颜色划分，藻可分为3类：绿藻、褐藻和红藻。 由于单胞藻具有利用太阳光能效率高、营养丰富、生长繁殖迅速、对环境的适应性强和容易培养等重要特性，因而受到重视。微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养植物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。 二、微藻的营养模式和生长模式 （二）、微藻的生长模式 藻类在培养过程中，生长繁殖的速度，出现一定的起伏，这种生长模式可划分为五个时期（延缓期、指数生长期、相对生长下降期、静止期、死亡期）。

三、培养按培养的场所分室内培养和室外培养 1）按培养基的形态分固体培养和液体培养 2）按培养的纯度分纯种培养和单种培养3）按藻液的流动情况分静止培养和循环流动水培养 4）按气体交换情况分充气培养和不充气培养 5）按藻液与外界接触程度分封闭式培养和开放式培养6）按培养规模和目的分小型培养、中继培养和大量培养方式 简单介绍其中的四种方式： （1）纯培养和单种培养 纯培养（axenic culture）：是无菌培养，指排除了包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。纯培养操作要求十分严格，要求有无菌室、超净台等设备，容器、工具、培养液等均须彻底灭菌。培养成功率很高，是进行科学研究不可缺少的技术。 单种培养（single-species culture）：指区别于纯培养的不排除细菌存在的培养（可以是生产性的，也可以是非生产性的） （2）封闭式培养和开放式培养 封闭式培养（closed culture）：指把培养液密封在透明的容器中，与外界空气隔离，暴露在阳光中，CO2完全采用人工供给的方法。各种反应器等 开放式培养：指把藻类培养在开敞容器中，如广口玻璃瓶、水族箱、玻璃钢水槽、水泥池等。 （3）小型培养、中继培养和大量培养封闭式塑料薄膜袋培养，方法简单，成本低、培养的藻细胞密度大，不易污染且生产周期短，效果很好。

绿藻栅藻培养

绿藻栅藻培养 藻类，特别是单细胞藻类的营养丰富，含有动物和人生长发育所必需的营养物质。自上世纪四十年代以来,各国学者都试图用藻类这一资源解决人类食物和动物饵料的缺乏问题。另一方面，藻类可直接或间接的作为鱼类及其他水生动物的饵料。 1 藻类的培养方式 藻类的培养方式，以藻类培养的目的要求而各种各样。但可分为密闭式培养和开放式培养两大类。 1.1密闭式培养 密闭式培养的目的是不使外界杂藻、菌类及其他有机体混入培养物中。将培养液密封在与外界完全隔离的透明容器中，由此通气，搅拌，输送培养液及调节水温和取样等设备，也都要与外界隔离。培养容器多为管状，也有池状，用有机玻璃或透明的聚乙烯所料做成水平管道，直立或斜立在地上，暴露阳光或人工光照下。这种培养方式，成本高，好控制，产量亦稳定。 1.2开放式培养 将藻类培养于敞开的容器(如水泥池、管道、木盆等)中。方法设备较简便，可进行小量或大面积的培养。该法培养物中易发生敌害生物污染，但成本低，使用较普遍，也是今后藻类培养所应采取的方式。开放式可分如下几种类型： (1) 开放循环培养：其特点式培养液借助循环水泵而不断循环流动。培养物能循环，就可省却搅拌工作。 (2) 开放非循环培养：其特点是培养液不循环流动，而定时由小管通入CO2和空气到培养液中；同时也起搅拌作用。此法在大面积培养中使用较普遍。优点是设备简单，无需动力，水泵及大量的CO2及通气设备。 (3) 半开放循环培养：半开放培养是指培养容器或池，槽等场所虽仍敞开，但有些部分密闭，或用塑料布覆盖。这种培养方式，利用管道，依靠动力，使培

养液流动和通入含二氧化碳的空气。该方式设备复杂，但效果较好。 2 藻种的分离 为了要进行某种藻类的科学研究活大量培养，有必要把某种藻类与其他生物分离。分离培养藻种，可分为两大类，一为单种培养，即藻类虽只有一种，但还混杂细菌。另一为纯培养，即不仅藻类只有一种，亦无其它任何生物。纯培养比较困难，一般的分离培养往往只能做到单种培养。 主要根据培养的目的要求，及某一种类的生物学特征。藻类的分离主要有以下几种常用方法。 2.1 离心法 将混合液用离心机离心，水中不同藻体及细菌就以不同的速度下沉，因此得以分开。这样将不同时间下从导管底的藻体取出，经镜检选定某种藻类最多的沉积物，再加清水，继续离心，如此反复就可得到比较单纯的藻体，在接种相应培养液中培养。该法可消除细菌，并增加纯粹分离的可能性，至少可作为藻种平板培养的准备工作。另外，在水液中藻体含量较少时，可用此法集中藻体。但此法不能做到使不同藻类完全分离。 2.2 稀释法 该方法用已消毒试管5只，在第一管盛蒸馏水10mL，第2～5管都装5mL，用高压蒸汽消毒，待冷却后，第1管用滴管滴入混合藻液1～2滴，充分振荡，使均匀稀释。每次用消毒吸管，从第1管中吸取5mL滴入第二管中如前振荡，使均匀稀释。以后依次同样滴入第3～5 管，并都充分均匀稀释。然后把五个已盛又消毒的琼胶培养基培养皿，加热使之溶解，待冷却而尚未凝固时，分别滴入五个试管的藻液各一滴，用力振荡，使藻液充分混乳培养基中。待冷凝后，把五个培养皿放在受着漫射光窗口，一直到出现藻群时为止，在20℃左右时，约10天即出现藻群。用消过毒的白金丝取些藻群，进行琼胶固体培养基的不通气培养。此过程反复多次，直至得到完全分离的纯藻种群为止。此法稀释要使用较多容器分组培养，比较麻烦，但较易成功。

小鼠巨噬细胞功能的检测

小鼠巨噬细胞功能的检测 伍国强 （兰州大学草业学院兰州730020） 摘要：本实验用CFA免疫小鼠后，检测小鼠腹腔巨噬细胞的数目以及用中性红检测巨噬细胞的吞噬能力。结果表明，免疫小鼠的腹腔巨噬细胞的数目和吞噬能力均有所提高。 关键词：巨噬细胞；功能；检测 1 前言 巨噬细胞是一种多功能免疫细胞,在机体的特异性和非特异性免疫反应中发挥重要功能。主要作用有：（1）吞噬杀伤作用：直接吞噬、调理吞噬作用。（2）抗原提呈作用：即外来的抗原性异物通过巨噬细胞的捕获、加工和处理后，与胞内合成的MHC-1/II类分子形成抗原肽－MHC分子复合物，并被呈递到细胞膜表面，被TCR 识别的作用。具有此作用的细胞叫抗原呈递细胞（antigen presenting cell,APC)。此外，巨噬细胞表面还表达多种共刺激分子，如B7、ICAM-1、LFA-1,3等分别与T细胞上的CD28、LFA -1(CD11)、LFA-2(CD2)等相互作用，为T细胞的活化提供第二信号。（3）抗肿瘤作用：Mφ被某些细胞因子如IFN-γ激活后能有效杀伤肿瘤等靶细胞，其吞噬杀菌能力也显著提高。（4）分泌生物活性介质，产生免疫应答和其它免疫效应：如 IL-1,12、IFN、TNF、PGE等;以及某些补体成份和凝血因子、组织修复因子等。为了检测巨噬细胞的吞噬功能，我们用CFA免疫的小白鼠作为实验材料检测其腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用。 2 材料与方法 2．1 材料 2．1．1 药品：生理盐水、0.6%环磷酰胺、Hank’s溶液、1640培养基、细胞裂解液、中性红等。 2．1．2 仪器：血球计数板、细胞培养箱、分光光度计等。 2．1．3 动物：小白鼠2只，由兰大医学院动物实验中心提供。 2.2、方法 2．2．1 小鼠腹腔巨噬细胞制备取小白鼠2只，分为对照组和实验组，对照组注射0.1ml生理盐水，试验组注射0.1mlcFA。48小时后，小鼠眼眶放血，断颈处死。腹腔注射3ml预冷的生理盐水。吸取腹腔渗出液5ml离心管（冰浴）。1600rpm离心10 分钟，弃上清，4℃生理盐水定容至5ml。血球计数板镜下巨噬细胞计数。用生理盐水调mΦ浓度为1×106，取4ml 1600rpm 离心10分钟，弃上清加4ml 1640定悬。将mΦ加入24孔板，每组4孔，每孔1ml。37℃，5%CO2细胞培养箱贴壁培养纯化2小时。2．2．2 巨噬细胞吞噬中性红试验将贴壁纯化好的mΦ弃1640培养液，对照孔加0.5ml生理盐水，其余每孔加0.5ml0.075%中性红,继续培养1小时。倾去上清液,用温PBS 洗细胞3 次,每孔加入细胞溶解液(为体积分数50 %的乙酸和体积分数50 %的无水乙醇) 2ml ,室温下放置30分钟,待细胞溶解后,即用分光光度计测定OD值。以OD 值表示巨噬细胞功能的强弱。 3 结果与讨论表：mΦ的浓度及吸光值 mΦ细胞个数mΦ浓度 （个/ml) 0D值 对照组256 6.4×105 0.252 试验组2176 5.44×106 0.283 3．1 免疫小鼠腹腔巨噬细胞浓度从上表可以看出，用cFA免疫的小鼠腹腔巨噬

小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法

小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。 步骤 一、实验材料准备 1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。 2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。碘酒绵球和酒精绵球。 3. 器械：一次性注射器、手术器械。 二、实验方法 如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。 1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用

酒精绵球消毒腹部肌层。 2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。 3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。 4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。 三、结果 巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。 注意

藻类的实验室培养方法优化-1

藻类的实验室培养方法优化

第1章绪论 1.1 研究背景及目的 由于水体富营养化加重，河流、湖泊（水库）中火量藻类繁殖，直接影响了人们的饮用水安全。为了有效控制藻类的生长，对藻类的研究是非常必要的。众所周知，富足的氮、憐等营养物质，缓慢的水流速度，适宜的气候条件包括水湿、光照等是特定优势藻生长繁衍所必需的环境条件。目前人们对于富营养化水体中藻类的研究主要集中在温度、光照、营养盐水平下的藻类生长，并且找出了藻类生长与温度、光照、营养盐等之间的对应关系。但是水体中浮游生物的种群交替和生物量的变化，不仅与水体的温度、光照周期、营养物质及生物自身的生理状态相关，还受到水体流动的影响。 本实验分别以实验室培养铜绿微囊藻为实验对象，参照藻类生长的最适宜环境条件，在温度、光照、pH值及营养盐条件一定的条件下，研究影响藻类生长的规律，为生态调水、生态河道设计流速的确定提供理论依据，控制或减少水体富营养化现象的发生。 1.2 藻种的分类 藻类植物并不是一个单一的种群，它的分布范围极广，对环境条件要求不严，适应性较强。有些种类的水藻在极低的营养浓度、极微弱的光照强度和相当低的温度下也能生活。不同研究系统对藻类的分类方法各不相同，常用的分类系统，如，根据藻类的结构特征和藻细胞的生理生化特点，将藻类分为蓝藻门、硅藻门、黄藻门、绿藻门等共十一门，引起水体富营养化的藻类植物主要为蓝藻门和绿藻门；根据藻类在水中生长的位置，将藻类分为浮游藻类、飘浮藻类和底栖藻类。硅藻门、甲藻门和绿藻门的单细胞种类以及蓝藻门的一些丝状的种类浮游生长在海洋、江河、湖泊，称为浮游藻类。一下简要说明蓝藻和绿藻的种类、分布、形态和繁殖特征。引起水体富营养化的藻类植物主要为蓝藻门和绿藻门。 1.2.1 蓝藻 在中国，蓝藻是有毒有害性最强、分布范围最为广泛的一类淡水藻。有毒的蓝藻藻种有：铜绿微囊藻，泡沫节球藻，水华鱼腥藻，阿氏颤藻，水华束丝藻等。蓝藻是广适性藻类，分布十分广泛。蓝藻的主要生存环境为淡水和海洋，它们能在 咸水、咸淡水、淡水、冰冷和沸腾的泉水中生存，但大多数生活在淡水，少数生活在海洋。蓝藻的抗逆性很强，能在其它藻类无法生存的环境中繁衍。例如，有些蓝藻能在60-85℃的温泉中生长繁殖；有的在54℃条件下还能生长、固氮；有的可-35℃的低温（如地木耳）；有一些在过饱和盐水中也可生长。蓝藻还具有

小鼠巨噬细胞试验

一、小鼠巨噬细胞分离培养 小鼠脱颈处死，浸入75%酒精中5min后，于腹中线处剪开皮肤，暴露腹壁肌肉，用酒精消毒腹膜壁，用无菌注射器将PBS或无血清DMEM培养液5ml 注入腹腔，仰卧平放并轻柔小鼠腹部2~3min，静置5min后，使动物体倾向一侧，用注射器抽取腹腔液约4~4.5ml，1500rpm离心8min，去上清，用含10%小牛血清的DMEM培养液进行细胞计数，调整细胞浓度为lx10∧6个/ml(取出一滴细胞悬液经台盼蓝染色，细胞存活率大于99%)，5ml/瓶接种于25cm2的培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，2-3小时后更换培养液除去未贴壁细胞，贴壁细胞则为腹腔巨噬细胞。 注：巨噬细胞不增殖，不传代，能培养存活2-3周，细胞形态基本不变，细胞贴壁成不规则形状。 二、细胞计数 1.制备细胞悬浮液，用DMEM培养基进行计数 2.准备记数板：用蒸馏水冲洗，擦镜纸擦拭，再用酒精擦净，2-3次 3.加样 4.计数：用台盼蓝染色计数。 细胞悬液细胞数/ml=4个大方格总数/4×10∧4，如计算前已稀释再乘稀释倍数 三、药物配制 将挥发油配成64mg/ml母液，用DMSO助溶，用无血清DMEM培养液稀释，使其终浓度为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml。 四、挥发油对细胞毒性检测 将浓度为1×10∧6个/ml的细胞悬液1ml/孔接种于16孔板中，置培养箱中培养，24h后加入不同浓度的挥发油，同时设DMSO对照、空白对照及空白调零孔。培养24h后弃培养液，每孔加入ml无血清培养液和20ulMTT(5mg/ml)液，继续培养4h，然后弃培养液每孔加入 150ulDMSO，微量振荡器振荡10min后，采用酶标仪测定其在570nm波长的吸光度(A值)，并用下列公式计算细胞的存活率: 药物组A值均数 细胞存活率(%)= x100 空白组A值均数 五、细胞炎症模型建立 为建立体外细胞炎症模型，确定后续实验中LPS刺激巨噬细胞的时间和浓度，对LPs刺激巨噬细胞的时效与量效关系进行了研究。采用ELISA或RT-PCR测定小鼠腹腔巨噬细胞上清液中TNF-a含量来研究时效与量效关系。 时效关系：培养24h后的细胞分组加药：空白组（完全培养液）、LPS 1h组（终浓度为1ug/ml）、LPS 3h组（1ug/ml）、LPS 6h组（1ug/ml）、LPS 12h组（1ug/ml），分别在规定时间终止培养，弃去培养液。用ELISA法，450nm测TNF-a含量。量效关系：方法同上，分6组LPS浓度分别为0、0.001、0.01、0.1、1、10ug/ml

藻种培养方法

藻种培养方法 一、藻种的两种培养类型 一般来说藻种的培养有两种方式：一种是长期保存所需要的培养方法，一种是以实验为目的，短期内保藏藻种的培养方法。 长期培养最主要的问题是选择一种合适的培养基，可以在3个月到一年的时间内连续培养藻种。最适合长期培养藻种的培养基是agar（固体琼脂培养基），但是使用agar有一个弊端，即培养物保持无菌的问题；我们可以加一层蒸馏水（咸水的藻类可以加灭菌过人工的海水）在agar上，这种做法可以保证在长期保种的过程中减少agar水分和营养的流失。长期保种使用的培养基，不要选择营养过于丰富的，因为多数的藻，尤其是丝状藻，在营养丰富的环境生长，会发生形态结构上的变化，如果要做生理生态方面研究，实验材料的形态结构是不能异常的。 适合长期保种的贫营养的培养基有这些：Bold’s基础培养基，以及该培养基加上蛋白胨或者琼脂制成的a gar，适合长期培养绿藻；Allen及其改良后的配方可以长期培养一般常见的蓝藻和绿藻；土水培养基和它的一个改良的系列也实用培养多数藻种。对于我库提供的藻种，由于藻种长期习惯的原因，建议使用我们提供的原配方来培养，在长期培养的时候，可以适当稀释原培养基，在藻种培养过程中，生长速率会变慢，可以保持其形态结构不变。 另外，长期培养的时候，除了选择适当的培养基，还可以降低温度5～8C（降温的过程最好能循序渐进，突然改变环境温度，可能会导致藻种不适应而死亡）。光照强度可以减小为原先的一半。在实验之前3到4周，将长期培养的藻种接种到我们提供的培养基中（培养基必须灭菌），按照我们给予的培养条件培养，在实验前6天左右，再次接种。 短期培养则可以直接按照我们提供的培养基和培养条件培养。由于试验的需要，常常要求在短期时间内获得大量的培养物，我们可以采用通气培养和摇床培养。通气培养可以通CO2或洁净的空气，视培养物的多少来决定通气泵的大小，在通气的硅胶管中设置一个缓冲瓶，塞上灭菌后的脱脂棉，帮助净化空气，如果对通气有更高的要求，可以在通气管中加上一层滤膜。使用摇床培养，需要注意藻种的生理周期。 二、培养基的选择和配制 1、培养基的选择 ①BG11是我库培养蓝藻使用最广泛的培养基。除了极少部分蓝藻，大部分都使用BG11。按照我们给的配方配制好后高压灭菌，BG11经常会产生絮状沉淀。这是因为其中有Ca+和CO32-,我们可以在灭菌后再超净台上用灭菌过的注射器来加两者之中的另外一种。通常我们建议将氯化钙的母液单独灭菌后在无菌室保存，在配置好BG11的工作液并灭菌之后，在超净台上用注射器将氯华钙加入。 ②SE是我库用来培养常见的绿藻所使用的培养基。一般来说，如果配制了母液，用母液来配培养基，灭菌后是不会产生沉淀的。配置的时候注意先将所需要的蒸馏水准备好，将需要的药品逐个加入，等到一种药品充分溶解之后再加入第二种。另外，土水在蒸馏过滤后，是不需要灭菌的，因为高压灭菌的过程会让其中的一些营养成分损失。 ③水是培养基成分中很重要的一个方面。配培养基，可以取蒸馏水、自来水、去离子水，也可以取藻种采集地的水。使用经过处理的水，如双蒸水、去离子水，有时候并不合适培养，因为仪器在处理过程中会带入微量的有毒物质。采集藻种采集地的水来培养是最理想的，但是需要经过一些处理，处理的手段和过程要尽可能保持其营养成分不变。如果是咸水或者海水的藻类采集地采集的水，应将其置于5℃的黑暗中，保持6个月。如果是泉水或者湖水等淡水的水源，水样置于20℃的室温，立即通过活性炭方法处理：每升水加2g活性炭，搅拌一小时后，过滤，并重复此过程3～4次。 ④咸水和微咸水的藻类需要的人工咸水的合成效果关键在于如何蒸馏；还有一些水华蓝藻难以培养，主要原因是因为在野外生长时，通常底泥提供的营养元素可以溶在水中，但是在实验室培养，经过高压灭菌，