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EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

[文章编号]100028861(2006)0120023204

EBV 转化B 型健康人B 淋巴细胞构建噬菌体抗体库

岳建华1,潘秀珍

23

,王长军2,李先富2,唐家琪

23

(1.南京师范大学医学分子生物学实验室,南京210097;2.南京军区军事医学研究所流行病学研究室,南京210002)

[收稿日期]2005-07-14;[修回日期]2005-10-13

[基金项目]国家自然科学基金(30471600)和江苏省自然科学基金资

助项目(BK 2003012)

[作者简介]岳建华(1980-),女,山西文水县人,硕士生,主要从事

细胞与分子免疫学方面的研究。(T el )025*********;(E 2

mail )yuejianhua88@s http://www.wendangku.net/doc/8ddcdfba7e21af45b207a86b.html

3通讯作者

[摘 要] 目的 构建人源抗红细胞A 抗原单链噬菌体抗体库。方法 应用E B 病毒转化方法和噬菌体抗体库技术,从E B 病毒转化成功的B 型个体淋巴细胞中提取总RNA ,逆转录合成cDNA 第一条链,PCR 分别扩增V H 和V κ基因,经重叠延伸

拼接法(S OE )组成ScFv 基因并将其克隆入pC ANT AB5E ,转化E .coli TG 1,加入辅助噬菌体M13K O7援救,构建人源抗红细胞A 抗原单链噬菌体抗体库,并测定文库的库容、滴度及ScFv 基因的插入率。使用完整A 型红细胞对该库进行4轮“吸附2洗脱2扩

增”的筛选,细胞E LIS A 、红细胞血凝实验对所获抗体进行初步鉴定。结果 所构建的噬菌体抗体库,其库容为1.2×106

,噬菌

体DNA 中全长ScFv 基因的插入率为0.90,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为2.52×1010

PFU Πm L 的初级噬菌体抗体库。以完整A 型红细胞进行四轮淘筛,出现特异性富集。经细胞E LIS A 、红细胞血凝实验鉴定,得到2株与A 型红细胞特异结合的ScFv 噬菌体抗体。结论 E B 病毒转化方法联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库切实可行,可进行亲和筛选以得到人源抗红细胞A 抗原的基因工程抗体。

[关键词] E B 病毒转化;ScFv ;噬菌体展示技术[中图分类号] R392.11 [文献标识码] A

Construction of a phage antibody library for blood group A substance by using EBV 2transformed B 2lymphocytes of B blood type

Y UE Jian 2hua ,PAN X iu 2zhen ,W ANG Chang 2jun ,LI X ian 2fu ,T ANGJia 2qi (Laboratory o f Medical Molecular Biology ,Nanjing Normal Univer sity ,Nanjing 210097,China )

[Abstract ] Objective T o construct a phage display library of human single 2chain Fv antibodies against blood group A substance.Methods T otal RNA was extracted from E B 2trans fected lym phoblastoid cell lines of B blood group by using E B virus trans formation technique and phage display library technique.The first strand of cDNA was synthesized by reverse transcription assay.With am plification of V H and V K genes by PCR ,the single 2chain fragment variable (ScFv )gene was constructed by splicing overlap extension (S OE ),and then cloned into vec 2tor pC ANT ABST.The pC ANT AB5E was trans formed into E .coli TG 1cells ,and then rescued with M13K O7helper phage.The size ,titre ,and insertion rate the constructed library were detected.Phages from the library were selected using intact red cells as a s ource of antigens.A fter 4rounds of “abs orption 2elution 2enrichment ”,individual clones were assayed for specificity by cell E LIS A and agglutination.R esults Phage

antibody library with size of 1.2×106

was obtained.The percentage of full 2length scFv gene inserted into phage DNA was 90%.The titer of

the phage scFv library was 2.52×1010

PFU Πm L after rescuing by helper phage.S pecific phage scFv was acquired after 4rounds of panning and 2clones exhibiting specific binding to red blood cells of type A were identified by cell E LIS A and agglutination.Conclusion A strategy for constructing phage antibody library by means of phage display technique and E B virus trans formation technique is practicable ,which w ould be useful in screening human engineering antibody against A blood group substances.

[K ey w ords ] E B virus trans formation ;ScFv ;Phage display technology

ABO 血型系统是最早被发现的人类血型系统,高度的免疫原性使其具有重要的临床意义,尤其是与临床急救输血、器官移植等关系较为密切。曾有

报道[1,2]

,这些血型抗体在非特异性抗细菌防御反应及对免疫系统的自我调节方面起作用。因此,开展ABO 血型系统抗体的研究对临床ABO 血型鉴定、血

型理论研究等具有重要意义。本实验室曾制备了抗

A 抗

B 鼠单克隆抗体[3]

,其作为血型试剂在国内已得到广泛应用。并在此基础上研制了鼠源抗A 基因

工程单链抗体[4]

,但其仍为鼠源抗体,在临床研究上受到限制。随着基因工程抗体技术的发展与不断完善,人源抗体的制备已成为可能,新近我们联合应用E B 病毒转化技术和噬菌体抗体库技术构建了人源抗红细胞A 抗原单链抗体库,以期获得小分子ScFv ,为进一步研究该抗体分子的生理意义及其在免疫调节过程中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 标本、试剂 健康人B 型全血标本12例源于

?

32? 

免疫学杂志 第22卷 第1期 2006年1月 I M M UNO LOGIC A L JOURNA L V ol.22N o.1Jan.2006

南京军区总医院,产E B 病毒的B9528细胞株购于中

国科学院上海细胞生物研究所,pC ANT AB5E 、辅助噬菌体M13K O7和HRP 2羊抗M13抗体购于Pharmacia Biotech 公司,HRP 2羊抗鼠抗体购于南京创瑞公司,抗A 鼠单抗为本室研制,E .coli TG 1为本室保存。RPMI1640为G ibco 公司产品,胎牛血清(FCS )为杭州四季青公司产品,淋巴细胞分离液(Ficoll )为天津灏洋公司产品,环孢菌素(cyclosprin A ,CysA )为诺华公司产品,T rizol 试剂为Invitrogen 公司产品,多聚左旋赖氨酸为南京生兴公司产品,cDNA 合成试剂盒为Fermentas 公司产品,DNA 聚合酶、限制性内切酶为

T aK aRa 公司产品,T 4DNA 连接酶和Wizard T M

PCR 产物纯化试剂盒为Promega 公司产品,其余试剂均为分子生物学纯级。

1.2 EB 病毒转化B 淋巴细胞 B9528细胞培养至对数生长期,室温1000r Πmin ,离心10min ,上清液用0.22μm 的滤膜过滤、分装,置-70℃备用。外周血淋巴细胞的分离参照文献[5]。取1m L 分离的淋巴

细胞(1×106m L -1

)与等量的E B 病毒悬液混合培养2h ,室温3000r Πmin ,离心10min ,细胞沉淀重悬于2m L RP MI1640完全培养液(含2μg Πm L CysA ),37℃50m L ΠL C O 2培养。转化成功的细胞扩大培养后,取培养上清液参照文献[6]进行血凝实验。

1.3 细胞总RNA 的提取及cDNA 第一条链的合成 分别从上述血凝实验鉴定为阳性的转化细胞中提取总RNA ,全部混合后,以Olig o (dT )18为引物,用cDNA 合成试剂盒反转录合成cDNA 第一条链,最后于70℃作用10min ,灭活逆转录酶。1.4 PCR 扩增抗体基因 参照文献[7,8],按表1设计扩增人抗体基因的引物,由上海生工生物工程公司合成。以cDNA 第一条链为模板,扩增V H 2C H 1(IgM )和V κ2C κ抗体基因。在50μ

L 反应体系中,含模板5μg ,2.0mm oL ΠL Mg 2+

,0.2mm oL ΠL dNTPs ,2.5U T aq 酶,恒定区3’端引物和可变区5’端引物各25pm oL ΠL 。反应程序为:94℃变性40s ,56℃退火1min ,72℃延伸1.5min ,共25个循环,最后72℃延伸10min ,胶回收试剂盒纯化PCR 产物。再以此产物为模板,选择J 区前向引物和V 区后向引物进行PCR ,反应程序同前。回收V H 和V κ基因,测A 260nm 计算其浓度。1.5 SOE 拼接ScFv 抗体基因 在50μL 反应体系

中,含纯化的V H 和V κ基因各20ng ,2.0mm oL ΠL

Mg 2+

,0.2mm oL ΠL dNTPs ,2.5U T aq 酶,混匀后进入拼接循环,反应程序为:94℃变性1min ,55℃退火1min ,72℃延伸1min ,共扩增8个循环,使V H 和V κ基因通过编码连接肽(G ly 4Ser )3连接。在上述反应体系中,补加V H 5’端引物和V κ3’端引物各25pm oL ΠL ,再次PCR 扩增,反应程序为:94℃变性1min ,56℃退火1min ,72℃延伸2min ,共25个循

环,最后72℃延伸10min 。回收ScFv 基因。

 表1 扩增人免疫球蛋白基因的引物

 T ab 1Primers for am plification of immunoglobulin gene

Primer name Primer

Matches (A )Constant region (1)5’2TGG AAG AGG CACGTTCTTTTCTTT 23’C H forward 2primers:(2)5’2AG ACTCTCCCCTGTTG AAG CTCTT 23’C κ(B )V H back 2primers (1)

5’2GTCCTCG CAACTG CGG CCCAG CCGG CCATG V H 1,4,6with Sfi Ⅰsite:

G CCCAGGTRCAG CTG SWG SAGTCKGG 23’(2)5’2GTCCTCG CAACTG CGG CCCAG CCGG CCATG V H 2G CCCAGGTCAACTT AAGGG AGTCTGG 23’(3)

5’2GTCCTCG CAACTG CGG CCCAG CCGG CCATG V H 3,5G CCG AGGTG CAG CTGKTG SAGTCTG S 23’(C )V κback 2primers (1)5’2GG CTCGGG CGGTGGTGGGTCGGGTGG CGG C V κ1,4with linker:

GG ATCTG ACATCSWG ATG ACCCAGTCTCC 23’(2)5’2GG CTCGGG CGGTGGTGGGTCGGGTGG CGG C V κ2,3,6GG ATCAG AWRTTGTG MTG ACK CAGTCTCC 23’(3)

5’2GG CTCGGG CGGTGGTGGGTCGGGTGG CGG C V κ5GG ATCAG AAACG ACACTCACG CAGTCTCC 23’(D )J H forward 2primer (1)5’2G CCACCCG ACCCACCACCG CCCG AG CCACC J H with linker:G CCACCTG ARG AG ACGGTG ACCRKKGTY CC 23’(E )J κforward 2primers (1)5’2G AGTCATTCTCG ACTTG CGG CCG CACGTTT J κ1with Not Ⅰsite:

G ATYTCCASCTTGGTCCC 23’

(2)5’2G AGTCATTCTCG ACTTG CGG CCG CACGTTT J κ2

K AT MTCCASYYKKGTCCC 23’

 Degenerate nucleotides :Y=C or T ,R =A or C ,W =A or T ,S =C or

G,K=T or G,M =A or C.

1.6 ScFv 基因的克隆与鉴定 分别将纯化的ScFv 和pC ANT AB5E 用Sfi Ⅰ和Not Ⅰ双酶切、连接后,转化100μL E .coli TG 1感受态细胞,然后加入1m L LB

37℃培养1h 。取转化菌100μ

L 铺2×Y T 2G A [含20g ΠL 葡萄糖及100μg Πm L 氨苄青霉素(Am p )]的平板,37℃培养过夜,菌落计数检测库容量。剩余的

转化菌进行下一步辅助噬菌体援救实验。随机挑取10个上述转化的单菌落,提取质粒,琼脂糖凝胶电泳初步判断是否插入ScFv 。取V H 5’端混合引物和V κ3’

端混合引物,以上述质粒为模板进行PCR 扩增。同时,对初步判断有scFv 插入的质粒用Sfi Ⅰ和Not Ⅰ双酶切鉴定。1.7 ScFv 抗体库的构建 将上述剩余的转化菌接种于10m L 2×Y T 2G A ,37℃培养2h ,使细胞得以表

达F 性鞭毛,加入1012

空斑形成单位(PFU )的辅助噬菌体M13K O7援救,37℃水浴1h ,室温4000r Πmin ,离心15min ,沉淀重悬于300m L 2×Y T 2AK (含100μg Πm L Am p 及70μg Πm L 卡那霉素),30℃过夜振荡培养,4℃10920×g ,离心15min ,收集上清液,加入1Π5体积的PEG ΠNaCl (200g ΠL PEG 8000,2.5m oL ΠL NaCl ),冰浴30min ,12000r Πmin ,离心15min ,用2m L P BS 重悬沉淀,建立ScFv 噬菌体抗体库,涂板测定抗体库的滴度。1.8 噬菌体抗体库的筛选 健康人A 型红细胞用

?42? 免疫学杂志 第22卷

P BS洗涤3次,取200μL细胞悬液(5×106m L-1)与2m L噬菌体抗体库混匀,4℃水浴30min,1500rΠmin,离心10min,细胞沉淀用P BS洗涤4次,加入200μL 去离子水裂解细胞后,感染10m L新鲜制备的E. coli TG1,37℃水浴15min,分别取菌液0.1、1、10μL 涂2×Y T2G A平板,测定菌落形成单位(CFU),其余菌液加Am p至100μgΠm L,37℃培养2h,加入1012 PFU M13K O7援救,室温4000rΠmin,离心15min,沉淀重悬于300m L2×Y T2AK,30℃过夜振荡培养,噬菌体的浓缩沉淀均按1.7步骤进行,所得噬菌体抗体即为次级噬菌体抗体库,可用于下一轮筛选。滴定次级噬菌体抗体库的滴度,并计算每一轮筛选噬菌体投入Π产出比(回收率)作为特异性噬菌体抗体富集的指标,重复上述步骤4次。

1.9 特异性噬菌体抗体的初步鉴定 随机挑取第四轮富集的克隆接种于2×Y T2G A5m L中,培养至对数生长期,加入50μL辅助噬菌体M13K O7援救,室温4000rΠmin,离心15min,收集感染的细胞并重悬于10m L2×Y T2AK中,30℃过夜培养,4℃12000rΠmin,离心15min,收集上清液即为单个克隆的噬菌体抗体,直接用于细胞E LIS A检测。100μgΠμL的多聚左旋赖氨酸100μLΠ孔包被酶标板, 37℃过夜烘干,次日分别加入P BS洗涤重悬的A型、B型、O型红细胞,5×106细胞Π孔,室温静置30min,1m LΠL戊二醛100μLΠ孔室温固定细胞30min,P BS(含1mlΠL T ween220)洗板1次,10gΠL牛血清白蛋白(BS A)200μLΠ孔37℃封闭2h,P BST洗板3次,每孔分别加入100μL单个克隆的噬菌体抗体,室温孵育2h,同时设辅助噬菌体M13K O7为阴性对照,抗A鼠单抗为阳性对照,P BST洗板5次,阴性对照及检测孔加入HRP2羊抗M13抗体(1∶4000稀释)100μLΠ孔,阳性对照加入HRP2羊抗鼠抗体(1∶2000稀释)100μLΠ孔,37℃1h,P BST洗板8次, ABTS显色后测A415nm值。

1.10 抗人红细胞活性检测 A型、B型、O型红细胞经P BS洗涤后,调整细胞数为4.5×107m L-1,取50μL红细胞悬液与上述鉴定为阳性的100μL噬菌体抗体上清于玻璃试管中,混匀,37℃作用30min, P BS洗涤3次,加入100μL羊抗M13抗体(1∶1000稀释),37℃作用20min,观察凝集结果。

2 结果

2.1 EB病毒转化 转化成功的淋巴细胞,体积明显增大,圆形或类圆形,光学显微镜下可见细胞层中有散在的成团细胞生长(图1)。部分细胞培养上清液与A型红细胞盐水悬液凝集结果为阳性,与B 型、O型红细胞盐水悬液凝集结果分别为阴性和弱凝集,表明增殖的转化细胞中含有分泌抗A抗体的B淋巴细胞

EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

图1 E BV转化的B淋巴细胞镜下形态(×200)

Fig1 E BV2trans formed B lym phocytes(×200)

2.2 细胞总RNA的鉴定 从上述血凝实验为阳性的转化细胞中提取总RNA,电泳后呈明显的3条带,即28S rRNA,18S rRNA和5S rRNA(图2)。A

260nmΠA280nm的比值为2.2~2.3,说明提取的总RNA完整且纯度好

EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

1-4) T otal RNA

图2 从E BV转化的B淋巴细胞提取的总RNA

Fig2 E lectrophoresis of total RNA from E BV2trans formed

B lym phocytes

2.3 scFv基因扩增产物的鉴定 以cDNA第一链

为模板,扩增出3组V

H2C H1基因,3组Vκ2Cκ种基因,分子大小约为700bp。以上述产物为模板,进行半

巢式PCR,扩增出3组V

H基因和6组Vκ基因,分子大小约为400bp。V

H和Vκ经S OE,拼接成ScFv基因,分子大小约为800bp,与理论估计值大小一致。

2.4 重组噬菌体质粒的酶切鉴定及PCR验证 随机挑取10个转化的单菌落提取质粒,琼脂糖凝胶电泳显示其中9个转化子含有ScFv基因,ScFv基因的插入率为0.90。以这些质粒为模板,使用ScFv两端混合引物进行PCR扩增,均有约800bp的目的条带出现;对这些质粒进行双酶切,也见有约800bp的外源插入片段(图3)。

2.5 噬菌体抗体库的建立 ScFv2载体转化E.coli TG1后,铺板测定其库容为1.2×106。重组噬菌体加入M13K O7援救后,得到滴度为 2.52×1010PFUΠm L的初级噬菌体抗体库。

2.6 噬菌体抗体库的筛选及初步鉴定 使用完整A型红细胞对该库进行4轮“吸附2洗脱2扩增”的筛选,洗脱的噬菌体滴度呈明显的增加趋势,噬菌

?

5

2

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第1期 岳建华,等1E BV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

1) DNA ladder marker 100bp ;2) PCR prodct of pCANT AB5E 2scFv ;

3) pCANT AB5E 2scFv Sfi Ⅰ+Not Ⅰ;4) DNA ladder marker 15000bp

图3 重组质粒的双酶切鉴定及PCR 验证Fig 3 Identification of recombinant phagemid by restriction endonuclease digestion and PCR

体抗体得到约20倍的富集。随机挑取第4轮筛选产物56个克隆,制备单个克隆噬菌体抗体。分别以A 型、B 型、O 型完整红细胞为抗原,细胞E LIS A 检测56株噬菌体抗体的抗原结合活性显示,其中有2株与A 型红细胞具有较高的结合活性,而与B 型、O 型红细胞结合活性很低(图4)。这2株噬菌体抗体上清与A 型红细胞呈现凝集反应,与B 型、O 型红细胞无凝集活性

EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

M13K O7was negative control ;clones 1and 2were phage antibodies specific for A RBC ;anti 2A m Abs was positive control

图4 筛选的阳性克隆

Fig 4 Selection of phage antibodies specific for the A

antigens on red blood cells

3 讨论

人体内存在的ABO 血型抗体通常为天然抗体[9]

。本实验所用的B 型全血标本经鉴定均含有高效价的抗A 抗体,采用E B 病毒转化方法,通过病毒表面蛋白gp350Π220与细胞表面的补体受体(CR2Π

C D21)结合而进入被感染的细胞[10,11]

,使B 淋巴细胞增殖并在体外连续传代。红细胞凝集实验表明,分泌抗A 抗体的B 淋巴细胞已得到增殖。

通过噬菌体抗体库技术使抗体基因克隆化,设计两次PCR 引物扩增抗体可变区基因,不仅容易获得目的片段,还可以增加产物的特异性,即先扩增V H 2C H 1和V κ2C κ,再以其为模板扩增V H 和V κ基因。应用简并引物以期尽可能地扩增出多样的抗体基

因[12]

,并在重链可变区基因的羧基端和轻链可变区

基因的氨基端加上编码连接肽(G ly 4Ser )3序列,通过S OE 直接将V H 和V κ基因拼接成scFv ,减少一次重组过程,操作较为方便。由于该抗体主要为IgM 类,故使用IgM 重链可变区引物扩增V H 。细胞E LIS A 及血凝实验结果显示,2株scFv 噬菌体抗体与A 型红细胞可特异结合。

本实验运用E B 病毒转化方法和噬菌体抗体库

技术构建了库容量为1.2×106

,滴度为2.52×1010

PFU Πm L 的初级噬菌体抗体库,为下一步对所获克隆株进行序列分析、可溶性抗体表达及纯化奠定了基础。

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(编辑 金晓琳)

?62? 免疫学杂志 第22卷