黄曲霉毒素b1试剂盒说明书1

黄曲霉毒素B1检测试剂盒使用说明书

产品名称

通用名称：黄曲霉毒素B1检测试剂盒

英文名称：ELISA Kit to Detect Aflatoxin B1

产品编号：TH025-1

概要

黄曲霉毒素是由黄曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物，主要污染玉米、花生、坚果等。天然污染的黄曲霉毒素以黄曲霉毒素B1为主，黄曲霉毒素B1具有极强的急性毒性和致癌性，肝脏是其主要的靶器官。本试剂盒是以应用单克隆抗体为基础的ELISA检测方法，适用于定量检测饲料和谷物中的黄曲霉素B1。

包装规格

96T/盒。

预期用途

检测饲料和谷物中存在的黄曲霉毒素B1。

测定原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的黄曲霉毒素B1和微孔条上预包被的偶联抗原特异性竞争抗黄曲霉毒素B1抗体，加入酶结合物后，用底物液显色，样品中的黄曲霉毒素B1含量与样品的吸光度值呈反比。检测时设置标准曲线，通过标准曲线测定样品中黄曲霉毒素B1的含量。

反应时间

样品处理时间：

饲料……………………………………………25分钟

试剂盒反应时间………………………………75分钟

产品组成

1、黄曲霉毒素B1酶标板：96孔

2、黄曲霉毒素B1标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是：0ppb，0.025ppb，0.075ppb，0.225ppb，0.675ppb，2.025ppb

3、黄曲霉毒素B1标准品（添加实验）：1瓶（1ml），50ppb

4、黄曲霉毒素B1抗体工作液：1瓶（7ml），直接使用

5、黄曲霉毒素B1酶结合物：1瓶（7ml），直接使用

6、底物液A：1瓶（7ml），过氧化脲

7、底物液B：1瓶（7ml），四甲基联苯胺

8、终止液：1瓶（7ml），2M硫酸

9、10×浓缩洗涤液：1瓶（50ml），用于洗板

9、说明书一份

10、质检报告一份

11、盖板膜一张使用单位需自备的设备及试剂

设备：

┅┅微孔板酶标仪

┅┅粉碎仪

┅┅振荡器

┅┅量筒

┅┅离心机

┅┅电子天平

┅┅微量移液器：单道20μl ~200μl、100μl~1000μl

多道50μl~300μl

试剂：

┅┅无水甲醇（分析纯）

┅┅去离子水

溶液配制

1)70%甲醇溶液：

取70ml无水甲醇，加入30ml去离子水溶解混匀。

2) 35%甲醇溶液：

取35ml无水甲醇，加入65ml去离子水溶解混匀。

3) 1×洗涤工作液：

取50ml 10×浓缩洗涤液，加去离子水450ml，混匀。可在2-8℃保存三个月。

待测样品前处理方法

饲料（辅料、配合料和浓缩料）(稀释系数为20)：

1) 称取1.0±0.05g粉碎饲料样本于50ml离心管中；

2) 加入10ml 70%甲醇，振荡5分钟（振荡一定要充分）；

3) 5000g离心10分钟；

4) 取1ml上清于5ml离心管中，再加入1ml去离子水振荡混匀；

5) 取50μl用于检测分析。

注：样品检测浓度过高时，请再次用35%甲醇稀释，稀释倍数相应改变。

注意事项

1) 使用前将试剂盒回升至室温（20-25℃）。

2) 严格按说明书操作，不得改变加样顺序及温育时间，每加一种试剂前需将其摇匀。

3) 尽量缩短加样时间，加入相同试剂或样品时应使用多道微量移液器。

4) 洗板应保持一致性，不可更改冲洗次数。洗涤后，避免微孔干燥，否则可能会造成标准曲线不成线性或重复性不好的现象。

5) 若底物液B有任何颜色表明其变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂盒可能变质。

6) 若酶标板底部被污染，则在读数之前用软纸轻轻擦试微孔板底部，防止因污染而影响读数结果。

7) 在所有恒温孵育过程中，要避免光线照射，应用盖板膜盖住微孔板。

8) 没有用完的微孔板应存放回有干燥剂的密封袋内，2-8℃密封干燥保存，试剂盒避免冷冻。

9) 不要使用过期的试剂盒及各组份，不要同时使用不同批号试剂盒中的试剂。

酶免分析步骤

1、将标准品和样品对应的微孔编号，每个标准品和样品做双孔平行，并记录标准品和样品的位置。

2、在标准品孔中加入50μl各标准品溶液，在各样品孔中加入50μl样品溶液。

3、在所有孔中加入50μl的酶结合物，再在所有孔中加50μl抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，25℃环境中避光反应30分钟。

4、小心揭开盖板膜，甩干孔中液体，用稀释好的洗涤液（250μl/孔）充分洗涤微孔板5次，在吸水纸上拍干（拍干后未清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

5、洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50μl底物液A，再加50μl底物液B，轻微晃动反应板使之彻底混匀，25℃环境避光显色15分钟(在颜色浅的情况下可适当延长反应时间，但总显色时间不要超过30分钟)。

6、每孔中加入50μl终止液，轻轻晃动使之彻底混匀，在450nm（建议使用双波长450/630nm）下检测吸光度，结果在5分钟内读取。

结果计算

1、所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

2、以黄曲霉毒素B1浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为黄曲霉毒素B1浓度的对数值，求得反对数即为测定液中黄曲霉毒素B1浓度C（ng/ml）。样品经过稀释时应乘以相应稀释系数。

样品检测下限

本试剂盒的最低检测灵敏度是0.025ppb(0.025ng/ml、0.025μg/l或0.025μg/kg)。

交叉反应（特异性）

黄曲霉毒素B1…………………………… 100%

样品最低检测限

饲料…………………………………………0.5ppb

准确度（回收率）

饲料…………………………………………90±15％

精密度

试剂盒板内变异系数小于8%，板间变异系数小于10%。

贮藏条件及保存期

产品保存于2-8℃，自生产日期起12个月内有效。