Tessier五步提取法步骤

Tessier五步提取法测定土壤中重金属

①可交换态

将1.0000g（0.0003以内）土样加入到50 ml 的塑料离心管中，同时向管中加入8ml 1mol/L的氯化镁（MgCl2.6H2O），室温下振荡lh(200r/min)，离心10 min(4000r/min)，移出上清液，将移出的溶液过滤，用50mL的容量瓶定容。

试剂配制：（称取氯化镁203.300g定容到1L容量瓶即1mol/L，或者称101.650g 定容到500ml容量瓶）

②碳酸盐结合态

经①处理后的残余物在室温下用8ml 1mol/L的乙酸钠(NaAc)提取，提取前用醋酸(HAc) 把pH调至5.0，振荡8h (200r/min)，离心10 min(4000r/min)，移出上清液，将移出的溶液过滤，用50mL的容量瓶定容。

试剂配制：（称取82.030g NaAc定容至1L即1mol/L的乙酸钠）

③铁锰氧化态

在经②处理后的残余物中加入20m1 0.04mol/L盐酸羟胺(NH2OH.HCl)的25%（v/v）的醋酸(HAC)溶液进行提取，提取温度在96±3℃，时间为4h，离心10 min(4000r/min)，移出上清液，将移出的溶液过滤，用50mL的容量瓶定容。试剂配制：（称取2.780g盐酸羟胺，用25%的醋酸将盐酸羟胺定容至1L即可）④有机态

经③处理的残余物中，加入3 ml 0.02 mol /L硝酸(HNO3)和5 ml 30%(V/V)过氧化氢(H2O2)，然后用硝酸(HNO3)调节pH至2，将混合物加热至85±2℃，保温2小时，并在加热中间振荡几次。再加入5 ml过氧化氢(H2O2)，调pH至2，再将混合物加热至85±2℃，保温3小时，并间断振荡。冷却后，加入5 ml 3.2 mol/L 醋酸铵(NH4Ac)，用20%(V/V)硝酸溶液稀释到20ml，振荡30 min。离心10 min (4000r/min)，移出上清液，将移出的溶液过滤，用50mL的容量瓶定容。

试剂配制：（H2O2本身就是30%的，不用再配制。量1.35ml硝酸定容至1L 容量瓶即为0.02mol/L硝酸。称取246.656g醋酸铵定容至1L即3.2 mol/L 醋酸铵，或称123.328g定容至500ml即可。）

⑤残渣态

对步骤④处理后的残余物，利用硝酸-氢氟酸-高氯酸消解法消解分析。用10%的硝酸将离心管中的残余物洗到坩埚中，加热消煮，直至溶液剩余3ml左右，加入HNO3 15ml、HF 10ml、HClO4 5ml，并轻轻摇动，继续加热蒸至白烟冒尽，最终使土壤样品变成白色或淡黄色的胶块状（若消解不完全则，加入5ml HF继续消解至完全）。用0.5%的稀硝酸冲洗坩埚内壁，温热溶解，冷却后转移定容。

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。1M Tris-HCl[t1] (pH ），EDTA （pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。 50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA 恢复活性 2. 溶液Ⅱ：NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置[t2] 。这是用新鲜的N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA的断裂会带来麻烦。 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 。5M KAc 300ml，冰醋酸，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，

高纯度质粒小量快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://https://www.wendangku.net/doc/8715907149.html, HighPure Plasmid Mini Kit 高纯质粒小量快速提取试剂盒 目录号：PL03 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存 50次 （PL0301） 100次 （PL0302） 200次 （PL0303） 平衡液室温5ml 10ml 20ml RNaseA（10mg/ml）-20℃150μl 250μl 500μl 溶液P1 4℃15 ml 25 ml 50 ml 溶液P2 室温15 ml 25 ml 50 ml 溶液P3 室温20 ml 35 ml 70 ml 去蛋白液PE 室温16ml 31.5 ml 63 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 漂洗液WB 室温15 ml 25ml 50ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温10ml 15ml 20ml 吸附柱AC 室温50个100个200个 收集管（2ml）室温50个100个200个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml） 置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分 钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍：

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌 株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。 3.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的 质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议 接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基，过夜培养14-16个小时，可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。 3. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。 4. 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知 道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 5. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗 脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－

质粒DNA提取方法与原理

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。 3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是

质粒抽提原理和详细操作步骤

质粒抽提,实验室必备技能之一 质粒 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子。 质粒抽提 从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。 质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。 碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液 溶液Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。 溶液Ⅱ 0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。 溶液Ⅲ

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 (2010-11-11 17:19:05) 转载▼ 分类：Biology 标签： 质粒 溶液 无水乙醇 大肠杆菌 杂谈 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I（1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0）充分混合。 5、加入0.2ml溶液II（0.2 mM/L NaOH，1％SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴 5 min . 6、加入0.15m1预冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min .

质粒提取操作步骤

操作步骤： 本实验方法适用于从1-10ml过夜培养的大肠杆菌菌液中提取质粒。提取量受菌株、质粒拷贝数、菌液体积和培养时间、培养基类型等因素的综合影响。 1.收菌：将过夜培养（37℃，12-16小时）的菌液于室温≧10,000g 离心1-2分钟，彻底弃除上清。 注意：高拷贝质粒建议使用≦5ml菌液；菌液用量过大不仅不能增加质粒产量，反而会因裂解不完全或杂质封闭硅胶膜而降低产量；培养时间不宜过长，否则会增加开环结构质粒的比例。。 2.重悬：加入250μl含RNase A的细胞悬浮液（S1），充分混悬震荡 或用枪头反复抽打使细菌彻底分散悬浮。 3.裂解：加入250μl细胞裂解液（S2），轻轻上下颠倒混合5次，室 温静置1-5分钟，待细菌充分裂解，溶液变半透明。 注意：避免剧烈震荡导致基因组DNA裂解，裂解时间不能超过5分钟。 4.中和：加入350μl中和缓冲液（S3），轻轻上下颠倒混合5次，充 分混匀，避免剧烈震荡。室温下≧12,000g离心10分钟。 5.DNA结合：小心吸取上清，转移到插入收集管的离心吸附柱内，室 温下≧12,000g离心1分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。 6.清洗：加入500μl漂洗液（WB,请确认已加入乙醇！）于离心吸附 柱中，室温下≧12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。 7.再次清洗：加入500μl漂洗液（WB）于离心吸附柱中，室温下≧ 12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插

回收集管中。将离心吸附柱开盖再次离心2分钟，彻底除去残余漂洗液。 8.洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个新的1.5ml灭菌离心 管中。向硅胶吸附膜的中央加入100μl洗脱缓冲液（EB），室温放置1分钟后，≧12,000g离心1分钟收集质粒DNA。 注意：为提高质粒浓度，最低可使用30μl的EB溶液，离心收集后壳将洗脱的质粒溶液再次加入离心吸附柱中重复洗脱；使用100μlEB溶液则无需二次洗脱；对6kb以上的质粒，可使用预先加热至55℃的EB溶液洗脱以提高产量；EB溶液不含EDTA，故不会影响荧光测序等后续反应；如必须使用无菌去离子水洗脱，需注意其pH值是否接近中性，否则应使用NaOH溶液将pH值调节至7.0-8.5之间。 9.储存：弃除离心吸附柱，纯化的质粒可直接用于后续反应或于 -20℃长期保存。 注意：经检测，本试剂盒从endAˉ菌株（如DH5α，TOP10，XL1-blue等）中提取的质粒反复冻融20次无降解；如需在4℃长期保存或者保存从endA+菌株（如JM109，HB101，BL21等）中提取的质粒，可向每100μl质粒溶液中加入11μl的10×TE溶液，但含EDTA的质粒溶液不可用作荧光测序模板。

QIAGEN最新试剂盒质粒大提操作步骤(翻译版)

QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit Catalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。 在开始之前作如下准备 1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P1 2）pre-chill Buffer P3 4°C存放。 3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。 4）准备异丙醇。 5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。 大量质粒提取过程 在LB培养基中种植转化的E.coli菌。使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。 操作步骤如下 1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。 2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。 3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室 温放置5min。如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。 4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。 5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。 6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。 7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。 8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。 9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。 10用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip柱。 11再用15ml Buffer QN洗脱DNA，用离心管收集DNA洗脱液。 12加入10.5ml异丙醇到洗脱液中使DNA沉淀下来，混匀。大于15000×g，4℃离心30min，离心后小心倒出上清液。 13 洗DNA用5ml无内毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-100%乙醇到试剂盒的无内毒素水中)，15000g，4℃离心10min。小心倒出上清液不要碰到质粒。 14烘干离心管底部的质粒5-10min。用合适体积的无内毒素的Buffer TE重新溶解DNA。 15检测DNA质粒的浓度并记录。

质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序

质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序 一、感受态细菌制备（CaCl2法） 1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。 2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。 3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min， 4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。 5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。转移到一个离心管中，共8ml。 6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。 7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。 二、溶液的配置 1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。高压灭菌20分钟备用。 2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。 另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。 3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用； 4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。取出后，稍冷却，一个60mm的培养皿中加入约20ml培养基，无菌条件下铺板。 5. 选择性培养基：培养基+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min，取出后放于60OC水浴，保持60oc温度加入100mg/ml的氨苄青霉素（Amp）即100ml

去内毒素质粒提取DNA操作流程

20ug去内毒素质粒提取DNA操作流程 注意：提质粒整个过程要用灭菌枪头和灭菌管，所有试剂要用灭菌枪头吸； 10-20ug质粒提取只用一个蓝色质粒过滤柱； 试剂：solutionⅠ加酶后和BufferN3要放在4℃冰箱。 转化用stBl3感受态 1.转化：取质粒1ul加stBl3感受态50ul,冰浴30min，热击45秒-60秒，冰浴2min，加 SOC 400ul，放在摇床摇1小时，划线，放在37℃恒温箱过夜 2.接菌 早上开始上班时，把平板取出，挑单菌落到1ml试管中，放到摇床摇。摇到下班前接到5ml试管中，20ug质粒接3支试管 3.把试管放到37℃恒温摇床摇过夜（大约16小时） 4.收获细胞： 试管在37℃恒温摇床取出，移到40ml离心管收菌（每种样品一个管，注：40ml 管最多只能装7支5ml试管），用天平调平，离心（3500转/分 10分钟或8000转/分 2分钟），弃去上清液，加350ulsolutionⅠ(溶液Ⅰ)，震荡混匀至沉淀重悬，把重悬液移至5ml 管中。 5.加350ul solutionⅡ(溶液Ⅱ)，温柔上下颠倒至溶液变清，加175ul BufferN3，上下颠倒，放在-20℃冰箱放置10min,离心12000rpm/min 10min，把上清液移到5ml管中。 6.DNA结合： 7.加入1ml ETR Binding Buffer, 上下颠倒大约20次，混合后移至Higbind(蓝色质粒过 滤柱，每个装660ul，每个 质粒1个柱)离心12000rpm/min 30’s弃去滤液（过完为止）。 8.DNA洗柱： 加250ulETR wash Buffer洗柱，离心12000rpm/min 1min，弃去滤液，加250ul BufferEHB 洗柱，离心12000rpm/min 1min，弃去滤液, 加700ul DNA wash Buffer洗柱，离心12000rpm/min 1min弃去滤液(重复一次)，倒去滤液空管离心12000rpm/min 3min。 9.把柱放在进口1.5ml ep管中，加60ul细菌内毒素检查用水（要用灭菌枪头加），放置 2min离心12000rpm/min 2min。 10.测浓度：记录浓度和260：280（纯度），交QC和记录数据。 11.纯度要求：1.80-1.87 12.质粒浓度：500ng/ul以上，体积40-60ul

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用教学总结

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作 用

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。 1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖 4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。

质粒小提步骤

BIOMIGA质粒小提试剂盒II简明步骤（PD1213） （详细内容请参考英文说明书） I. 实验前准备II. 注意事项 RNase A: 使用前将提供的所有RNase A瞬时离心后加入Buffer A1, 使用后将Buffer A1/RNase A置于4oC保存。质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,N1, 相同体积的Wash Buffer 和Elution Buffer. DNA Wash Buffer*: 使用前请将8 mL (PD1213-00)或48 mL (PD1213-01)或216 mL (PD1213-02) or 90 mL (PD1213-转化菌:若为-70oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养03)96-100% 乙醇加入DNA Wash Buffer。后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。 Buffer B1: 在低于室温时会沉淀，请于50oC左右水浴加热至沉 切勿直接取冻存的菌种进行培养。淀完全溶解，溶液澄清，使用后保证Buffer B1瓶盖旋紧。 在室温下（22-25oC）进行所有离心操作。 III. 操作步骤 若用于提取1-5 mL的菌落，请将Buffer A1, B1, N1的量降低至250 μL, 250 μL 及350 μL，DNA wash Buffer及Elution Buffer的量不变。1. 接种新鲜的单个菌落到5-12 mL的LB培养基（含适量抗生素），37oC震荡培养14-16小时（勿超过16小时）。2. 室温下10,000 x g离心1分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。注：残留的液体培养基容易导致菌体裂解不充分，第5步离心后沉淀较松，不易吸取上清。注：本说明书中的操作程序适用于标准LB （Luria Bertani）培养基培养12-16 小时后，OD600（细菌密度）在2.0-3.0之间的菌液。若采用的是富集培养基，如TB或2×YT，注意保证OD600不超过3.0。 注：具体如果没有充分悬浮均匀，将导致菌体裂解不完全，从而使产量降低。3. 加入450 μL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡充分悬浮细菌细胞。 4. 加入450 μL Buffer B1, 轻轻地反转多次至溶液充分混匀，室温静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。

感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)

感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤） 感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。 一般来说,感受态细胞的最基本要求是： 1、没有质粒 2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄） 3、营养条件一般，非苛养菌 CaCl2法： 操作原理： 1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成 细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞 细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。 2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生 剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。 意义： 将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。 实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。 试剂: 1.LB固体和液体培养基 2.Amp母液(储存浓度50mg/ml) 3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。 4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

实用文档之OMEGA质粒提取试剂盒操作步骤

实用文档之"OMEGA质粒提取试剂盒操作步骤" 1．在10-20ml试管中，将携带有所需质粒的E.coli接种到5ml LB培养基LB （含氨苄青霉素50μg/ml），37℃振荡培养12-16h。需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109. 2．取1.5~5ml菌液室温10000×g离心1min 3．去上清，加250μl溶液Ⅰ（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。4．加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4~6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。(储存溶液Ⅱ应拧紧瓶盖) 5．加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀 6. 室温13000×g离心10min. 7．特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱 8．弃滤过液，加500μl Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。 如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略 9．弃滤过液，再用100%乙醇稀释的700μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g 离心1min.注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签，如果经过冷冻，用前必须恢复室温 10．此步可选：再加700μl Wash Buffer清洗吸收柱 11.必须将吸收柱13000×g离心2min确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤。 12.将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加30-50μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，13000×g离心1min，一次可洗脱75-80%附着DNA（可进行再洗脱，但会降低DNA浓度）。 13. 检测：方法A：分别在260nm和280nm波长下测定20-50倍稀释液的吸光度 DNA浓度＝260nm吸光度×50×稀释因子μg/ml 高质粒拷贝数能达到5ml培养液得到25μg DNA，如果260nm吸光度/280nm

QIAGEN-质粒提取操作

质粒提取操作步骤 ——QIAGEN(德国凯杰)质粒提取试剂盒 一、细菌培养物的生长 1. 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到2-5mL含有适当抗生素的LB液体 培养基中生长。将液体培养基置于37℃，300rpm的摇床中振荡8小时。2. 用LB培养基以1/500~1/1000的比例稀释含菌落的培养基。若为了获得高 拷贝质粒，用100-200ul含菌落液体培养基接种到100ml LB培养基中；若为了获得低拷贝质粒，用250~500ul含菌落培养基接种到250ml LB培养基中。让其在37℃，300rpm的摇床中振荡12-16小时。 二、细菌的收获和裂解 1. 在6000×g，4℃条件下离心15min，收获细菌。 2. 加入10ml Buffer P1重悬细菌。 3. 添加10ml Buffer P2，剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。 4. 加入10ml冰浴的Buffer P3到此溶菌产物中，晃动离心管4-6次使其混匀。 5. 将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。 6. 打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。 7. 添加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。 三、质粒DNA的纯化 1. 将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管 中溶液慢慢滴下排空。 2. 将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。 3. 用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip柱。 4. 再用15ml Buffer QN洗脱DNA，用离心管收集DNA洗脱液。 5. 加入10.5ml异丙醇到洗脱液中使DNA沉淀下来，混匀。15000×g，4℃离 心30min，离心后小心倒出上清液。 6. 洗DNA用5ml无内毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-100%乙醇到试剂盒的无内 毒素水中)，15000×g，4℃离心10min。小心倒出上清液不要碰到质粒。 7. 烘干离心管底部的质粒5-10min。用500ul无内毒素的Buffer TE重新溶解 DNA。

质粒提取方法及步骤

质粒提取方法及步骤 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少追其原因，我想大概是因为分子克隆里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述这是导致我的学生误入歧途的主要原因后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多老师也是这个状态这就不得不让人感到悲哀了 我想这恐怕和我们的文化有点关系中国人崇尚读书，学而优则仕的观念深入人心经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的八股学生命科学是实验科学，它讲究动手如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的艺术家每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸 让我们先来看看溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响所以说溶液I中葡萄糖是可缺的那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长在溶液I 中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB 培养基来悬浮菌体就可以了有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块 轮到溶液II了这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS

高纯度质粒小提中量试剂盒操作方法及步骤说明书

高纯度质粒小提中量试剂盒 目录号：PL1801 适用范围： 适用于5-15ml 中等规模质粒制备（mind preparations） 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次 平衡液室温5ml RNase A（10mg/ml）－20℃250μl 溶液P1 4℃25 ml 溶液P2 室温25 ml 溶液P3 室温35 ml 去蛋白液PE 室温16ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 漂洗液WB 室温15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温10ml 吸附柱AC 室温50个 收集管（2ml）室温50个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml） 置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA

残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分 钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌 株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。 3.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的 质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 注意事项 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2.溶液P3和去蛋白液PE中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、 眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。