分子生物学常用实验技术及方法
第二章 常用实验技术及方法
一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)
反应总体积为50 μl ，其中含有：
模板DNA 0.5 μl
PCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 μl
10×MgCl 2 溶液 5 μl
dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 μl
引物1 (50 umol/L) 0.5 μl
引物2 (50 umol/L) 0.5 μl
Taq DNA 聚合酶 0.5 μl
无菌去离子水加至 50 μl
上层用25 μl 液体石蜡油覆盖。
循环参数为： 94 ℃变性10 min
94 ℃变性1 min
56 ℃退火1 min
72 ℃延伸2 min
共30个循取环，PCR 结束后，取2 μl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。
二、基于PCR 技术的定点突变
1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下
游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；
2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA 片段1，用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR 扩增DNA 片段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA 片段1和
DNA
片段2；
3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 μl：
片段1 1 μl
片段2 1 μl
10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 μl
10×MgCl2溶液 5 μl
dNTP (2.5 mmol/L) 5 μl
Taq酶 1 μl
加ddH2O至50 μl
在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；
4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突
变的正确性。
三、Total RNA的提取(Catrimox-14TM
RNA Isolation Kit Ver. 2.11)
1. 吸弃培养细胞中的旧培养基，用PBS洗涤1-2次后，加入1 ml的Catrimox-14
TM 溶液，然后充分混匀；
2. 收集细胞裂解液，按以下条件进行离心：
细胞数<5×105
：9500 rpm (约5 000×g) 5 min
细胞数5×105
- 1×10
7
：3000 rpm (约450×g) 5 min
细胞数>1×107
：1500 rpm (约112.5×g) 5 min
3. 除去上层溶液，加入1 ml的DEPC处理的H2O，上下颠倒混合数次后，12000
rpm离心2 min；
4. 吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动；
5. 向Microtube中加入1 ml的2 M LiCl溶液；
6. 激烈振荡后，室温下12000 rpm离心5 min，除去溶液；
7. 沉淀用70 %冷乙醇清洗一次；
8. 沉淀经过简单的真空干燥后，溶于适当的缓冲液中。
四、RT-PCR (TaKaRa One Step RNA PCR Kit)
1. 按Takara Kit中所提供的标准步骤配制PCR 体系；
2. 按以下条件进行RT-PCR反应
(1) 50 ℃ 30 min
(2) 94 ℃ 2 min
(3) 94 ℃ 1 min
(4) 56 ℃ 1 min
(5) 72 ℃ 2 min
3. 重复步骤(3)-(4)-(5)，共30个循环；
4. 反应结束后，取3-5 μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物冷冻保存。
五、DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳
50×TAE: 242 g Tris 碱
57.1 ml 冰乙酸
100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
1. 称取0.5 g agarose，置于250 ml 锥形瓶中，加入50 ml 1×TAE（含EB 0.5
ug/ml），加热使其全部溶解；
2. 封口、安放梳子；
3. 待凝胶稍凉后铺板；
4. 胶凝固后，放入电泳槽中，倒入1×TAE，淹没胶面，拔去梳子；
5. 将DNA 样品与6×的上样缓冲液混合，加于加样孔中；
6. 80-100V 恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下
观察或拍照。
六、从琼脂糖凝胶上回收DNA 片段（Vitagene DNA 片段回收Kit）
1. 用一灭菌刀片割下含目的DNA 片段的琼脂糖凝胶块，放入Eppendorf管中；
2. 用Vitagene DNA 片段回收Kit，并按照试剂盒提供的步骤回收所要的DNA
片段。
七、DNA 片段的连接反应
1. 总体系为10-20 μl，外源DNA插入片段和载体片段按一定摩尔比混合；
2. 加入1-2 ul 10×Buffer，2 ul T4DNA连接酶，混匀；
3. 12-16 ℃反应过夜。
八、大肠杆菌感受态细胞的制备
1. 挑取单菌落接种于3-5 ml LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜；
2. 取0.5 ml培养物转接种于50 ml LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养约3 h至对
数生长期(OD600 = 0.4-0.6)；
3. 将细菌转移至50 ml 离心管中，冰浴20 min；
4. 于4℃，4200 rpm 离心10 min，弃上清；
5. 用5 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2悬浮菌体，冰浴30 min；
6. 于4 ℃，4200 rpm 离心10 min，弃上清；
7. 用3 ml 0.1 M CaCl2/15%甘油悬浮菌体（动作要轻），每管分装100 μl，立
即使用或置于-70 ℃冰箱保存。
九、大肠杆菌感受态细胞的转化
1. 感受态细胞若保存于-70 ℃冰箱，取出后先在冰上复苏5-10 min；
2. 加入适量DNA 样品，混匀，冰浴30 min；
3. 42 ℃水浴1 min，立即放入冰上冷却2 min；
4. 加入0.5 ml LB 液体培养基，37 ℃振荡培养45 min；
5. 取适量转化的菌体，涂布于含抗生素的LB 平板上，等平板表面的液体被吸
收后，倒置放入37 ℃温箱，培养过夜。
十、大肠杆菌质粒DNA 的小规模制备
(一)、材料：
1. Solution I 葡萄糖50 mM
Tris-HCl (pH8.0) 25 mM
EDTA (pH8.0) 10 mM
2. Solution II NaOH 0.2 M
SDS 1%
3. Solution III 5 M 乙酸钾60 ml
冰乙酸11.5 ml
去离子水28.5 ml
4. TE Buffer (pH8.0) Tris-HCl (pH8.0) 10 mM
EDTA (pH8.0) 1 mM
(二)、方法：
1. 在2 ml含相应抗生素的LB液体培养基中接种单菌落，37 ℃剧烈振摇培养过
夜；
2. 取细菌培养物置于Eppendorf管中，13000 rpm离心30 sec，弃上清；
3. 用100 μl SolutionⅠ重悬菌体沉淀，冰浴2-3 min；
4. 加200 μl新鲜配制的SolutionⅡ，颠倒Epp管数次以充分混匀，室温放置2
min；
5. 加150 μl用冰预冷的Solution Ⅲ，温和振荡数次，冰浴3-5 min；
6. 13000 rpm离心5 min，将上清转移至一新Epp管中；
7. 加等体积异丙醇振荡混匀，室温5 min；
8. 13000 rpm离心5 min，弃上清，并用200 ul去离子水溶解沉淀；
9. 加100 ul 7.5 M (NH4)2Ac混匀，冰浴5 min；
10. 13000 rpm离心2 min；
11. 转移上清至一新Epp管；
12. 加2倍体积的乙醇，振荡混匀，于室温放置5 min，13000 rpm离心5 min；
13. 用1 ml 70 %乙醇洗涤双链DNA沉淀，13000 rpm离心5 min，弃上清，
在空气中使核酸沉淀干燥10分钟；
14. 用20 μl TE buffer重新溶解核酸沉淀，贮存于-20 ℃备用。
十一、蛋白质诱导表达
(一)、材料
1. 氨苄青霉素（用去离子水配成60 mg/ml，用0.22 μm 滤器过滤除菌，-20 ℃
避光保存）
2. IPTG（用去离子水配成200 mM，用0.22 μm 滤器过滤除菌，-20 ℃保存）
3. PMSF（用异丙醇配成10 mM，-20 ℃保存）
(二)、方法
1. 挑取单克隆接种于含有氨苄青霉素（100 μg/ml）的小量LB 培养液中，37 ℃
振荡培养过夜；
2. 将过夜培养物按1∶100 的比例接种到含氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB 液
体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600约为0.5；
3. 加入IPTG 至终浓度为0.1-1 mM，每隔一小时取一次样；
4. 在诱导了3 小时的菌液中取适量（如10 ml），离心，去上清，加入1ml PBS
重悬，再加入PMSF 至终浓度为0.1 M，冰上预冷10 min；
5. 进行超声破碎10 min（10-20 sec /次），至菌液较为澄清，离心，取上清；
6. 用相同体积的PBS 重悬沉淀，将诱导前及诱导后所取的样品，以及超声破
碎后的上清和沉淀分别进行蛋白电泳检测，染色、脱色；
7. 根据脱色结果，可确定是否有表达出目的蛋白，选择合适的诱导时间以及表
达量较高的克隆，并且判断所表达的蛋白是可溶性的还是以包涵体形式存在。
十二、GST 融合蛋白的表达和纯化
1. 按上述蛋白质诱导表达的方法表达出GST 融合蛋白，此时GST 融合蛋白是
溶于PBS 中的；
2. 取适量Glutathione Sepharose TM 4B beads（Amersham Biosciences，
Sweden），用PBS 洗3 遍；
3. 将beads 加入GST 融合蛋白的上清液中，4℃ Rotation 4-6 h；
4. 4℃最高速离心3-5 sec，小心吸弃上清；并用PBS 洗3 遍；
5. 藕联了GST 融合蛋白的beads 备用于后面的实验。
十三、蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(一)、材料
1. 30%丙烯酰胺储存液：丙烯酰胺29.2 g
亚甲双丙烯酰胺0.8 g
加蒸馏水溶解后，补加蒸馏水至终体积为100ml。检测其pH值，应不大于7.0。
过滤，避光储存。
2. 2×SDS 凝胶加样缓冲液：Tris-HCl (pH6.8) 100 mM
SDS（电泳级） 4 %
溴酚蓝0.2 %
甘油20 %
使用前加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为200 mM。
3. 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris 碱15.1 g
甘氨酸94 g
溶解于900 ml dd H2O，再加入50 ml 10%（w/v）SDS（电泳级），用dd H2O 补至1000 ml。
(二)、方法
1. 配制所需浓度的分离胶：
2. 将配好的分离胶灌注到两玻璃板的空隙中，用异丁醇覆盖；
3. 室温聚合，倾出异丁醇，用蒸馏水洗涤，并用滤纸吸净残留的液体；
4. 配制5%的浓缩胶：
5. 在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，立即插入梳子，室温聚合30 min；
6. 待浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子；
7. 向电泳槽中加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，加样，并在所有不用的样品孔中
加入等体积的1×SDS 凝胶加样缓冲液；
8. 接通电源（正极接下槽），先用120 V 电压电泳至染料前沿进入分离胶再将电
压提高到150-200 V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部；
9. 关闭电源，从电泳装置上卸下玻璃板，剥胶，接下来染色脱色或者做Western
Blotting 鉴定。
十四、Western Blot
(一)、材料
1. 转移Buffer: Tris碱25 mM 6.08g
Glycine L-甘氨酸192 mM 28.80g
Methnol甲醇20% v/v 500ml
( ddH2O 定容至2 L)
2.
3. TBST:
4. 封闭液: 5 %脱脂奶粉（溶于TBST）
5. ProtoBlot Ⅱ AP System with Stabilized Substrate, Human (Promega，USA)
6. Lumi-Phos TM WB (Pierce, USA)
(二)、方法
1. SDS-PAGE 电泳分离蛋白；
2. 电转移至NC膜（100V恒流1 h）；
3. 用封闭液封闭2 h或4℃封闭过夜；
4. 加入一抗，室温温育1-2 h或4 ℃温育过夜；
5. 用PBST 洗3 次，每次5-10 min；
6. 加入相应的二抗，室温温育45 min；
7. 用PBST 洗3 次，每次5-10 min；
8. 用PBS 润洗2 次；
9. 加入适量的显色底物(1：1混合)（ProtoBlot ⅡAP System with Stabilized
Substrate）至目的条带清晰可见，或者用Lumi-Phos TM WB底物做ECL。
十五、免疫共沉淀
(一)、抗体的偶联：
1. 在Epp管中，加入500 μl PBS、适量的抗体和Protein A/G Beads（Perice公
司），再加BSA至终浓度至0.1 %；
2. 将Epp管置4 ℃，rotation 4 h以上，4℃最高速离心3-5 sec，小心吸弃上清；
3. 在Epp管中加入1 ml 相应的细胞裂解buffer，颠倒混匀，4 ℃最高速离心3-5
sec后小心吸弃上清；
4. 重复步骤3，用细胞裂解液清洗Beads 3-4 次，最后吸弃上清，将Beads放4 ℃
备用。
(二)、免疫共沉淀：
1. 收集转染后的细胞，800×g 离心5 min；
2. 吸弃上清，加入适量的PBS清洗细胞，重复2 次，800×g 离心5 min，最后
吸弃上清；
3. 加4 倍细胞沉淀体积的裂解buffer，并在4℃ Rotation 1h；
4. 14000 rpm，4 ℃离心15 min；
5. 小心吸取上清，加入到已偶联上抗体的Protein A/G Beads，4 ℃ Rotation 过
夜；
6. 4 ℃最高速离心3-5 sec，小心吸弃上清；
7. 加入裂解buffer重悬Beads，最高速离心3-5 sec后，小心吸弃上清；
8. 重复步骤7，用裂解buffer清洗Beads 3-4 次；
9. 最后加入适量的上样buffer，95 ℃加热5 min后SDS-PAGE分析。
十六、细胞培养
(一)、细胞培养条件
HeLa、HEK293T以及MCF-7细胞培养在DMEM+10% FBS的培养基中，H1299细胞培养在RPMI-1640+10 % CS的培养基中，所有细胞均在37 ℃，5% CO2孵箱中培养。
(二)、贴壁细胞的传代
1. 在细胞组织培养通风橱中，用灭菌过的巴氏德吸管吸去旧培养液；
2. 用PBS 洗涤细胞，旋转培养皿使溶液覆盖整个细胞表面，然后吸去；
3. 加入Trypsin/EDTA 消化细胞，旋转培养皿使溶液覆盖整个细胞表面，然后吸
去，将培养皿在室温放置数分钟直至细胞从培养皿底部分离开来；
4. 加入细胞培养液，用吸管吹打，使细胞脱离瓶底，从而获得单细胞悬液；
5. 按一定比例将细胞悬液接种在含有新的细胞培养液的培养皿中，放入细胞培
养箱中继续培养。
(三)、细胞的冻存（保种）
1. 在冻存前一天换一次培养液；
2. 对于贴壁细胞，用Trypsin/EDTA 把细胞消化下来，将细胞收集于离心管中；
3. 室温800-1000 rmp，离心5 min；
4. 去除培养液，加入冻存液，细胞最终密度为5×106/ml–1×107/ml；
5. 用吸管吹打使细胞均匀，按1 ml 分装到冻存管中；
6. 在-70 ℃冰箱中保存一天后，转移到液氮中长期保存。
(五)、细胞的冻融（复苏）
1. 需要进行培养的冻存细胞取出，立即投入37 ℃水浴中融化；
2. 用吸管将细胞转移到25 cm2培养瓶中，加入一定量培养液；
3. 37 ℃培养，细胞贴壁后，换新鲜培养液继续培养。
十七、细胞转染
1. 按约1-3×105细胞/孔的细胞量在六孔板中接种指数期生长的细胞，在37 ℃，
5% CO2 孵箱中培养过夜，直至转染前细胞密度达到50%-80%；
2. 制备下列溶液：
Solution A: 在100 μl 不含血清的培养液中加入1-2 μg DNA。
Solution B: 在100 μl 不含血清的培养液中加入2-25 μl Lipofectamine （Invitrogen，USA）试剂。
3. 充分混匀上述两种溶液，室温放置15-45 min，使之形成DNA-脂质体复合物；
4. 用2 ml 不含血清的培养液润洗细胞；
5. 在上述混合液中加入0.8 ml 不含血清的培养液，混匀，加入到细胞中。37 ℃，
5% CO2孵箱中培养2-24小时，推荐5小时；
6. 往每孔细胞中加入1 ml含2倍平时浓度血清的培养液；
7. 转染18-24小时后，换新鲜培养液；
8. 转染72 h 后，将细胞按1：12接种到两个六孔板中，加入含G418的选择性培
养液；
9. 将细胞培养适当时间以选择真正被转染的细胞克隆；
10. 挑出单克隆细胞并用Western blot 的方法验证。
十八、细胞凋亡率的测定
1. 转染前18-24 h 用胰酶消化并传代细胞于24 孔中，使其在转染时密度可达
50%左右；
2. 每24 孔瞬时转染等量不同质粒，24 h 后，每孔中所有细胞经Hoechst 33342
染色、充分混匀并静置5-10 min 后，在荧光显微镜(Olympus IX71)下随机选取5 个不同的视野进行拍照；
3. 凋亡细胞的特征是在配有蓝色滤光片的荧光显微镜下可见细胞核发生了DNA
凝集和(或)片段化，同时在光学显微镜下可见其细胞有明显的皱缩、起泡和
脱起；
4. 计数荧光观察绿色荧光蛋白（GFP）融合的绿色的细胞及经Hoechst 33342
染色后核的形态发生变化的细胞占所有发绿色荧光的细胞的百分比为凋亡细胞的死亡率。每个处理计数五个区域的细胞，并做三个处理。计数活细胞数和凋亡细胞数并进行数学统计。
十九、间接免疫荧光
1. 取出培养有细胞的盖玻片，吸干上面残留的培养基后，用适量预冷的PBS润
洗盖玻片1-2次；
2. 吸去残留液体，用4 ％的多聚甲醛/TBS 室温固定细胞约20 min；
3. 吸去残留液体，用适量的TBST清洗细胞3次，每次5-10 min；
4. 0.01 ％的Triton X-100/TBST室温下处理5-10 min；
5. 用0.1 % Tween/TBS清洗细胞2次，每次5-10 min；
6. 用1 ％BSA/TBS 封闭细胞1 h；
7. 将适量的含有一抗的1 ％BSA/TBS加到含有细胞的盖玻片上，室温下孵育
1h；
8. 吸去抗体，用0.1 % Tween/TBS清洗细胞3次，每次5-10 min；
9. 将适量的含有二抗的1 ％BSA/TBS加到含有细胞的盖玻片上，室温下孵育
30 min；
10. 吸去液体，用0.1 % Tween/TBS清洗细胞3次，每次5-10 min；
11. TBST清洗细胞3次，每次5-10 min；
12. 加适当浓度的Hoechst染细胞1 min；
13. TBST清洗细胞3次，每次5-10 min；
14. 最后吸去残留的液体后，在载玻片中央滴一滴抗淬灭剂，然后小心地盖上含
有细胞的盖玻片，吸去周围多余的液体，用指甲油小心封片；
15. 在荧光显微镜下观察蛋白质的细胞定位。
二十、放线菌酮（CHX）抑制实验
1. 按约5×104细胞/孔的量在24孔板中接种指数期生长的细胞，在37 ℃，5 %
CO2培养箱中培养过夜，直至细胞长至50 %-80 %密度；
2. 用Lipofectamine 2000转染所需的质粒；
3. 转染24 h 后加入25 ug/ml 的放线酮处理一定的时间，然后收集、裂解细胞
并做Western Blotting。
二十一、体外泛素化实验
GST、GST-Siah-1以及GST-Siah-1表达在DH5α或者BL21/DE3的大肠杆菌中。诱导表达以及纯化的方法如前所述。
ubiquitination buffer：50 mM Tris-HCl (pH7.6),
50 nM rabbit E1
500 nM UbcH5c
25 μM Flag-ubiquitin
2 mM ATP.
反应总体系为30 ul，总的反应体系在37 ℃以适当的速度振荡孵育1 h。反应结束后，GST、GST-Siah-1以及GST-Siah-1 分别用ubiquitination buffer 洗6 遍，然后加等体积的2×SDS 凝胶加样缓冲液，煮蛋白，SDS/PAGE 电泳分离，最后用anti-Flag 的抗体做Western Blotting检测。
二十二、克隆形成率和集落形成率测定（Colony formation assay）
1. 用含0.6 %的琼脂糖10 %胎牛血清的DMEM铺六孔板的底层；
2. 放置4 ℃备用，使用前半小时放置37 ℃；
3. 取GFP、GFP-Siah-1以及GFP-Siah-1S稳定转染的MCF-7细胞，计数5000
个细胞；
4. 将计完数的细胞和0.7 %的低溶点琼脂糖混合形成终浓度0.35 % 的低溶点
琼脂糖，并铺于上层；
5. 放置于37℃，5 % CO2条的培养箱中培养3周。
二十三、Pulse-chase 实验
1. 细胞培养在DMEM+10 % FBS的培养基中24 h；
2. 用PBS将细胞洗2遍；
3. 加入DMEM-Cys--Met-培养基，37 ℃孵育30 min；
4. 加入35S标记的半胱氨酸/甲硫氨酸（终浓度为150 uCi/ml），37 ℃孵育5 h；
5. 用DMEM-Cys+-Met+培养基将细胞洗2遍；
6. 换DMEM+10% FBS培养基，继续培养所需的时间；
7. 特定时间后，收集细胞并用RIPA裂解液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，1%
Nonidet P-40，0.1 % SDS，150 mM NaCl）裂解；
8. 离心，取上清，并按前述的免疫沉淀的方法免疫沉淀所需的蛋白；
9. 采用放射自显影的方法检测蛋白质的浓度。
二十四、线粒体/胞质组分分离
1. 收集细胞，并用冷的PBS洗2遍；
2. 用胞质裂解液（250 mM Sucrose，20 mM HEPES pH7.4，10 mM KCl，1 mM
EGTA，1 mM EDTA，1 mM MgCl2，1 mM DTT）重悬细胞，放置于冰上裂解30 min；
3. 2500 rpm于4 ℃离心10 min，取上清；
4. 继续离心上清液，13000 rpm于4 ℃离心20 min，以沉淀线粒体；
5. 转移上清至一新Epp管中，此组分即为胞质组分；
6. 用同体积的裂解液重悬沉淀，此组分即为线粒体组分。
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验室常用试剂的配制
一.常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解 2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。 分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）： 溶解 3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用 0.22um孔径的滤膜过滤除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA）： 加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于 9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）： 在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加 32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加 0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。 8mol/L乙酸钾（potassiumacetate）：
溶解 78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。 1mol/L氯化钾（KCl）： 溶解 7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。 3mol/L乙酸钠（sodiumacetate）： 溶解 40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至 5.2，再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA: 配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（ 0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取 186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。 1mol/LHEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（ 6.8- 8.2），然后用水定容至100ml。 1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至 91.4ml的水中。 25mg/mlIPGT： 溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。
建立一个分子生物学实验室所需的仪器
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学实验室常用仪器及使用方法
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
分子生物学实验中常用的抗生素配置及工作浓度
常用抗生素： 备注：(摘自《分子克隆》第三版附录 2 ) ①以水为溶剂的抗生素贮存液应使用0.22 ym滤器过滤除菌； ②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌； ③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。 氨苄青霉素( ampicillin )(100mg/ml ) 溶解1g 氨苄青霉素钠盐于足量的水(最好是高压后的灭菌水)中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/ml? 50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素( carbenicil l in )( 5 0 m g/m l ) 溶解0.5g 羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林( methicillin )(100mg/ml ) 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素( kanamycin)( 10mg/ml) 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。氯霉素( chloramphenicol)(25mg/ml) 溶解250mg 氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml 。分装
成小份于-20C贮存。常以12.5ug/ml?25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素( streptomycin)(50mg/ml) 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸( nalidixic acid )( 5mg/ml ) 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装 成小份于-20C贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素( tetracyyline)(10mg/ml ) 溶解100mg 四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以 免溶液见光，于-20C贮存。常以10ug/mI?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
分子生物学实验室常用有毒药品
分子生物学实验室有毒常用药品 1.溴化乙锭（：具有强诱变致癌性，使用时一定要戴一次性手套，注意操作规范，不要随便触摸别的物品。 2（焦碳酸二乙酯：闻起来香香甜甜的，可是害人不眨眼！一种强有力的蛋白质变性剂，而且怀疑是致癌剂.开瓶时将瓶子远离你，内压可导致溅泼.操作时戴合适的手套，穿工作服，并在化学通风橱里进行. 3（苯甲基磺酰氟：老板说是神经毒!!!是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂.它对呼吸道黏膜，眼睛和皮肤有非常大的破坏性.可因吸入，咽下或皮肤吸收而致命.戴合适的手套和安全眼镜，始终在化学通风橱里使用.在接触到的情况下，要立即用大量的水冲洗眼镜或皮肤，已污染的工作服丢弃掉. 4. 乙腈，易挥发易燃，是一种刺激物和化学窒息剂，通风橱中远离热、火。 5. 放线菌素D ,是一种致畸剂和致癌剂，通风橱中操作。 6鹅膏蕈毒环肽，具有强毒性,可能致命。 7亚甲双丙烯酰胺,有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末。 8. 甲醇,有毒,能引起失明。 9. 乙酸（浓的：可能因为吸入或皮肤吸收而受到伤害，要戴手套和护目镜，最好在化学通风橱中操作。 10. 过硫酸酸铵:对粘膜和上呼吸道、眼睛和皮肤又较大危害性，吸入可致命。操作时戴手套、护目镜。始终在通风橱中操作。
11. 氯化铯:可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时戴手套和护目镜。 12:很强的还原剂，散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。当使用固体或高浓度储存液时，戴手套和护目镜,在通风橱中操作。13.甲醛:毒性较大且易挥发，也是一种致癌剂，易通过皮肤吸收，对眼睛、粘膜和上呼吸道有刺激和损伤作用。避免一如其挥发的气雾。戴手套和护目镜。始终在通风橱中操作。远离热、火花及 明火。 14 ,对眼睛有刺激性，腐蚀皮肤。有一次不小心溅出一小滴在脸上，马上就红了，过一会儿感觉到疼，一周之后才好。如果溅上，马上用大量的水冲洗。 大家在实验室里，接触到的化学试剂多半都有危害性，紫外灯，如果离心机不是很好的话的噪声污染，会导致手指需要震动，等等,所以每个人都应该注意保护自己，而不能因为图省事或者别的什么原因而放松对安全的注意。 另外就是注意规范操作，搞微生物的尤其要注意，不要实验室感染。 15. 叠氮钠,有毒,阻断细胞色素电子运送系统 16. 氟化钠,有毒可致命,通风橱中操作 17. 放射性物质（同位素标记时，要戴手套,护目镜,穿工作服,最好买试剂盒（如果有商品化的 18巯基乙醇，可致命,对呼吸道、皮肤和眼睛有伤害 19. 氨甲蝶呤,致癌和致畸
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验指导-3
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
分子生物学实验中常用的抗生素配置及工作浓度
常用抗生素： 备注： （摘自《分子xx》第三版附录2） ①以水为溶剂的抗生素贮存液应使用 0.22μm滤器过滤除菌；②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌； ③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。 氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水(最好是高压后的灭菌水)中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml） 溶解 0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。 分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml） 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以 37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml） 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以 12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml） 溶解 0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。 分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml） 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
分子生物学实验技术实验内容
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
分子生物学实验简述
7 繁殖迅速，培养对象易于控制，利用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌大规模生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。目前已实现商品化的30多种基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌生产的。 2.3.3 pBR322质粒载体的特点 （1）具有较小的分子量，避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂,pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段 （2）具有两种抗菌素抗性基因(四环素、氨苄青霉素抗性基因)可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子,便于分子克隆的筛选。 （3）含有高效的自主复制成分，质粒的复制和宿主的繁殖不相关，在抑制细菌蛋白质合成时，细菌染色体DNA 停止复制，但质粒可以继续利用细菌原有的酶系统进行复制。（4）限制性内切酶单一切口，在质粒复制子以外的部位具有一种或多种限制性内切酶的单一切口，便于外源基因的插入。 2.4基因的导入 2.4.1基因导入的概述 把已知基因转移到真核细胞，并且整合到基因组中得到稳定表达的技术，称为基因导入。它是改变物种遗传性状的最根本途径。要把基因导入细胞，首先要把细胞克隆化。目前已经得到了若干真核细胞克隆化基因，如β-珠蛋白基因，TK基因等。利用显微镜操作把这些基因注入到小鼠受精卵的原核中，再把受精卵植入到生殖管道中，发育成的个体不仅能表达注入
8 基因决定的性状，而且能把该基因传到第二代。 2.4.2基因导入的方法 基因导入的方法总体有物理方法，化学方法和生物学方法。其中物理方法主要有DNA直接注射法、颗粒轰击技术;化学方法主要有脂质体载体、受体介导法；生物学方法主要通过构建病毒载体来完成，常见的有逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。 2.5基因的导入后的筛选与鉴定 2.5.1筛选与鉴定的原因 由于DNA分子的体外重组是分子群体间的反应，因此连接反应完成后的体系中不仅含有正确的重组子，还含有一些不正确的重组子及为重组的DNA，如载体自身环化形成的DNA 分子，外源DNA片段彼此相连形成的多聚物等。因此，连接物转化受体细胞后，我们需要采用适当的方法将所需要的目的基因转化重组子从非重组子中和细胞群体中筛选和鉴定出来。重组子的筛选与鉴定是基因克隆的重要步骤。 2.5.2筛选与鉴定的方法 筛选与鉴定的方法，在遗传选检测上有插入失活筛选、蓝白斑筛选；在物理检测上有酶切鉴定、PCR检测；此外还可利用核酸分子杂交检测，免疫学检测，核酸序列分析等方法。 2.6目的基因的表达与鉴定 2.6.1目的基因表达与鉴定的原因 克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，克隆基因表达出所编码的蛋白质可供做结构与功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上以至在工业上都是很有应用价值的，可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得。 2.6.2目的基因的表达系统与鉴定方法迄今为止，已建立的基因表达系统有多种，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统。常用的原核生物表达系统有大肠杆菌表达系统，芽孢杆菌表达系统和链霉菌表达系统等；常用的真核生物表达系统是酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统和昆虫细胞表达系统等。而其中最具代表性的是大肠杆菌表达系统和酵母菌表达系统。 目的蛋白的鉴定方法包括生化反应检测法，免疫学检测法和生物学活性检测法等。常用的有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western杂交、等点聚焦电泳和双向电泳等。 3、基因工程生产干扰素 3.1、干扰素目的基因的分离与扩增 (1)破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA (2)将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶电泳切取相对分子质量为256bp的部分 (3)mRNA反转录成cDNA cDNA第一链的合成（Reverse Transcription）。 选用GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒使用Oligo(dT)引物（因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。属于亲和层析技术。） 在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在
医学分子生物学实验技术
1、基因：是遗传的物质基础，是DNA 或者RNA分子中携带遗传信息的特定核苷酸序列。 2、基因组：是指单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA 或RNA分子，每个生物的基因组携带者构成和维持该生物体生物形式所必需的所有生物信息。 3、逆转录：以RNA为模板，由反转录酶催化四种dNTP聚合，产生DNA的过程。 4、聚合酶链反应：是一种由引物介导利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。 5、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 6引物：是一种与DNA模板链互补的线性核苷酸变短，其3’末端为游离的-OH，细胞内复制所需的引物是一小段RNA。催化游离dNTP之间相互聚合。 7、TaqDNA聚合酶：从一种嗜热菌株中分离得到的耐热的DNA聚合酶。 8、退火:热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程成为退火。 9、启动子：是位于转录起始点附近，且为转录所必需的序列元件。 10、DNA变性：当DNA收到某些理化因素作用时，DNA双链互补碱基对之间的氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，DNA分子被解开成单链，逐步形成为无规则线团的构象，不涉及核苷酸间共价键的断裂。
1、RT-PCR的基本原理 将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板，反转录生成DNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 2、DNA电泳的基本原理，按照支持物不同可以分为几类 基本原理：核酸是两性电解质，在中性或偏碱性的pH溶液中均带负电，在电场中向正极泳动，不同的核酸在相对分子质量、分子形状等方面各有不同，在凝胶的空隙中泳动时电泳迁移率各不相同，因此借助电泳即可使其得到分离。 分类：1琼脂糖凝胶电泳AGE 2聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE 3 毛细管电泳 3、总RNA提取后，如何鉴定RNA的纯度 （1）紫外分光光度法：先通过A260与A280的比值判断核算的纯度，纯RNA的A260与A280的比值等于2.0，比值升高或降低均表示样品不纯。 (2)琼脂糖凝胶电泳法：基因组DNA的分子量远远大于RNA，两者之间电泳迁移率存在很大差别，用荧光染料EB为示踪剂的AGE即可观察到RNA分子中是否含有DNA，细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳一般可见三条条带，条带模糊比例不合适及弥散明显说明RNA有严重降解。