脯氨酸的提取及定量
脯氨酸（Pro）含量的提取和测定脯氨酸在植物体内起到很重要的渗透调节作用。当植物体处在逆境的环境（如干旱、冷害、高温、盐渍、病害等）中时，植物体内游离的脯氨酸的含量会出现
明显的升高。植物体内的脯氨酸的作用主要有两种，一种是调节植物体内的渗透压，使植物体不易失水；另一种则是与细胞内的蛋白质相互作用，共同维持细胞膜蛋白的稳定性。在逆境条件下，植物体内的脯氨酸的含量越高，植物体维持体内渗透压和膜蛋白稳定的能力就越强，也就是说植物体的抗性就越强。植物体内的脯氨酸比较容易溶于磺酸水杨酸的水溶液中，实验室一般选用3%的磺酸水杨酸溶液提取植物体内的脯氨酸。在弱酸性条件下，脯氨酸可以与茚三酮发生反应生成黄色物质，但是在强酸性条件下，则会生成红色物质，这种红色物质可以用甲苯萃取，并且在520nm处有最大的吸光值。
（1）绘制脯氨酸的标准曲线
配制浓度10mg/ml的脯氨酸溶液，然后稀释成10-9～1m g/ml的十个浓度梯度的标准液。各取2ml加入已经编号的试管中，然后每只试管分别加入加入2ml3%的磺酸水杨酸溶液、2ml冰醋酸和4ml 2.5%的酸性茚三酮溶液（现配现用），混匀，在沸水浴中显色60min。待试管冷却后每只试管中加入4ml的甲苯，充分摇匀后，红色物质存在于上层甲苯相中。取甲苯相测定520nm出的吸光值，并用甲苯做空白对照，根据脯氨酸的含量的对数和相应的光吸收值绘制出脯氨酸含量的标准曲线。
(2)取0.1g植物组织，剪碎放置于一个2mlEP管中，加入200ul 3%的磺酸水杨酸溶液，研磨10min至材料充分磨碎。
(3)再加入800ul的3%的磺酸水杨酸溶液，混匀。
(4)将材料放在沸水浴中浸提10分钟。
(5)等材料完全冷却后，3000rpm/min室温离心10分钟，上清液即为含有脯氨酸待
测液。
(6)在一个2ml的EP管中加入200ul的上清液，然后再加入200ul的水、200ul 的冰乙酸和400ul的2.5%的酸性茚三酮溶液[将1.25g茚三酮溶于30ml冰乙酸和20ml 6mol/L磷酸混合溶液中，搅拌加热（70℃）溶解，仅在24小时内稳定]，混匀，在沸水浴显色60分钟。待溶液冷却后，加入400ul甲苯，充分摇匀，红色物质存在于甲苯相中，取红色的甲苯相测其在520nm处的吸光值。并根据绘制的脯氨酸标准曲线计算脯氨酸的含量。
羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒说明书 可见分光光度法
羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC0250 规格：50T/48S 产品内容： O（V/V）=1:1，室温保存。 提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 试剂一：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：液体1mL×1支，0.5mg/mL羟脯氨酸标准品，4℃保存。 产品说明： HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 样品经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。 自备实验用品及仪器： 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、6mol/L盐酸和蒸馏水。操作步骤： 一、羟脯氨酸提取 1.组织：称取约0.5g样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入5mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/LNaOH（约3mL）调节pH值至6～8范围内。蒸馏水定容至8mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质） 2.细胞：取500万个细胞，加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至透明状，16000rpm， 第1页共3页
乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定——L(-)-羟脯氨酸含量测定法
乳与乳制品中 动物水解蛋白鉴定 乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定 法 —L(-)-羟脯氨酸含量测定 羟脯氨酸含量测定法 1主题内容与适用范围 本方法规定了乳与乳制品制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定方法。 本方法适用于乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定。 本方法通过对L(-)-羟脯氨酸含量的测定，可判定是否为动物水解蛋白。 2 引用标准 ) --羟脯氨酸含量测定 L(--) GB9695.23-90 肉与肉制品L( 3 原理 试样经酸水解,释放出羟脯氨酸。经氯胺T氧化,生成含有吡咯环的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺T。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。 4 试剂 所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水或同等纯度的水。 4.1 氯化亚锡(GB638):0.75％溶液。 将氯化亚锡7.5g溶于500mL水中,再加入500ml浓盐酸(GB 622)。 4.2 盐酸(GB622):6mol/L溶液。 4.3 氢氧化钠(GB629);1mol/L、10mol/L溶液。 4.4 缓冲液:将50g柠檬酸,26.3g氢氧化钠和146.1g结晶乙酸钠(GB694)溶于水,稀至1L,此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。 4.5 氯胺T(HG3-972)溶液:将1.41g氯胺T,溶于10mL水中,依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。 4.6 显色剂:称取10g对二甲氨基苯甲醛,用35mL高氯酸(GB623)溶解,缓慢加入65mL异丙醇。 4.7 L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。 4.7.1 标准储备液500μg/mL:称取50.0mg/L(-)-羟脯氨酸用少量水溶解,加一滴6mol/L盐酸,定容至100mL容量瓶中。 4.7.2 标准工作液5μg/mL:吸取标准储备液 5.00mL于500mL容量瓶中,定容。 5 仪器和设备
脯氨酸含量的测定
脯氨酸含量的测定 在逆境条件下，植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸含量增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 一、原理 当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即为红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 待测植物叶片 （二）仪器设备 1. 722型分光光度计； 2.研钵； 3.100ml小烧杯； 4.容量瓶； 5.大试管； 6.普通试管； 7.移液管； 8.注射器； 9.水浴锅； 10.漏斗； 11.漏斗架； 12.滤纸； 13.剪刀。 （三）试剂 1.酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/l 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 2.3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 3.冰醋酸。 4.甲苯。 三、实验步骤 1.标准曲线的绘制 （1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯中内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。 （2）系列脯氨酸浓度的配置：取6个50ml容量瓶，分别加入脯氨酸原液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml。 （3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。 （4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶
高效液相色谱法测定甲硝唑的含量
实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含 量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。 三、实验内容 （一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。 （二）实验内容 1、色谱操作条件的制定： 色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）； 流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制 精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立 （1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤
羟脯氨酸检测试剂盒说明书
货号: QS1907 规格：50管/48样羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义 HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 测定原理 样品经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP 含量。 自备实验用品及仪器 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、6mol/L盐酸、高氯酸和蒸馏水。 试剂组成和配制 O（V/V）= 1:1，室温保存。 组织提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 细胞提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 羟脯氨酸提取 1.组织：称取约0.5g样品于玻璃管，加入5mL的组织提取液，置于110℃烘箱，水解6至12 小时，12000g，25℃，离心20min，用提取液定容至5mL，取上清待测。 2.细胞：取500万个细胞，加入2mL的细胞提取液，于高压消毒器中15磅保持30min，自然 降压后待测。 3.血清等液体：直接测定。 羟脯氨酸含量计算公式 标准曲线：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991 （1）按组织计算 第1页，共2页
HYP含量（mg/g 鲜重）=（A -0.0251）÷ 64.875×V反总÷(V样÷V样总×W) 560 -0.0251）÷W = 0.385×（A 560 （2）按细胞计算 HYP含量（mg/104cell）=（A -0.0251）÷64.875×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个) 560 -0.0251）÷细胞数量（万个） = 0.154×（A 560 （3）按液体体积计算 HYP含量（mg/mL）=（A -0.0251）÷ 64.875×V反总÷V样 560 -0.0251） = 0.077×（A 560 V反总：反应总体积，1mL；V样：反应中样品体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积， mL；W：样品质量，g 注意事项 1、OD值大于0.8，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。 2、试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。 3、最低检出限为3.8mg/L。 第2页，共2页
脯氨酸的检测方法
脯氨酸的检测方法 1. 原理 样品用茚三酮处理，样品中的脯氨酸反应生成橙色物质，在520nm 检测吸光度，并作空白对照实验。 2. 应用范围 本方法适用于蜂蜜、果汁和浓缩汁中的脯氨酸的检测。本方法在其它方面的应用必须经过个别论证。 3. 试剂及仪器 3.1 脯氨酸 3.2 3%茚三酮2-甲氧基乙醇溶液（0.3g 茚三酮溶解于10ml 2-甲氧基乙醇，每天保持新鲜，即现用现配） 3.3 2-甲氧基乙醇 3.4 蚁酸（96%），即甲酸 3.5 异丙醇（2- 丙醇）水溶液：水：丙醇= 1：1 3.6 15ml 旋盖玻璃离心管（确保离心管的边缘没有缺口，将有缺口的离心管丢掉） 3.7 分光光度计，检测吸光度设定在520nm 下 3.8 1cm 玻璃比色皿 4. 样品准备 4.1苹果，梨和大部分浆果的果汁用单一浓度（即原果汁浓度），橙汁用1：20 的水进行 稀释。其它的果汁应进行适当的稀释，以保证稀释后的样品中的脯氨酸的含量低于50mg/L（见稀释表）。浓缩果汁用水稀释到单一浓度，然后再进一步进行适当的稀释。蜂蜜的稀释，采用2.5g蜂蜜加50ml水。 将样品在分析之前离心5min 左右，去除悬浮物，取上清液进行分析。 4.2 原果汁稀释表 稀释比例 颜色空白期望值样品类型 Apple 苹果1:1 yes Apricot 杏21:1 yes Aronia 野樱莓1:1 yes Banana 香蕉1:1 yes Blackberry 黑莓1:1 yes Cherry 樱桃1:1 yes Cranberry 蔓越莓1:1 yes Grape 葡萄16:1 yes Grapefruit 柚子21:1 no Guava 番石榴3:1 yes Kiwi 泥猴桃1:1 yes
高效液相色谱法测定氨基酸
脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案 1、仪器与试药 1.1 仪器 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国） 1.2 药品与试剂 16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。 脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。批号：2013、2013、2013. 乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。2、方法与结果 2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。
时间 (min) 流速 (ml/min) % A % B 曲线 起始 1.0 100 0 * 0.5 1.0 98 2 6 15.0 1.0 93 7 6 19.0 1.0 90 10 6 32.0 1.0 65 35 6 33.0 1.0 65 35 6 34.0 1.0 0 100 6 37.0 1.0 0 100 6 38.0 1.0 100 0 6 42.0 1.0 100 0 6 2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表 所示的混合溶液。 名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）门冬氨酸 4.80 苏氨酸 1.20 异亮氨酸 1.10 丝氨酸 2.60 丙氨酸 2.50 亮氨酸 2.70 谷氨酸 6.20 脯氨酸 2.00 苯丙氨酸 1.20 甘氨酸 2.40 缬氨酸 1.60 色氨酸0.40 组氨酸0.90 甲硫氨酸 1.00 精氨酸 1.20 赖氨酸 3.45 取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。 衍生剂配制将水浴锅设置55℃，加热，待温度稳定, 取AccQFluor衍生剂2A，轻轻弹击,确保AccQFluor 衍生剂2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀释剂2B 1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor 衍生稀释剂2B 1ml，加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中，振荡10秒钟，在恒温水浴锅中溶解，保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。 2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸
原料中羟脯氨酸含量的测定
原料中羟脯氨酸含量的测定 1.材料和试剂 1.1材料 秦宝雪花牛牛蹄筋：陕西秦宝牧业有限责任公司。 秦宝普通育肥牛、雪花牛肺：陕西秦宝牧业有限责任公司。 秦宝雪花牛棒骨：陕西秦宝牧业有限责任公司。 1.2试剂 所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水，或相同浓度的水。 1.2.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L] 量取750mL水于2L的容量瓶中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。冷却至室温后用水定容。 1.2.3缓冲溶液（PH=6.8） 包括下列组分： a）26.0g一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）； b）14.0g氢氧化钠； c）78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。 用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL 正丙醇，用水定容。该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。 1.2.4氯胺T溶液 称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL 缓冲溶液溶解。临用前配制。 1.2.5显色剂 称取10.0g对甲氨基苯甲醛，用30mL高氯酸溶液[70%（质量分数）]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。临用前配制。 1.3羟脯氨酸标准溶液 1.3.1标准储备液 称取50mg4-羟基-α-吡咯甲酸（羟脯氨酸）于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（1.2.1），用水定容。该溶液于4℃下可稳定存放1个月。 1.3.2标准工作液 移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。分
别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度一次为0.5μg/mL、1.0μg/mL、 1.5μg/mL、 2.0μg/mL。临用前配制。 2.仪器和设备 3.试样制备 用刀将原料在冷冻时（0℃以下）切成小块（约0.5cm3，边长约为8mm）。将切好的试样装入密封样品盒中，或用耐热塑料袋真空包装，70℃以上保温30min后，冷却。用绞肉机将试样均质。将试样装入密封的容器里，防止变质和成分变化。试样应在均质化后24h内尽快分析。 4.分析步骤 4.1试样 称取4g试样（精确至0.001g）于烧杯中，避免试样粘在烧杯壁上。 4.2水解 4.2.1量取30mL±1mL硫酸溶液，加入烧杯中，用培养皿盖住，于105℃干燥箱内恒温16h。 4.2.2趁热将水解产物转移至250mL容量瓶中。用10mL硫酸溶液分三次洗涤烧杯，合并至上述容量瓶中。用水定容，摇匀。然后将其过滤至三角瓶中。 4.3测定 4.3.1用移液管移取5mL的上述滤液至250mL容量瓶中。 4.3.2移取4.00mL上述溶液于比色管中，加入2.00mL氯胺T试剂，混合后于室温下放置20min±1min。 4.3.3加入2.00mL显色剂于比色管中，充分混合，用塞子将比色管封
脯氨酸
实验四十三植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、目的 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 二、原理 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：植物叶片。 2. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。 3 .试剂及配制： 2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。 冰醋酸；甲苯。 四、实验步骤 1.脯氨酸标准曲线的制作 1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。 加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯
高效液相色谱（HPLC ）法测定邻苯二甲酸酯 一、实验目的： 1. 了解高效液相色谱仪原理； 2. 学习高效液相色谱仪的基本操作方法； 3. 利用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸酯、邻苯二乙酸酯、邻苯二丁酸酯的峰图和含量。 二、实验原理： ① 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC ）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： R ＝ 2[t (R2)-t (R1)] /1.7*(W 1＋W 2) //式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间；t (R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1 及W 2为此相邻两峰的半峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。 ② 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE ，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。 但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。同时也有一定的致癌作用。 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC 分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul 微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用） ，高纯水，样品。 出峰次序 样品组成 1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP ） 2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)
植物组织游离脯氨酸含量的测定实验报告精华版
实验报告 一、实验目的： 了解植物体内水分亏缺与脯氨酸积累的关系 二、实验所用仪器、药品、材料： 1.仪器 分光光度计,水浴锅,漏斗,大试管（20ml）,具塞刻度试管（20ml）,注射器或滴管（5-10ml）。 2.材料 植物小麦叶片 3.试剂 （1）3%磺基水杨酸 （2）甲苯 （3）2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol·l-1磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2-3天有效 （4）脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg·ml-1。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg·ml-1的脯氨酸标准溶液。 三、实验步骤： 1、标准曲线的绘制： （1）取7支具塞刻度试管按表9.2-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。 （2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色。 （3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。
表9．2．1各试管中试剂加入量 2、待测物的提取、显色、比色等测定的数据记录： 3、计算结果： 从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度 脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)] =(C．V)·(A·W)－1 式中：C一提取液中脯氨酸浓度(PS)，由标准曲线求得： V －提取液总体积（ml） A --- 测定时所吸取得体积（ml）
W----- 样品重（g） 脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)] =(C．V)·(A·W)－1= 四、实验小结：（本次实验成败之处和原因分析以及改进措施） 1.配置的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此最好现用现配。 2.测定样品若进行过渗透胁迫处理，结果会更显著。 3.试剂添加次序不能出错。
羟脯氨酸的测定方法
1羟脯氨酸含量测定 2羟脯氨酸标准曲线绘制 3试剂的配制【6-7】 [6] 李秋营,姚汝琳.细胞中羟脯氨酸的测定.山西医科大学学报.2001,32(6):558-559 [7] David J Etherington, Trevor J Sims. Detection and Estimation of Collagen[J]. J Sci Food Agric, 1981,32:539-546 柠檬酸缓冲液：柠檬酸钠120g、冰醋酸12mL、柠檬酸46g、氢氧化钠34g 溶解于蒸馏水中，调整pH 值至6.0，然后定容至1000mL。 0.05mol/L 氯胺T 溶液：称取氯胺T 7.05g，溶解于100mL 蒸馏水中，然后加入乙二醇独甲醚150mL，再加入250mL 柠檬酸缓冲液混合均匀。 对二甲基氨基苯甲醛: 试剂 A：取无水乙醇20mL，慢慢加入浓硫酸2.74mL；试剂B：取对二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入无水乙醇40mL，水浴加热使其完全溶解并冷却至室温，然后将A 液慢慢加入B，混合均匀。 3.5mol/L 高氯酸溶液：取27mL 高氯酸，以蒸馏水定容到100mL。 羟脯氨酸标准曲线的绘制羟脯氨酸标准储存液：准确称取L-羟基脯氨酸标准品50mg，加入0.01mol/L 盐酸中溶解，稀释并定容到100mL，在冰箱中保存。 羟脯氨酸标准工作液：吸取羟脯氨酸标准储存液10mL到50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到50mL(临用前配)，浓度为100μg/mL。 4标准曲线绘制 分别吸取羟脯氨酸标准工作液1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，用蒸馏水定容到50mL容量瓶中。以蒸馏水为空白，分别吸取上述标准液1mL，加入1mL 柠檬酸缓冲液和1mL 0.05mol/L 氯胺T 溶液，室温(25 ℃) 氧化10min 后，加入高氯酸1mL(3.5mol/L)，放置10min，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂1mL，在65℃水浴显色10min，冷却后在560nm处测吸光度。以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程。 浓度μg/mL0.50 1.00 1.25 1,50 1,75 2.00 2.25 0.612 吸光度A560 0.134 0.284 0.347 0.409 0.477 0.55 6样品水解将样品反复绞碎，充分混合。称取5.000g样品放入250ml三角瓶中，加
羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒说明书 微量法
羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC0255 规格：100T/96S 产品内容： O（V/V）=1:1，室温保存。 提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 试剂一：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：0.5mL×1支，0.5mg/mL羟脯氨酸标准品，4℃保存。 产品说明： HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。 自备实验用品及仪器： 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。 操作步骤： 一、羟脯氨酸提取： 1、组织：称取约0.2g样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入2mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/L NaOH（约1mL）调节pH值至6～8范围内。蒸馏水定容至4mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质） 2.细胞：取500万个细胞，加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至透明状，16000rpm，
脯氨酸(Pro)含量测定试剂盒使用说明
脯氨酸（Pro）含量测定试剂盒使用说明 分光光度法50T/48S 货号：BC0290 测定意义： 脯氨酸(Pro)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro 含量显著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。 测定原理： 用磺基水杨酸（SA）提取Pro，加热处理后，Pro与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰乙酸、甲苯、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：冰乙酸4℃保存。（自备） 试剂二：液体45mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：甲苯4℃保存。（自备） 标准品：脯氨酸10mg，4℃保存。
样品测定的准备： 1、细胞、细菌或组织样品的制备： 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清；按照每100万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），之后置沸水浴振荡提取10min；10000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。 组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；之后置沸水浴振荡提取10min，10000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。 2、血清（浆）样品：取100μL血清（浆）加入1mL提取液，充分混匀，之后置沸水浴振荡提取10分钟，10000g，常温离心10分钟，取上清，冷却后待测。 3、标准品的处理:称取1mg，将标准品稀释为15、10、8、6、 4、2、1、0g/ml。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。 2、取0.5mL上清液（或稀释后的标准品）+0.5mL试剂一+0.5mL试剂二于有盖试管中，置沸水浴中保温30min（盖紧，防止水分散失），每10min振荡一次。 3、待冷却后，在试管中加入1mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8mL-1mL上层溶液于1mL玻璃比色皿中，用试剂三调零，于520nm波长处比色，记录吸光值。 4、根据标准品吸光值和浓度，建立标准曲线。 Pro含量计算： 1、通过标准曲线计算样品脯氨酸含量(y为脯氨酸含量，μg/mL；x为OD值)
高效液相色谱法测定有机化合物的含量
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。
脯氨酸检测方法
试验目的：在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性， 抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 一、原理 用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中， 色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查 出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。 （二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶； 5. 大试管； 6. 普通试管； 7. 移液管； 8. 注射器； 9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。 （三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。 三、实验步骤 1. 标准曲线的绘制
（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。 （2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。 （3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml 酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。 （4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。 （5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。 （6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。 2. 样品的测定 （1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性
最新高效液相色谱法测定维生素C
高效液相色谱法测定维生素C的含量 【摘要】高效液相色谱法已经成为解决生命科学、医药学发展中各种难题的重要手段，在实验室中也广泛应用于物质的定性定量分析。本实验中利用高效液相色谱法对维生素C进行定量分析，所采用的定量分析方法为外标法，通过做出标准溶液浓度与峰面积的标准曲线进而对样品中的维生素C进行定量检测。 【关键词】高效液相色谱法、维生素C、含量 1、引言 维生素 C（Vitamin C, Vc）又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素。Vc 在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。人体内缺乏 Vc 时容易导致坏血病。同时，由于 Vc 是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。Vc 在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中 Vc 含量在 50-300 mg/100 g。 溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）。HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。 2、HPLC测定维生素C的含量 2.1、仪器试剂 2.1.1、仪器 高效液相色谱仪（Agilent1260），色谱柱：C18 柱 (250 mm×4.6 mm, I.D.5 μm)；平头进样器。 2.1.2、试剂 乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素 C，磷酸二氢钾等均为分析纯，实验用水为超纯水。
脯氨酸含量的测定
植物组织游离脯氨酸含量的测定 （一）实验原理 植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。 采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520 nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 （二）实验材料、仪器设备及试剂 1 材料 植物叶片 2 仪器设备 分光光度计，恒温水浴锅，漏斗，具塞刻度试管(20 ml) ，移液枪（1 ml和5 ml），5 ml 和1 ml刻度试管，烧杯，吸水纸，玻璃棒，试管架，比色皿等。 3 试剂 (1) 3％磺基水杨酸溶液：万分之一电子天平称取3 g磺基水杨酸，然后将称好药品溶于100 ml蒸馏水中。 (2) 甲苯 (3) 2.5％酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6 mol L-l磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3天有效（此步骤重要）。称取1.25 g茚三酮放入烧杯中用混合液50 ml 放入70℃水浴锅中溶解，冷却。 (4) 脯氨酸标准溶液：准确称取25 mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250 ml，其浓度为100 ug/ml。再取此液10 ml，用蒸馏水稀释至100 ml，即成10 ug/ml的脯氨酸标准液。 三．实验方法 1 标准曲线制作 （1）取7支具塞刻度试管按表2加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40 min。 试管号 0 1 2 3 4 5 6 脯氨酸标准溶液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2 /ml 水/ml 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0 冰乙酸/ml 2 2 2 2 2 2 2 茚三酮显色液 3 3 3 3 3 3 3 /ml 脯氨酸含量/μg 0 2 4 8 12 16 20 （2）取出冷却后向各管加入5 ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520 nm下比色。
高效液相色谱法测定水样中的苯酚
实验三高效液相色谱法测定水样中的苯酚 一、实验目的 1.1熟悉HPLC仪器的各个部件及熟悉操作方法； 1.2掌握应用高效液相色谱法对苯酚的定性、定量分析； 1.3掌握水样中苯酚的测定。 二、实验原理 HPLC原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。特点 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～ 350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 高效液相色谱仪一般分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还可以根据一些特殊的要求配备一些附属装置，如梯度洗脱、自动进样及数据处理装置等，如图1所示。