PCR及其改进技术在食品检测中的应用
PCR及其改进技术在食品检测中的应用Application of PCR and PCR improved technology for
detection in foods
刘辉1，杨利平1，2，张滨1*
Liu Hui1,Yang Liping1,2,Zhang Bin1*
（1．长沙环境保护职业技术学院，长沙410004；2．湖南师范大学生命科学学院，长沙410081）
(1.Changsha Environmental Protection and Professional technique College,Changsha410004,China;
2.Department of life science,Hunan normal university.Changsha410081,China)
摘要：在介绍传统PCR的基础上，简介实时定量PCR、多重PCR、PCR-DGGE等几种常用的PCR改进技术在食品检测方面的应用。
关键词：PCR改进技术；传统PCR；食品检测
Abstract:The methods were rapidly upgraded for detection in foods when the factors of food-pollution became more and more complicated.PCR improved technology gradually replace the role of traditional PCR for detection in foods.In this paper,we introduced the application of three PCR improved technologies for detection in foods on the base of introducing traditional PCR. The three PCR improved technologies include real-time PCR,MULTIPLEX-PCR and PCR-DGGE.
Key words:Traditional PCR;PCR improved technology;Detection in
近年来,随着我国社会经济的快速发展，人们的生活得到很大改善，对食品质量的要求也越来越高。加入WTO以后，国外对我国出口食品的质量要求也越来越严格。食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题，随着食品生产的工业化和新技术、原材料、新产品的采用，食品污染的因素日趋复杂，因此食品安全检测的方法也需日新月异。自从1985年问世以来，PCR（Polymerase Chain Reaction）技术因其灵敏、快速、操作简便的优点，在食品检测领域具有广泛的应用。但是传统PCR检测技术一直面临着假阳性污染和定量准确度两大难题，用传统的PCR检测技术都依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，而这些处理过程很容易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中形成气溶胶，使PCR假阳性污染成为可能，而且电泳所用染色剂EB（溴化乙锭）为强烈致癌物质，容易危害操作者的健康。近年来，PCR改进技术在食品检测中的应用研究得越来越多，本文将简介几种PCR改进技术在食品检测中得应用研究进展。
1传统PCR技术在食品检测中的应用及其缺点
PCR（Polymerase Chain Reaction）技术即聚合酶链式反应技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。该技术自从1985年问世以来，最早应用于基因克隆和转基因检测，但由于其精确、微量的特点，已经广泛应用到其他领域。随着对一些主要食品微生物遗传性质了解的逐渐深入，许多致病菌的遗传背景进一步明了，PCR技术在食品检测中也逐渐显示出其应用前景[1]。近年来，PCR技术在食品检测中的应用主要体现在如下几个方面：
基金项目：长沙环境保护职业技术学院生物化学精品课程建设项目资助（项目编号：？）
作者简介：刘辉(1976-),女,长沙环境保护职业技术学院讲师。Email:?
*通讯作者，张滨
1.1食源性致病菌的检测
利用PCR方法对病原菌进行检测早在1992年就有报道[2]，然而利用PCR技术从食品中检测病原微生物到近几年才比较广泛应用。Uyttendaele等用PCR方法成功检测出牛肉产品中的大肠杆菌污染。经过几年的发展，利用传统PCR技术能够检测出的病原菌主要有单增李氏菌、肠出血性大肠杆菌0157、H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、性小肠耶尔森氏菌[3,4]。
1.2食品中成分种类的检测
为了防范某种特定动物病，比如疯牛病，需要鉴定食物中动物成分种类，PCR技术因其简便、灵敏、快速的优点而被广泛应用。2004年，李林等应用PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成份种类[5]。
1.3食品中有效成分的检测
当今对食品质量的要求不仅仅局限于货真价实，色、香、味俱全，而且还在于各种营养成分的数字指标。尤其是加工食品，由于经过几道加工工序，大多数原料已经完全变形，无法以传统手段(如感官)辨别出其原料品质的优劣与相关成分，消费者也只能从厂家的说明书中获取信息，这样必然给一些不法厂家提供了以次充好、甚至使用低值代用品的机会。PCR技术在加工食品，尤其是深加工食品的有效成分鉴定方面具有重要作用。2006年陈文炳等应用建立了一套系统鉴定了豆奶粉、奶粉及果汁饮料中的有效成分[6]。
1.4转基因食品的鉴定
PCR检测技术是目前转基因存在的检测方法中最为成熟的，即可做定性又可做定量分析。转基因食品重组DNA的基本结构包括启动子、目的基因、终止子和标记基因，到目前为止全世界已有30多种源基因食品得到相关国家的安全评价，在现有的商品化源基因食品中绝大多数含转录启动子CaMV35s、转录终止子NOS及抗生素抗性基因NIPTⅡ。这就为人们建立相应的PCR 筛选检测方法提供了便利[7]。迄今为止,利用定性PCR检测技术可检测如大豆、玉米、番茄、油菜等多种转基因作物[8]。
传统的PCR技术在实际应用中也表现出一些缺陷,例如在有死细菌存在的情况下容易产生假阳性、不能检测致毒微生物产生的毒素等[1]。传统的PCR技术的检测结果也有可能与实际不相符合，会出现假阴性或假阳性结果。例如，在转基因食品的鉴定中，检测物质本身含有转基因特制而未被检出，或者本身没有转基因物质而检出有转基因成分[7]。
2PCR改进技术在食品检测中的应用
PCR的改进技术就是随着生物技术的飞速发展和各项新技术与PCR技术的有机结合,针对如何控制外源DNA的污染、如何控制突变和如何利用PCR技术鉴别致毒微生物产生的毒素等，反展起来的一系列新技术，在食品检测中的应用越来越广泛。本文主要介绍实时定量PCR技术、多重PCR技术、PCR-DGGE技术等三种改进技术在食品检测中的应用。
2.1实时定量PCR技术及其在食品检测中的应用
实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。实时定量PCR技术采用完全闭管检测，采用实时检测技术和稳定无干扰的荧光激发光源，不需PCR后处理，避免了交叉污染；从检测开始到定量结束，整个过程耗时短，操作方便，能非常精确、特异的进行检测。近年来，实时定量PCR技术在食品检测中的应用研究越来越广泛。在食物加工过程中外源DNA污染的定量，病原微生物的检测、掺假量的检测、转基因食品的检测方面都具有重要的应用。MμLe G 等人[9]利用实时定量PCR检测葡萄中曲霉菌的污染程度。为了防止食品中掺假，西班牙,意大利
和法国规定普通小麦在面条和粗粒小麦粉中的含量,Sandberg M等人[10]利用实时定量PCR技术检测谷物基因来控制那些缺乏麦麸的婴儿食物。Alery等[11]证实利用实时定量PCR技术是估计这些食品中普通小麦量的理想技术，曹际娟等[12]运用实时定量PCR技术检测了肉骨粉中牛羊源成分、定量的测定了转基因玉米MON810成分和对转基因玉米GA21品系进行了鉴定。潘良文等[13]运用实时定量PCR对转基因抗草甘磷油菜内源特异参照基因BnACCg8和外源E9’3终止子以及对转基因抗草丁膦油菜籽中Barnase基因进行测定。
2.2多重PCR技术及其在食品检测中的应用
多重PCR技术就是指在单一PCR技术的基础上进行改进的一种技术，是将多条引物和多条模板混合在一个反应体系中分别特异扩增不同的目的条带，或者多条引物和单一的模板DNA混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片断，常用于对超长片断的扩增。和传统单一的PCR 技术相比，多重PCR技术具有高效性、系统性和经济简便的特点。自从1988年由Chambercian 等首次提出并应用这一方法以来，多重PCR技术在生物医药方面具有广泛的应用，近来，在食品检测中的应用也具有重要的应用。焦豫良等应用多重PCR技术一次性可以检测出出肠毒性大肠埃希菌(E.coli2ETEC)，蜡样芽胞杆菌(B acillus cereus)，沙门菌属(Salm onella spp)，大肠埃希菌O157:H7(E.coli2O157:H7)，志贺菌属(Shigella spp)，霍乱弧菌(V ibrio cholerae)等菌属或菌[14]。冯家望等利用多重PCR技术的快速可靠、灵敏准确、操作简便、成本低廉等特点，建立了一种快速检测市售的大豆、玉米、油菜及其加工产品中的转基因成分的方法[15]。
2.3PCR-DGGE技术及其在食品检测中的应用
PCR-DGGE技术是由Sheffield等1989年首次提出，将变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术和PCR技术结合起来，可分离长度相同但是碱基不同的DNA片段混合物的一项技术。PCR-DGGE 技术将PCR和DGGE结合起来在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基对,具有特异性强、敏感性高的特点。染色后的凝胶用成像系统分析可以在一定程度上反映样品的复杂性。条带的多少能反映样品中微生物组成的差异，条带的亮度能反映样品中微生物的多少。由于PCR-DGGE具有以上优点，在食品检测中，尤其是食品微生物的检测中具有重要的作用。采用PCR-DGGE技术进行食品微生物检测时，首先要提取食品样品中的RNA或者DNA，利用保守的基因片段如细菌中的16S rRNA，真菌中的18S rRNA或26S rDNA等基因片段作为模板，在一对特异性引物的作用下对样品中微生物中的rDNA或rRNA进行PCR或者逆转录PCR扩增，核酸扩增后电泳获得的指纹图谱包含了与多种微生物相对应的一系列条带，可以将这些条带进一步纯化和进行序列分析鉴定出微生物的种类[16]。1999年，Ampe等[17]应用PCR-DGGE技术直接从面团中中鉴定乳杆菌和木薯淀粉发酵中的微生物菌落。Ercolini等[18]用PCR-DGGE方法直接鉴定天然的乳清培养基中对Mozza-rella奶酪生产起作用的微生物，鉴定出德氏乳杆菌、乳球菌和嗜热链球菌等嗜温的乳酸菌和一些污染物。
3PCR改进技术存在的问题与优化
上面提到的几种PCR改进技术与传统的PCR技术相比较具有许多优点，在食品检测中的应用越来越广泛。但是PCR的几种改进技术也存在着一定的缺陷。随着生物科技的发展和食品检测的需要，PCR改进技术会越来越多，现在发明的几种改进技术也会得到进一步优化。
实时荧光定量PCR技术在检测的过程中会受到包括：同源和异源DNA背景、寡核苷酸杂交特异性、Taqman探针比例、细胞裂解效率、mRNA的部分降解、PCR产物长度的长短等因素影响，可造成定量结果出现偏差或导致假阳性结果，因此在操作时必须对所设计引物的特异性进行充分验证和条件的最优化研究。现在使用的引物探针大多数来自Taqman公司，其合成成本
较高，需要专门的实时定量PCR仪器，成本比较高。因此降低探针制备的成本或发掘新的荧光染料、进一步提高分析的灵敏度及实验重复性、样品制备简单化、程序化和机械化以提高效率及降低成本将成为今后的发展趋势。
多重PCR技术在食品检测中存在引物之间的抑制、引物和其它模板间的非特异性结合等缺点。因此，在使用多重PCR技术检测食品时，要考虑引物与引物间、引物与模板间的作用因素，优化引物设计和PCR反应的条件，避免假阳性和假阴性的结果出现。
食品成分的复杂性及采样和样品处理可能会使DNA提取产生误差，会使模板和扩增引物选择产生影响，因此，DGGE处理的片段大小的限制（不能超过500bp）。电泳条件以及微生物不同序列基因的16S rRNA多拷贝的存在都会对PCR-DGGE分析结果产生影响，影响着DGGE的检测范围。为了避免rDNA电泳图谱的混杂，最好是将这些片段进行测序，也可以通过改变16S rRNA的可变区，使用不同的PCR扩增前体或者调整DGGE的梯度条件来进行分析。在DGGE 分析中可以采用适当的软件包将扩增片段的分子梯度进行标准化，特别是检测大量样品时，采用标准化的方法对不同的DGGE凝胶进行比较显得尤为重要。PCR-DGGE技术有时需要抽提RNA，在抽提过程中极易降解，要求条件较高，在使用的过程中所有的试剂和器材都需要用RNA 酶抑制剂处理。
4PCR改进技术的应用展望
PCR技术在食品致病菌、食品中有效成分、食品成分种类和转基因食品等方面的检测中具有重要的作用，传统的PCR技术在快速定量、定性的检测领域仍有许多问题需要解决，如提高分析灵敏度及重复性、降低自动化仪器和试剂成本、简化样品处理及多基因同时分析等。随着生物技术的发展和食品检测的需要，PCR改进技术得到了快速的发展。这些PCR改进技术与传统的PCR技术相比具有明显的优势，要么简化了mRNA的重复定量和检测过程，可精确定量、反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高，要么缩短了检测时间，扩大筛选范围。但是，这些改进技术本身也会存在一定的缺点，因此，对这些改进技术的优化也将是今后发展的一个方向，必将对食品检测的发展起到重要的推动作用。另一方面，将这些PCR改进技术整合，比如将生物芯片技术、免疫磁珠和多重PCR、荧光探针定量技术、PCR-DGGE等技术相结合形成一套完整分子生物学方法，则可使食品检测逐步向灵敏度更高、特异性更强、更加简易和经济的方向不断发展，必将在食品检测和研究领域开辟一个新的应用时代。
中文期刊参考文献请提供英文（书籍不用翻译）
附：参考文献中英文对照示范
1张梁，石孔泉，石贵阳,等。利用废物原料生产L-乳酸的研究进展[J].食品与机械，2007,23(5):138～141.
Zhang Liang,Shi Kongquan,Shi Guiyang,et al.Progress in L-lactic acid production from wasta biomass[J].Food and Machinery,2007,23(5):138～141.
[参考文献]
[1]罗梅兰，叶云，梁超香．生物检测技术在食品检验中的研究[J]．食品与机械，2006，22(3)：63-64．
[2]H Naka jima.Detection and identification of Yersinia p seudotuberculos and pathogenic Yersinia enterocolitica
by an imp roved polymerase chain reaction method[J].J Clin Microbiol,1992(30):2484-486.
[3]马宏伟，吴永生，邹清杰．PCR法检测食品中的致病性小肠耶尔森氏菌[J]．现代预防医学，2002，29(2)：
164-66．
[4]曹泽虹，李勇．用PCR法快速测定食物中毒病原菌[J]．微生物学通报，2001，28(4)：73-6．
[5]李林，徐江涛，张永强，等．PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成份种类[J]．中国动物检疫，2004，21(4)：
29-1．
[6]陈文炳，朱晓南，邵碧英，等．应用PCR技术鉴定了豆奶粉、奶粉及果汁饮料中的有效成分[J]．2006，
6(1)：362-367．
[7]王庆华，吕振岳，黄东东．转基因食品及其检测技术的发展现状[J]．粮油加工与食品机械，2002(3)：
35-7．?
8宋姗，龚加顺．转基因食品及其检测技术的研究进展[J]．食品研究与开发，2005，26(5)：131-134．9BELLAGAMBA Federica,COMINCINI Sergio,FERRETTI Luca,VALFRE Franco,MORETTI Vittorio M.
（作者名？）Application of quantitative real-time PCR in the detection of prion-protein gene species-specific DNA sequences in animal meals and feedstuffs[J].J.Food Prot,2006,69(4):8912896.页码？
10M Sandberg,L Lundberg,M Ferm,et al.Real time PCR for the detection and discrimination of cereal contamination in gluten free foods[J].European Food Research and Technology,2003,217:344-349.
11V Terzi,M Malnati,M Barbanera,et al.Development of analytical systems based on real time PCR for triticum species-specific detection and quantitation of bread wheat contamination in semolina and pasta[J].Journal of Cereal Science,2003,38(1):87-94.
12曹际娟，卢行安，曹远银．实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J]．中国生物工程杂志，2003，23(8)：87-91．
[13]潘良文，田风华，张舒亚．转基因抗草丁膦油菜籽中Barnase基因的实时荧光定量PCR检测[J]．中国油
料作物学报，2006，28(2)：194-198．
[14]焦豫良，张兴群，李振勇，等．6种食品致病菌的多重PCR检测[J]．临床检验杂志，2005，23(4)：256-258．
[15]冯家望，王小玉，李丹琳，等．多重PCR检测食品中转基因成分研究[J]．检测检疫科学，2006，16(4)：
16-19．
[16]杨佐毅，李理，杨晓泉，等．PCR-DGGE指纹分析技术在食品微生物检测中的应用[J]．食品工业科
技，2006，27(2)：201-203．
[17]Frédéric Ampe,Nabil ben Omar,Claire Moizan,et al.Polyphasic study of the spatial distribution of
microorganisms in mexican Pozol,a fermented maize dough,demonstrates the need for cultivation-independent methods to investigate traditional fermentations[J].Applied and Environmental Microbiology,1999,65(12):5464-5473.
pcr技术原理简介
PCR技术的基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多 数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引
PCR原理及过程
PCR技术原理、实验步骤和应用 来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。 关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应 一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 三、实验试剂与器材 模板DNA、L dNTP Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物 O 10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH 2 PCR仪、移液枪、PCR板 四、实验步骤 1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液： 模板DNA 2μL 引物1 1μL 引物2 1μL dNTP μL
荧光PCR检测原理
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。 其特点有： (1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。 (2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。 实时荧光定量PCR技术的基本原理 在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR 循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。 方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R2＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。 实时荧光定量PCR技术的应用 1. 基因工程研究领域 ①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。 ②转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。
PCR技术及原理
PCR定义：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR技术的基本原理 一、PCR反应成分： 1、模板DNA； 2、引物； 3、四种脱氧核糖核苷酸； 4、DNA聚合酶； 5、反应缓冲液、Mg2+等。 二、PCR反应基本步骤： 1、变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2、退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA 链互补的DNA子链，中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。 PCR扩增的基本方法 PCR反应的成分和作用
总体积：一般为25μl～100μl 一、无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50?mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP 为200?μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1?mmol/L时会抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影响反应的特异性和产率。、 三、BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。 四、底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。 五、Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA 单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。 六、模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。 七、引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。 PCR反应条件的选择（影响因素） 温度参数： 1、变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。 2、退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。 3、延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。 循环数： PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。 PCR产物积累规律： 反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。
pcr检测技术
《食品安全学》综述 PCR快速检测技术综述 1．前言 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，是肉眼能直接观察和判断；可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情，用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 该酶促反应最基本的3个环节是：[1]模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；[2]引物与模板链的特异性复性；[3]引物链的延伸。 2.研究的目的与意义 聚合酶链反应（PCR）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是某一特定序列存在与否，借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数，此测定可以是绝对的，如每微克样本中靶DNA的分子数；也可以是相对定
量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊，对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki 等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR 与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 3.国内外研究现状 3.1. 基础研究方面的应用 目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的： [1] 扩增目的基因和鉴定重组子； [2]克隆基因； [3]基因功能和表达调控的研究； [4]基因组测序； [5]制备单链模板； [6]致突变； 3.2. PCR在临床上的应用[2] [1]在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。 [2]在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR 技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。
PCR技术的原理与方法
PCR定义 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR技术的基本原理 一.PCR反应成分： 1.模板DNA； 2.引物； 3.四种脱氧核糖核苷酸； 4.DNA聚合酶； 5.反应缓冲液、Mg2 等。 二.PCR反应基本步骤： 1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s） 1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。 2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。 3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的
DNA以2n的形式增加。 ?PCR扩增的基本方法 ?PCR反应的成分和作用 总体积：一般为25μl～100 μl （一）无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2 :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。M
PCR技术在食品检测中的应用汇编
许昌学院食品与生物工程学院2015-2016学年第一学期《现代食品检测技术》课程论文 PCR技术在食品检测中的应用
PCR技术在食品检测中的应用 许昌学院食品与生物工程学院，河南许昌461000 传统检测食品中微生物的方法主要是分离和培养鉴别，该方法操作繁琐，有些微生物很难培养。尤其是针对检测食品中的弱势菌，使用传统的方法基本无法检测出来。聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，由于它可以将微量的DNA大幅增加的特点，所以能够比较准确地检测食品中微生物。本文主要介绍PCF技术的操作原理和目前运用到食品检测中的几种具体的PCR技术特点，包括：多重PCR技术、实时荧光定量PCF检测技术、免疫PCR检测技术。并且对PCR技术在食品检测方面予以展望，为解决食品安全问题和相关食品检测做出导向作用。 关键词：食品检测；微生物培养；聚合酶链式反应；食品安全问题
、、■ 刖言 食品⑴是指原料不经加工或经过加工或改变性状、具有一定营养价值、对人体无害、可供人类食用的物质。它不仅富含营养成分和水等物质更容易滋生微生物，而且它能最直接的与人体接触，进入人体的消化系统，所以食品安全问题[2-4] 不容轻视。现代食品行业，在生产、运输、销售过程中有很多有害的微生物，这将严重危害食品的品质和人们的健康，甚至会引起一些严重的疾病。现代食品检测技术⑸是对食品按其原定用途进行制作和食用时不会使消费者受到伤害的一种担保。为保证食品安全急需一些快速、敏感、特异的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。PCR检测技术具有敏感性、 特异性、简便、快速的优点，现已广泛应用于微生物检测，尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面，具有常规方法无法比拟的优越性。 随着分子微生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，尤其是聚合酶链反应（PCR）成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于食品的检测，具有广阔的发展前景。 1 PCR技术的原理 PCR是在体外人为控制的合适条件下，以单链DNA或RNA为模板，以1 对人工合成的寡核苷酸序列为引物，在耐热Tap DNA聚合酶作用下特异性扩增基因片段的技术。整个反应过程除了需要加入待扩增的DNA片段和两个决定特 异性的引物外，还需加入适量的缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸溶液（dNTP）、Tap DNA聚合酶、Mg2+等。每个PCR循环包括模板DNA变性、模板DNA与引物的退火（复性）、引物的延伸3个基础步骤。反应时，首先将靶DNA双链加热变性为单链状态，然后降低溶液温度，加入2段人工合成的与靶DNA端邻序列互补的寡核苷酸片段作为引物，即左端引物和右端引物，使合成引物在低温下与其靶序列特异配对，形成部分双链。然后，在Tap DNA聚合酶和4种dNTP 底物存在的情况下，引物沿模板DNA链（靶DNA单链）按5 '末端向3 '末端方向延伸，自动合成新的DNA双链，新合成的DNA片段又可作为扩增的模板。如此重复改变温度，由高温变性、低温复性、和适温延伸组成一个周期，每个周
简述PCR基本原理
一．简述PCR基本原理？ PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 二．简述荧光定量PCR基本原理？ Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 ?荧光域值（threshold ）：是指PCR 反应的前15 个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即：threshold
?Ct 值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔 1 〕，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 三．简述PFGE优势用途？ 1.对细菌DNA进行酶切后的脉冲场电泳分析，在分子水平揭示细菌的指纹图谱。 2．可对不同年代和不同地区的菌株建立PFGE图谱数据库，对某种病原菌的流行趋势进行分析和预测。 3．不同实验室和国家不同菌毒株的比较分析，通过软件实现数据化和网络连接，用于传染源或污染源的追踪，快速控制疫情。
PCR技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
聚合酶链式反应（P C R）原理 DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性- 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板- 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR技术分类（常用） （1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 （2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 （3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导
pcr技术的基本原理
在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医学生物学的发展无疑产生了深刻的影响。70年代，分子生物学技术在形态学中的广泛应用，随着原位杂交技术的出现，使组织细胞内特定的DNA或RNA 序列能够被定位，将蛋白质水平又提高到基因水平即核酸分子的观察和定位，从而使人类对许多生命现象在基因水平上的认识得以深化；80年代，分子生物学领域中一项具有强大生命力的技术PCR——多聚酶链反应技术问世了，很快地就被引入形态学观察的领域，使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行定位及观察。这一技术的问世，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又向前迈出一大步。 基本原理 原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。 PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物引导下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106倍），很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自动化的提高与稳定也使得PCR技术的操作简便易行。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。 原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。 基本类型 根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类，此外，还有反转录原位PCR技术等。 直接法原位PCR技术 直接法原位PCR技术是将扩增的产物直接携带标记分子，即使用标记的三磷酸腺苷或引物片断。当标本进行PCR扩增时，标记的分子就掺入到扩增的产物中，显示标记物，就能将特定的DNA或RNA在标本（原位）中显现出来。 常用的标记物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自显影的方法或用亲和组织化学及免疫组织化学的方法去显示标记物所在位置。 直接法原位PCR技术的优点是操作简便，流程短，省时。缺点是特异性较差，易出现假阳性，扩增效率也较低，特别是在石蜡切片上，上述缺点更为突出。因为在制片过程中，无论是固定，脱水还是包埋，都会导致DNA的损害，而受损的DNA可利用反应体系中的标记三磷酸核苷进行修复，这样标记物就会掺入到DNA的非靶序列中，造成假阳性。若用标记引物的方法进行直接法原位PCR，其扩增的效率比不标记更低。 间接法原位PCR技术 间接法原位PCR技术师现在细胞内进行特定DNA或RNA扩增，再用标记的探针进行原位杂交，明显提高了特异性，是目前应用最为广泛的原位PCR技术。 间接法原位PCR与直接法不同的是，反应体系与常规PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不带任何标记物。即实现先扩增的目的，然后用原位杂交技术去检测细胞内已扩增的特定的DNA产物，因此，实际上是将PCR技术和原位杂交技术结合起来的一种新技术，故又称之为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization , PISH)。 间接法PCR技术的优点是特异性较高，扩增效率也较高。缺点是操作步骤较直接法繁琐。 原位反转录PCR技术。
PCR技术基本原理及相关知识
PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR反应体系的基本成分：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP、Mg2+的缓冲液。 PCR反应体系与反应条件 -------------------------------------------------------------------------------- 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
PCR及其改进技术在食品检测中的应用
PCR及其改进技术在食品检测中的应用Application of PCR and PCR improved technology for detection in foods 刘辉1，杨利平1，2，张滨1* Liu Hui1,Yang Liping1,2,Zhang Bin1* （1．长沙环境保护职业技术学院，长沙410004；2．湖南师范大学生命科学学院，长沙410081） (1.Changsha Environmental Protection and Professional technique College,Changsha410004,China; 2.Department of life science,Hunan normal university.Changsha410081,China) 摘要：在介绍传统PCR的基础上，简介实时定量PCR、多重PCR、PCR-DGGE等几种常用的PCR改进技术在食品检测方面的应用。 关键词：PCR改进技术；传统PCR；食品检测 Abstract:The methods were rapidly upgraded for detection in foods when the factors of food-pollution became more and more complicated.PCR improved technology gradually replace the role of traditional PCR for detection in foods.In this paper,we introduced the application of three PCR improved technologies for detection in foods on the base of introducing traditional PCR. The three PCR improved technologies include real-time PCR,MULTIPLEX-PCR and PCR-DGGE. Key words:Traditional PCR;PCR improved technology;Detection in 近年来,随着我国社会经济的快速发展，人们的生活得到很大改善，对食品质量的要求也越来越高。加入WTO以后，国外对我国出口食品的质量要求也越来越严格。食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题，随着食品生产的工业化和新技术、原材料、新产品的采用，食品污染的因素日趋复杂，因此食品安全检测的方法也需日新月异。自从1985年问世以来，PCR（Polymerase Chain Reaction）技术因其灵敏、快速、操作简便的优点，在食品检测领域具有广泛的应用。但是传统PCR检测技术一直面临着假阳性污染和定量准确度两大难题，用传统的PCR检测技术都依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，而这些处理过程很容易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中形成气溶胶，使PCR假阳性污染成为可能，而且电泳所用染色剂EB（溴化乙锭）为强烈致癌物质，容易危害操作者的健康。近年来，PCR改进技术在食品检测中的应用研究得越来越多，本文将简介几种PCR改进技术在食品检测中得应用研究进展。 1传统PCR技术在食品检测中的应用及其缺点 PCR（Polymerase Chain Reaction）技术即聚合酶链式反应技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。该技术自从1985年问世以来，最早应用于基因克隆和转基因检测，但由于其精确、微量的特点，已经广泛应用到其他领域。随着对一些主要食品微生物遗传性质了解的逐渐深入，许多致病菌的遗传背景进一步明了，PCR技术在食品检测中也逐渐显示出其应用前景[1]。近年来，PCR技术在食品检测中的应用主要体现在如下几个方面： 基金项目：长沙环境保护职业技术学院生物化学精品课程建设项目资助（项目编号：？） 作者简介：刘辉(1976-),女,长沙环境保护职业技术学院讲师。Email:? *通讯作者，张滨
PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测
实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 一、实验目的 1. 掌握PCR扩增技术的基本原理 2. 掌握PCR的常规操作 3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用 4. 了解PCR技术的应用 5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法 6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素 二、实验原理 1. PCR基本原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2. PCR反应体系 3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的
PCR技术的种类及应用
PCR技术的发展及应用 平骏 14112822276摘要：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是1985年由美国PE- Cetus 公司的科学家Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展，现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍；同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。 关键词：PCR技术；PCR原理；PCR新技术 对核酸的研究己有100多年的历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想，该设想在1985年被Mullis等人实现，他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应[6]。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了深远的影响[18]。发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。 1、PCR 技术的原理[1,2] PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程，DNA 聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3，- OH 末端，并以此为起始点，沿模板5，→3，方向延伸，合成一条新的DNA互补链。简言之，其基本原理包括3个基本反应过程：变性→退火→延伸。PCR 反应的基本成分包括：模板DNA( 待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸( dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，每完成一次循环需2-4min，2-3h就能将目的基因扩增，从而达到迅速大量扩增的目的。 2、PCR技术的反应组份 2.1 模板DNA PCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链DNA，可以是基因组DNA 或cDNA，