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酶法与化学法相结合合成细胞

保密级别：内部学位级别：理学硕士论文提交日期：2000年五月答辩日期：2000/6/9 分类识别：Q55 总页数：73

开本： 16开图表：有

酶法与化学法相结合合成细胞粘和因子RGD的研究

作者：张立强

专业：生物化学与分子生物学

导师：张学忠教授

分子酶学工程教育部重点实验室

吉林大学

二OOO年六月

Master’s Degree Thesis

Synthesis of Cell Adhesive Factor-RGD

Catalyzed by Porcine Pancreas Lipase

Author: Zhang Li-qiang

Major: Biochemistry

Supervisor: Prof. Zhang Xue-zhong

Key Laboratory of Molecular Enzymology and Engineering of Educational Ministry

Jilin university

May 2000

提要 (1)

前言 (2)

材料与方法 (19)

结果与讨论 (26)

一、　化学法合成GD二肽的反应机理及最佳

反应模型的建立 (26)

（一）化学合成的机理 (26)

（二）最佳反应的建立 (26)

小结 (27)

二、　脂肪酶催化的RGD及其前体二肽的合成 (28)

（一）脂肪酶催化肽合成的反应机理 (29)

（二）猪胰脂肪酶催化RGD三肽合成的研究

及最佳反应模型的建立 (30)

小结 (41)

（三）猪胰脂肪酶催化合成RGD前体二肽

的研究及最佳反应的建立 (42)

小结 (50)

结论 (52)

参考文献 (55)

致谢 (61)

摘要 (Ⅰ)

Abstract (Ⅴ)

提要　

本研究采用化学法与酶法相结合的手段进行细胞粘合因子RGD三肽合成的研究。首先采用氯乙酰基保护天冬氨酸，然后进行氨解生成GD二肽，建立了一个简便、有效、经济的合成RGD前体二肽的模型。利用脂肪酶能催化肽键形成的特性，使用猪胰脂肪酶（PPL）催化合成RGD三肽，并研究影响肽合成的因素，着重解决亲水氨基酸/肽片段底物的溶解性与合成产率低的问题。采用有机溶剂-水混溶体系解决亲水性底物的溶解性问题，发现脂肪酶PPL在该类体系中也有很好的溶解性，同时可以避免在水含量较大的反应体系中目的产物的二次水解。考察五种不同的混溶体系，确立了两种最佳反应体系，即：50% DMF，15℃，pH7.7，反应时间为6h，最大产率为76.4%；或50% DMSO，10℃，pH7.7，8h，最大产率为71.7%。结合PPL催化RGD前体二肽RG和GD的研究，我们首次较为系统地从理论上对各种因素对PPL催化肽合成影响机理作了分析。

关键词：猪胰脂肪酶（PPL） RGD 合成有机溶剂Key Words: Porcine Pancreas Lipase RGD

Synthesis Organic solvent

前言　

§１．１生物活性肽（bioactive Peptide）

生物活性肽是沟通细胞间和器官间信息的重要化学信使，通过内分泌、神经内分泌乃至神经分泌等方式行使微妙的信息传递功能，从而使机体组合成一系列高密度的控制系统，调节生长、发育、繁殖、代谢和行为等生命过程。不论是从结构还是功能来说，生物活性肽都是最复杂和多变的化合物，表1列出了部分肽的生理活性。　

Table 1 Examples of physiologically active peptides[1-11] Peptide class Residues Activity

Antibiotic peptides

Subtilin

Nisin

Lactocin S

Pediocin PA1 Neuropeptides

Leu-enkephalin Met-enkephalin α-endorphin Dynorphin

Bombesin Hormonal piptides Unknown

Unknown

Inhibits Gram-positive bacteria

Inhibits Gram-positive and acid bacteria

Clostridium botulinum

Listeria monocytogenes

Staphylococcus aureus

Some lactic acid bacteria Listeria sp.

Opioid

Neuromodulator

Oxytocin

ACTH

Vasopressin

Somatostatin Enzyme regulators and inhibitors

Cerulein

Cholecystokinin

Glutathione

39(sulfated)

Contraction of smooth muscle

Stimulation of steroid synthesis

Contraction of vascular muscle

Stimutation of steroid synthesis

Enzyme regulator

Cofactor regulator

§１．１．１生物活性肽的特征　

活性肽行使各种功能，具有极高的调节效率。他们在结构与功能方面具备下述几个要素：a）信息量丰富，构象特征明显，从生物进化的观点来衡量，其分子内部可能有发展变异的内在因素；b）作用非常灵敏，极微量即可对应答细胞产生作用；c）在细胞内部产生应答；d）在生物细胞内部合成、转运及最后胞吐外释，这一切都涉及生物膜结构，与多肽分子的结构相对应；e）经历一个由非活化态转变到活化态的激活过程，这样在应急状态下能及时动员，随即加工装配；f）具有一定的稳定性，可保证它到达目的地之前不被破坏，在其完成传递信息的任务后，迅速灭活或降解；g）为了防止出错，设有反馈系统及多元控制机制相互制约。　§１．１．２生物活性肽的种类　

生物活性肽已经成为多学科研究人员注意的中心，许多具有确切生物活性的多肽被分离并合成出来，对已知的活性肽的功能又不断有了新的认识，我们对已有的进展力图作一简单的回顾。　

ａ．　神经肽　

神经肽（中枢神经系统的多肽）的生化、生理学、药理学

和合成，一直都是人和动物的生长和激素调节研究中的主

流。P物质(SP)、神经激肽、神经紧张素(NT)、内啡肽、脑

啡肽、京都啡肽、新京都啡肽[12]、催眠肽(DSIP)、DBI肽（苯

并二氢杂卓结合抑制剂）[13]等都属于神经肽类物质。这些肽

在神经系统的功能上（如疼痛调节）起重要作用。此外，

Meisel等人[14]从奶制品、鱼、大豆等蛋白水解液中分离出多

种神经活性肽，这对迅速发展的食品医学领域有重要启示。

b、激素肽和激素调节肽[15]

　这类肽包括下丘脑的释放激素和释放抑制激素。胃肠

肽（胃、肠和胰肠腺肽）、血浆激肽、胰岛和甲状腺激素、

无脊椎动物神经肽激素，这些肽以激素和激素调节物的形式

在新陈代谢、生长发育过程中起着复杂的、极为重要的作用。

c、具有免疫重要性的多肽　

这类肽包括体内分泌的具有免疫活性的多肽，如：胸腺

肽　、胸腺素α1、血清胸腺因子（FTS）、白介素、干扰素以

及用酶法切割γ-球蛋白的组分所得的Tuftsin等，它们对免

疫反应起着重要的激活和调节作用。此外，多肽疫苗[16]的产

生更加激起了人们对此的兴趣。　

d、对酶起调节作用的肽　

它们在生物化学过程中调节酶的活力（如血管紧张素转

化酶，ACE）。这类肽主要包括肾素—血管紧张素系统的多

肽；同时在人酪蛋白、金枪鱼肌肉蛋白和锌蛋白的水解物序

列中也发现了这类肽[17-19]。　

e、抗生素、抗病毒肽及毒性肽　

自从发现杆菌肽和短杆菌肽以来，已合成了数百种肽类

抗菌肽。这类物质主要包括Monamycins、磷肽、放线菌类、

白霉素、乳酸链球菌肽、尼可霉素族、CecrepinA、丙甲菌

素、万古霉素等，它们其中一些已表现了明显的药用价值，有些还在食品的防腐、保鲜中作为丙酸盐和亚硝酸盐的替代品使用，展现了其诱人的前景。次毒蕈环肽、α－蛾膏素、毒八肽等包括在最有名的多肽毒素中。除此之外，还有被用作杀虫剂的depsipeptide destruxin C和　D以及具有强除草作用的　Phosphinotrilylalnine[21]等都属于毒性肽。　

f、其它肽类　

源于细菌细胞壁的胞壁酰肽可用作佐剂与疫苗结合（增加体液和细胞免疫），与抗菌素结合（增加抗菌效应）。现在已合成了大量的胞壁酰肽因子[22]，目标在于寻找非依赖性的内源性催眠剂。　

目前已发现的风味肽不少于20种，其中最典型的当属阿斯帕丁甜（甜味二肽）[23]。这是Schlatter等人在合成促胃液素过程中意外的但极有意义的发现。　

§１．２一个多功能的细胞识别作用的信号—RGD三肽纤粘蛋白（fibronectin）是一种暴露于细胞外的大分子糖蛋白，可介导细胞对细胞外基质（ECM）的粘附作用，在研究纤粘蛋白的细胞识别作用时出乎意料的发现在长达2500个氨基酸残基的纤粘蛋白分子中对它与细胞表面受体相互作用的决定因素竟仅仅是一个三肽序列的精氨酸－甘氨酸－门冬氨酸（RGD），而且另外几种与细胞表面相互作用的粘附蛋白对细胞附着位点也涉及同样的氨基酸序列，说明RGD序列是广泛分布的细胞识别体系的基本单位[24,25]。　§１．２．１含RGD多肽的药用价值　

粘附蛋白和整合素介导许多种类的细胞与细胞以及细胞与底物间的相互作用，参与许多生物学过程，如体内平衡调节、吞噬作用、细胞迁移、细胞信号传递、细胞通讯和淋巴细胞识别、血小板的聚集等。因此许多病理学过程与不正

常的ECM作用有关，正是这一点使含RGD的多肽或化合物可治疗一些疾病。目前研究主要是引用含RGD的多肽或化合物与粘附蛋白竞争细胞表面整合素，进而阻断细胞间及细胞与基质的粘附，达到治疗疾病的目的，其应用目前最主要有以下几个方面：

ａ．抑制血栓形成：　

心血管疾病已成为人类的第一大杀手，血栓形成则是引起此类疾病的重要原因之一，血小板在血栓形成过程中起重要作用。正常血小板在凝血酶原、二磷酸腺苷或胶原诱导下被激活，纤维蛋白与其表面的GpⅡb/Ⅲa受体结合。　RGD 序列多肽可与纤维蛋白竞争，阻断血栓形成。目前含RGD 多肽抗血栓形成的优良性质受到广泛重视[26]。　ｂ．治疗肿瘤转移　

现代外科手术和化疗方法的发展，虽然在临床上能够有效地治疗某些原发性肿瘤，但对肿瘤转移形成的继发性肿瘤很难治疗成功。继发性肿瘤因此成为临床上引起死亡的主要原因之一。肿瘤转移与肿瘤细胞的粘连性密切相关，多数肿瘤细胞缺少ECM，　彼此之间的粘着力低，能脱离自身细胞之间的粘连而脱落，为其浸润性生长和转移提供了条件。肿瘤细胞从原发瘤体脱落后，其表面的各种整合素与内皮下基底膜中含RGD的糖蛋白和胶原结合，粘连侵袭基底膜，在其周围间质中浸润生长，发生肿瘤转移。由于含RGD多肽能与血小板直接结合，封锁血小板与肿瘤细胞的结合，从而有效地防止小瘤栓和血小板介导的粘连桥的形成；更重要的是含RGD多肽首先与血液循环中肿瘤细胞表面的整合素结合，从而有效地抑制肿瘤细胞与ECM的粘连，达到防止肿瘤转移的目的。人们已经开始注意含RGD多肽在治疗肿瘤转移方面的应用价值[24,27]。　

ｃ、对急性肾衰的治疗　

急性肾衰（ARF）为严重危害人类健康的危重疾病之一，目前除血液透析及其他一些支持疗法外，尚无十分有效的药物治疗措施。人们对急性肾衰的分子病理进行研究时发现，肾小管上皮细胞（TEC）不正常脱落及聚集成团导致肾小管阻塞是ARF病理发展过程中的关键因素之一[28]。　

由于TEC的粘附和聚集与整合素和配体的识别密切相关，因此人工合成RGD类多肽可用于治疗ARF。当RGD 类多肽浓度足够大时，它能与整合素受体结合并将其位点封闭，抑制TEC的粘附和聚集。Noiri在缺血性ARF大鼠模型中发现注射人工合成含RGD多肽可改善肾小管阻塞[29]。　ｄ．其他作用　

RGD类肽又可作为兴奋剂（agonist），促进损伤的器官与组织的再生、伤口的愈合等　。美国Telios制药公司已推出制剂名为“Telio-Derm”的新药，即RGD肽类，用于慢性创伤治疗，主要是严重烧伤、皮肤溃疡、头颈部皮肤癌手术后造成的创伤。RGD肽能加快创伤治愈的作用是在新细胞与创伤处粘附并生长到完全愈合时作为暂时立足点。　§１．２．２ RGD在组织工程中的应用　

组织工程学是用工程学和生命科学的原理和方法来研究正常和病理哺乳类动物组织的结构－功能关系，以及研究生物代用品，以恢复、维持或改善其功能的一门交叉学科。在组织工程中，常将一些小的生物活性基团固定在材料表面。RGD是介导细胞与胞外基质粘附的多肽链，在材料表面直接固定RGD，制成受体专门材料，可以促进受体介导的细胞对材料的粘附以提高其生物相容性[30,31]。　

RGD可被固有粘附蛋白受体特异性结合，在生物材料表面自发形成了一个分子层，为与受体介导的细胞反应提供

了位点，进而促进细胞粘附、伸展[32]。由于其独特的生物学特性，RGD正广泛用于固定在不可降解的高分子材料（聚对苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯、聚氨酯等）表面，以及生物可降解材料（如PLA等）表面[33,34]。　

§１．３多肽及其衍生物的合成　

§１．３．１多肽合成的历史回顾　

整个多肽合成的发展史大致经历了以下几个阶段：第一阶段是从1901年Emil Fischer和Forneau用酸水解二酮哌嗪的方法第一次获得自由二肽，到1954年du Vigneaud合成催产素以前为止，属于多肽合成的准备阶段。从1954年催产素全合成到1965年胰岛素的全合成，则可以说是活性多肽的合成时期，在此阶段，发现了一些比天然多肽活性更高的类似物。同时，胰岛素的全合成成功标志着多肽合成进入第三阶段—人工合成蛋白质。此后，由于越来越多的具有更重要生物功能的活性多肽的不断被发现，特别是脑内一些含量少、分离困难的活性多肽的发现，使得活性多肽已经成为一个非常活跃的研究领域，而合成手段也愈益成为研究其结构与功能关系的方法。同时，合成方法也在不断发展和完善。　§１．３．２　肽的合成方法　

到目前人们较为熟知的肽合成方法主要有三种，即：1)化学合成（包括液相合成与固相合成）；2)重组DNA技术；3）酶促合成[35-37]。　

如何选择一种最适的方法主要取决于目的肽产品的长度和数量，酶法全合成目前适于较短的序列；相反，重组DNA技术则更适合于较大肽链的合成，尤其是适于含有几百个氨基酸残基的肽的合成。虽然固相合成法也可以用于一百个以上氨基酸残基肽的合成，但它一般最适于合成中等长度的肽。　

目前，在实验室规模上肽合成最常用的方法是化学法。　六十年代固相合成法的出现逐步替代液相合成法，并使得　合成过程可以自动化。到目前为止，各种各样的固相合成技术使得人们可以合成各种肽及其衍生物，如：糖肽、酯肽、phosphpeptide 和 nucleopeptides　等，由于其所用的试剂和设备费用较高，固相合成法在很大程度上局限于毫克到10克之间的规模，但它仍然是10-100残基序列小规模、快速合成的一种强有力的方法[38]。另一方面，液相合成法适于大规模合成相对较短的肽以及实现肽片段的缩合。　

尽管化学法合成的技术已经相当成熟，但它仍有许多内在的缺点：a) 肽键形成过程中的消旋作用，尤其是在缩合位点的外消旋作用仍然是个相当严重的问题。事实上，目前用于肽键合成的化学反应不少于150种，它们证实缺乏一种理想的、广泛适用的偶联方法。但是需要注意的是有几种常用的方法[39-41]，并且，由于HOBT、HBTU、PyBOP、DEBPO、DOBPT等新试剂的使用，使外消旋化大大降低并增加了偶联的效率[35,42]。b) 在化学合成中，氨基酸的侧链功能基团都需要保护，这在固相合成中尤为重要。这不仅增加了底物的成本，而且会在脱保护过程中降低产率，同时还需要考虑合适溶剂的问题。c) 合成过程中一般使用大过量的偶联试剂和酰基供体以求得到对亲核试剂快速、完全的酰化。因为这些试剂很难再回收利用，所以总体效率就会非常低。d）溶剂和偶联剂的毒性也会引起明显的健康和环境问题，这会使这一技术应用到食品工业时遇到相当大的法律困扰。　

重组DNA技术不受上述问题的困扰，但它需要一个长的、花费巨大的研究和发展阶段。但是，一旦一个合适的体系建立起来，就可以通过发酵由非常廉价的起始物获得大量

的产品。但是利用这一技术来制备短肽的努力尚未成功。例如，从Arabidopsis chaliana 和Brassica napus　的白蛋白中得到的经蛋白水解酶消化的融合蛋白，用它表达可产生鸦片样五肽序列L—[Leu5]—脑啡肽（Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu），所得产率只有50-200 nmol (28-112μg)/g培养液[36]。重组DNA技术与蛋白酶催化得到酶切片段和缩合技术一起用来合成P物质，所得到的含有多拷贝P物质部分序列的融合蛋白经α－胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶作用后，所得终产率仍非常低。多聚序列（polysequence）技术可使小肽的产率提高。利用这一技术，在大肠杆菌工程菌中表达多聚（Asp-Phe）序列，产率可达2-3mg/g培养液[43]。　

尽管DNA重组技术有了很大进展，但由于低的表达效率和在产品的提取和复性方面的困难，利用基因工程法进行短肽序列的合成仍不太实用。需要指出的是，由于微生物体内缺乏肽酰甘氨酸α-氨化酶（α-AE），以重组DNA为代表的细菌表达系统不能用于生产氨化的多肽。这严重限制了氨化作用的利用，而氨化作用在生物活性的表达过程中是极为重要的[44]。另一个弱点是，对于合成肽类药物来说，基因工程技术不能生产含非天然氨基酸的肽。　

§１．３．３酶促肽合成　

所谓酶促肽合成，一般认为是利用蛋白水解酶的逆转反应或转肽反应来进行肽键的合成。近年来，这个方法又有了一些新的发展，已不仅仅局限于蛋白水解酶。作为一种新的有效的方法，不仅已成功地用于许多小肽以及像脑啡肽等生物活性肽的合成，见表Ⅱ[45-53]，更成功地用于一些蛋白质如胰岛素，牛胰核糖核酸酶A，细胞色素C等的修饰和半合成，见表Ⅲ[54-58]。　

§１．３．３．１酶促肽合成的原理　

早在1898年，Vant Hoff 就提出蛋白酶可以催化肽合成这个概念，他认为胰蛋白可能是有催化由它本身的蛋白的水解活性而产生的降解物的蛋白合成。1937年Bergmann 和Fraenkel-Conrat 等人第一次用木瓜蛋白酶酶促合成了硅胺Z-GlyNHC 6H 5，产率达80%；随后他们又先后用木瓜蛋　Table 2 Example of protease-catalyzed synthesis of bio-logically active oligopiptides

Abbreviations used for the enzymes: Cp, Chymopaoain; Ct, α-chymo try-psin; CY, cyclic carboxypeptidase Y; Pa, papain; Su, subtilisin; Tl, thermolysin; Tr, trypsin; Al, alcalase.

白酶、糜蛋白酶等催化合成了设计好的肽。在此之后，人们又相继发现木瓜蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的转肽作用，并利用它们的转肽作用催化合成了一系列的小肽及其衍生物。但是由于酶促合成本身还存在着不少技术上和理论上的困难，同时从50年代以后，化学合成多肽由催产素的合成

Peptide sequence

synthesis Enzyme Reference Asp-phe

Tyr-Arg

Phe-Lys

Tyr-Trp-Val

His-Phe-Arg-Trp

Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu

Tyr-Gly-Gly-Phe-Ieu-Arg-Arg-Lle Tyr-Ala

Tyr-Gky-Gly-Ple-Len

Arg-gly

Gly-Asp Total Total Total Total Total Partial Total

Total Total Total Total Tl Ct Ct Ct,Pa Ct,Tl,Tr Ct,Tl Ct,Pa,Tr PPL Ct,Tl Al ,Pa 58 59 60 61 161 62 63 64 65 57

开始有了日新月异的迅速发展，多肽化学家们的注意力几乎全部集中到化学合成上来，从而忽视了对酶促合成的研究。直到20世纪70年代，Morihara, Kullmann等小组通过他们利用蛋白酶合成模型肽和生物活性肽[59,60]的工作，再次验证了利用蛋白酶进行肽合成的价值。他们的结果直接引起了人们对此项技术的兴趣，在这之后合成出了一些重要的生物活性肽[45-53]。　

§１．３．３．２酶法合成的优缺点　

近二十年的合成工作给人们展示了酶法合成相对于化学法的明显优点[45,52,59-64]：a）反应条件温和，额外的化学的和操作上的危险性都大大降低　；b）酶高度的区域选择性允许使用保护程度很低的底物，这样的底物既便宜又易得到。这也使得合成过程中的中间产物保护、脱保护的步骤得到简化；c）肽的酶法合成是立体特异的并且观察不到外消旋的发生。这样可以使用外消旋的起始反应物，并通过合成反应得到拆分，而回收未反应的异构体。其中b）和c）已在大量合成Aspartame中得到完美的证实。在该过程中，用具有立体专一性的嗜热菌蛋白酶催化DL-Phe-OMe和N-CBZ-L-A sp的缩合，得到唯一的产物N-CBZ-L-Asp-L- Phe-oMe，未反应的D-Phe得到分离。　

蛋白酶同样也能催化化学法合成寡肽片段的无消旋缩合[37,65]，这一工作用化学法时则效率较低，且产生很高的消旋率。此外，蛋白酶还被广泛地用于蛋白质和大的多聚肽的修饰和半合成（Semisynthesis）（如table3所示）。　Table 3 Example of protease-catalyzed semlsynthesis and modification of proteins[66-70]

Abbreviations used for the enzyme: AP, Achromobacter protease; Sl, subtiligase; Su, subtilisin; Tr, trpsin;

尽管蛋白酶已成功地被用在合成一系列复杂多肽序列之中，但在水相中应用这些酶的一些弊端也越来越明显[37,61]。这些缺点主要表现在侧链反应的发生和已生成肽键水解。这在合成较大片段的肽时尤为明显，从而产生各种各样的副产物。另外普遍存在的问题是保护氨基酸衍生物在水相中的溶解度较低。已有一些办法来克服这些缺点[37,66,67]：　

a) 用高pH值来增加脂酶活性与氨酶活性的比值；　

b) 变化反应条件，使产物沉淀或使用双相体系，使产物

转移，从而使平衡向合成方向移动；　

c) 使用有机溶剂来减少水解侧链反应并增加底物溶解

度；　

d) 利用低温来减少水解反应。　

尽管这些措施在个别的事例中证明是有效的，但由于水相体系的固有限制，肽的酶法合成仍有一些局限性，在方法学上仍需进一步探索和改进。　

§１．４　非水介质的酶催化理论　

§１．４．１　非水介质蛋白酶催化简介　

Peptide/protein Condensation/mondification enzymes

Bowine ribonuclease A Human somatotropin [F-His12]-,[F-His119]-and [F-His12,119]-Rnase A2 Human insulin

(Gly142)-hemoglobin (1-19)-Ala+Ser-(22-124)

(1-133)-Arg+Thr-(136-191)

(1-20)+(21-51)+(52-63)+(64-76)+(

77-97)+(98-115)+(116-124)3 Porcine(B30-Ala)-ins

to Human(B30-Thr)-ins

Hb—Arg(141)to

Hb-Arg(141)-GlyNH2(142)

Zak和Klibanov发现在微水环境中，甚至是无水的有机溶剂中蛋白酶可以很好地维持它们的催化构象[68]，这使得酶，尤其是蛋白酶在微水反应介质中得以广泛应用[53,62,63,69-73]。非水环境中蛋白酶催化合成的优点主要有：　a) 反应向合成方向进行，水解反应被抑制，这对肽段缩

合尤为重要；　

b) 许多保护氨基酸底物在有机溶剂中溶解度较高；　

c) 酶的一级、二级特异性经常有赖于反应混合物的性质，

这可以通过溶剂工程作以调整；与之相似，底物和产

物的抑制状况也可以通过溶剂工程的合适应用而降

低；　

d) 产物的纯化和酶的回收再利用也很简单；　

e) 许多酶在低水介质中表现出很高的热稳定性；　

f) 有机溶剂可以防止生物反应过程中的微生物污染。　

尽管非水酶学（nonaqueous enzymology）起步比较晚，但这一技术还是被成功地运用到肽合成中。然而相比于水相中肽合成的事例，在非水体系中全合成生物活性肽的成功事例较少，这也部分地反映出这一技术近期的发展及所遇到的困难。首先，使用有机溶剂往往伴随着酶活性的显著降低。其次，对酶的活性及稳定性最适的溶剂对底物的溶解性经常是不利的，疏水性有机溶剂对酶最为有利，却不能使氨基酸和肽的衍生物有足够的溶解度。反之，极性有机溶剂是有良好的溶解性，却往往会严重影响酶的活性及稳定性。这一矛盾在肽段缩合过程中表现得更为明显，因为底物的亲水性要求溶剂有很好的溶解性。该问题可以通过共溶体系和溶剂工程得到一定程度的解决。　

尽管对一些模型生物活性肽有了大量的、系统的研究，但仍没有得到一个普遍的规律，这主要源于以下两方面的困

难：第一，所有已知的关于蛋白酶专一性的数据都是来源于水解反应而不是合成反应，在较大肽段的合成过程，关于二级和更高级结构的特异性目前所知甚少。因此，目前任何寡肽的酶催化合成都要包括所用酶的选择。第二，对生物催化剂专一性研究较少，因而所用的保护基与传统的化学法合成中所用的保护基团类似。　

§１．４．２非水介质酶催化的进展　

如上所述，所用酶催化肽合成，虽然具有了许多重要的优势，但仍然受到许多不利因素的阻碍。合适催化剂的选择受到限制，关于在非水介质中蛋白酶的性质和专一性知识了解相对较少，对传统的多步技术的依赖性，以及较低的产率等都严重阻碍这一技术的发展。目前，有一些方法正在积极的探索中，以期克服这些以及其他的困难。　

§１．４．２．１新的生物催化剂　

人们正利用蛋白质工程技术来改造酶的催化性质和稳定性，蛋白酶的改造则一直处在这一领域的前沿。Arnol等指出，为了增加酶构象的稳定性，应设法增加酶分子表面与有机溶剂之间的相容性，如减少酶分子表面的电荷、引入新的氢键或二硫键、增强范德华力、最大限度地满足氢键的生成等。对枯草杆菌蛋白酶E进行定点突变，将Asp248改成Asn，以减少表面电荷，Asn218改为Ser，用以增加氢键。结果表明，无论前者或后者的替换，在80%的DMF中比天然酶稳定，而同时进行这两个氨基酸残基的改变，所得变种在80%DMF比天然酶稳定3-4倍[74]。　

化学修饰对改善酶的物理、化学性质仍然是一种有效的、可靠的方法。如Maria等人[75]用AOT制得可溶于疏水有机溶剂中的α-Chymotrypsin和Subtilisin Carlsberg，在有机溶剂中能够很好地催化肽合成，产率较相应地悬浮于有机溶

剂中的酶高3倍。Okazaki等人采用类似的方法，也获得了很好的结果[72]。　酶的固定化也是一种制备高活性和稳定性生物催化剂的有效方法，Zhang等人[76]利用木瓜蛋白酶合成模型化合物Boc-Phe-Val-oMe二肽时，考察了四种载体（硅藻土、CM-纤维素、QAE葡聚糖凝胶A-25和自制鸡卵清蛋白）对酶催化性质的影响，发现鸡卵清蛋白固定化的木瓜蛋白酶催化产率高达94.5%。　

§１．４．２．２反应体系的改进　

研究发现，酶的性质改变也可以通过反应介质来调控，而不是酶结构本身，因而提出介质工程的概念。大量研究表明，溶剂不仅影响有机相中酶催化的活力，还影响它的底物专一性、位置选择性、立体选择性[77]。Chen[45]等人利用反相胶束反应体系很好地解决了底物的溶解性与酶的稳定性之间的问题。目前，无溶剂体系（Solvent-free System）被许多人用于肽合成中[70]，它具有无水解反应发生、产物易提取、产率较高等优点。最近，另一种极端的反应条件正在被研究者尝试，即低温条件下进行酶促肽合成[73]。　

§１．５肽合成策略　

一般来说，寡肽的合成可以遵循三条路线。（如图1）以假设的四肽A1-A2-A3-A4为例，它的合成既可以从C端向N端进行，又可以从N端向C端进行，也可以用上述两种方法相结合来合成。例如(a)中，氨基酸酯（1）作为酰基供体与C末端氨基酸衍生物（2）进行反应生成N端无保护的二肽（3）。然后以该二肽为酰基受体与氨基酸酯（4）反应，连续合成下去得到C端保护的四肽（5），经脱保护得到产物。与之相似，（b）中氨基酸酯（6）与相应的N端保护的N末端氨基酸的衍生物（7）反应得到二肽。以该二肽为酰基供体继续与氨基酸酯反应，最终得到N端保护的四肽，

经脱保护得到产物。在（c ）中，以上述两种方法分别合成二肽，然后将二肽结合起来得到两端保护的四肽，经脱保护得到产物。　

Scheme1. Possible strategies for enzymatic peptides synthesis (a) C to N synthesis

　（b ）N to C synthesis

（c ）Combined N to C ＋ C to N synthesis

A 1, A 2, A 3, A 4　represent amino acid residues ；　X is an N-protecting group such as CBZ, PhAc etc.；Y is a C-protecting group such as t-Bu, NH 2　etc ．；Enz are the enzymes ；OR is ester substrate.

§１．６化学法与酶法相结合的RGD 三肽的合成　

到目前为止，尽管人们对解决酶在有机相中的活性和稳

A 4Y(2)

A 3OR 3(1) EnzI 3A 4Y(3)

A 2OR 2(4) EnzII

2A 3A 4

A 1OR 1 EnzIII A 1A 2A 3A 4

Y Deprotection Product

N-X-A 1OR 1

A 2OR 2(6)

EnzI 1-A 2-OR 2

A 3OR 3(9) EnzII -A 3OR 3

A 4OR 4 EnzIII 1-A 2-A 3-A 4OR 4

Deprotection 1-A 2-

EnzII A 4

A 3OR 3 1-A 2-A 3-A 4Y Deprotection

Product

酶联免疫法与化学发光免疫法检测AFP的比较

酶联免疫法与化学发光免疫法检测AFP的比较发表时间：2013-05-09T17:14:22.000Z 来源：《中外健康文摘》2013年第8期供稿作者：黄海深陈志通唐光定江伟河[导读] 化学发光免疫法检测结果的稳定性，灵敏度，精密度均优于酶联免疫法黄海深陈志通唐光定江伟河（广东省阳山县人民医院检验科 513100）【中图分类号】R446.6 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）08-0125-02 【摘要】目的对甲胎蛋白(AFP)试验进行方法学探讨。方法①对比实验用酶联免疫法和化学发光免疫法同时测定88例临床送检血清标本甲胎蛋白(AFP)的含量。②线性实验将标准液按不同的浓度稀释后做线性实验。③精密度实验用两法对低、中、高值质控品分别进行精密度实验。结果①结果表明，两法无显著差异(P＞0.05)，相关系数r＝0.995，提示两法呈良好相关性。②线性实验显示酶联免疫法和化学发光免疫法分别在5～400 ng/ml和2～900 ng/ml范围内呈良好的线性关系。③精密度实验表明化学发光重复性好于酶联免疫法,特别是病理高值化学发光明显优于酶联免疫法。结论化学发光免疫法的精密度和准确性均优于酶联免疫法。【关键词】酶联免疫法化学发光免疫法甲胎蛋白比较【Abstract】 Object: The methodology investigate of Alpha-fetoprotein (AFP) test. Methods: ①Comparative experiments: The simultaneous determination of the serum samples of 88 patients censorship alpha-fetoprotein (AFP) levels by ELISA and chemiluminescent immunoassay. ②Linear experiments: the standard solution is diluted at different concentrations,then doing linear experiments.③Precision experiments: Doing precision experiments on low, medium and high-value quality control materials with the two methods. Results: ①The results show that no significant difference in the two methods(P＞0.05). The correlation coefficient of r = 0.995, these two methods showed a good correlation. ②The linear experiments show that the enzyme linked immunosorbent assay and chemiluminescence immunoassay showed a good linear relationship between the range in 5～400ng/ml and 2～900ng/ml.③Precision experiments show that the repeatability of chemiluminescent immunoassay is better than the enzyme-linked immunosorbent assay, specifically at the pathological high value. Conclusion: The precision and accuracy of the chemiluminescent immunoassay are better than enzyme linked immunosorbent assay. 【Key words】 ELISA Chemiluminescent immunoassay Alpha-fetoprotein Comparison 甲胎蛋白（AFP）是哺乳动物胚胎期肝脏卵黄囊合成的一种糖蛋白，是辅助诊断原发性肝癌最常用的检测指标。临床上检测AFP的方法主要有放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)、酶联免疫法(ELISA)、荧光免疫法(FIA)、化学发光分析法(ECLIA)等，而近年发展起来的化学发光免疫法因其快速、精确、重现性好及试剂安全无毒的特点，显示出很好的应用前景［1］。酶联免疫法定性检测AFP以其快速、简便、实效的优势在各级医院应用较广。这两种方法临床常用，为进一步了解化学发光免疫法的特点，本文报告用酶联免疫法和化学发光免疫法对比检测88例临床血清标本中AFP的含量，并对结果进行统计分析和比较。 1 材料与方法 1.1材料 1.1.1研究对象：随机抽取88例临床送检血清标本。 1.1.2仪器: 深圳雷杜生命科学股份有限公司RT6100酶标仪，郑州安图生物工程有限公司生产的LUMO化学发光仪。 1.1.3试剂: ①郑州安图生物工程有限公司生产的甲胎蛋白(AFP)测定试剂盒（酶联免疫法） ②郑州安图生物工程有限公司生产的甲胎蛋白(AFP)测定试剂盒（化学发光免疫法） 1.2方法 1.2.1酶联免疫法测定甲胎蛋白(AFP)的操作方法见试剂说明书。 1.2.2化学发光免疫法测定甲胎蛋白(AFP)的操作方法见试剂说明书。 2 结果 2.1 线性实验将标准液按不同的浓度稀释后做线性实验，结果显示酶联免疫法和化学发光免疫法分别在5～400ng/mL和2～900ng/mL 范围内呈良好线性关系。 2.2 对比实验用酶联免疫法和化学发光免疫法同时对受检血清标本进行定量分析。结果表明，两法差异无统计学意义（p＞0.05），相关系数(r=0.995)。表1 两种方法变异系数比较 CV% 酶联免疫法化学发光免疫法受检血清标本 14.27 14.20 2.3 精密度实验用两法对低、中、高值质控品分别进行精密度实验。表2表明化学发光重复性好于酶联免疫法,特别是病理高值化学发光明显优于酶联免疫法。表2 两种方法的精密度对比批内CV% 批间CV% 酶联免疫法化学发光免疫法酶联免疫法化学发光免疫法低值 5.38 3.30 5.68 4.55 中值 6.40 4.95 6.15 5.82 高值 12.49 6.50 13.50 6.88

化学发光法同放射免疫法检测肌酸激酶比较

化学发光法同放射免疫法检测肌酸激酶比较目的探讨化学发光法同放射免疫法检测血清心肌酶的效果。方法选择80例受检者血清样本分别采用化学发光法及放射免疫法检测肌酸激酶，比较两种检测方法的线性范围及检测结果的差异。结果两种方法均具有良好的线性关系，但化学发光法的线性范围大于放射免疫法，两种方法的检测结果无统计学意义（P＞0.05）。结论化学发光法同放射免疫法检测心肌酶谱能够取得相似的检验效果。标签：放射免疫法；化学发光法；血清；肌酸激酶；肌酸激酶同工酶化学发光法是近年来开展的检验手段，检测便捷、灵敏度高，广泛用于激素、酶类等指标的临床检测，近年来临床应用发展较为迅速，部分取代了传统的检验手段，放射免疫法是临床检验心肌酶谱的经典方法，临床应用时间较长，检验效果比较稳定，近年来化学发光法检验心肌酶谱在临床应用逐渐增多[1]，本研究就化学发光法及放射免疫法检测肌酸激酶的效果进行分析，报道如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料选择贵州省铜仁地区医院2009年1月～2010年12月心内科送检的血液标本80份，标本来源患者男37例，女43例，年龄39～64岁，平均（47.0±16.2）岁，均拟诊为心肌梗死，血液标本均为即时送检标本。 1.2 线性分析将标准液分别按12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00和800.00 ng/L 的浓度倍比稀释后，采用蒸馏水做对照，分别采用XAKP-2000A/02型γ计数仪（北京中西远大科技有限公司）进行放射免疫法和化学发光法KL1-e411型全自动化学发光仪（北京中西远大科技有限公司）对标本进行检测，分别对两组检测结果做回归分析，分离两种检测方法的线性范围。 1.3 标本检测血液标本采用低温离心机2500 g/L低温离心，分离血清，分别采用放射免疫法（试剂盒购于天津原子能研究所）及化学发光法（试剂盒购与南京建成生物工程研究所）检测，检测过程严格按照试剂及仪器使用说明书进行。 1.4 统计学处理数据分析采用SPSS11.5统计学软件，检验方法线性分析采用回归分析，计量资料采用t检验，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异具有统计学意义。

化学发光免疫分析法与酶联免疫法检测艾滋病抗体结果比较

化学发光免疫分析法与酶联免疫法检测艾滋病抗体结果比较摘要】目的：分别通过化学发光免疫分析法（CLIA）和酶联免疫法（ELISA）对艾滋病抗体情况进行检测，对两种方法的检测结果进行比较，从而分析两种方法的检测价值。方法：2017—2018年在我院进行HIV抗原抗体筛查的人员，包括有创性诊疗操作前、输血前、孕产妇、门诊、体检等自愿筛查的288名艾滋病高危患者的血清进行检查。结果：CLIA检测阳性率为95.83%，ELISA检测阳性率为 89.93%，两组检测方法阳性率比较，差异显著（P＜0.05）。结论：CLIA检测阳性率高于ELISA，但两方法各有优缺点，因此，临床中可以将两种方法进行结合检测。【关键词】化学分光免疫分析法；酶联免疫法；艾滋病抗体【中图分类号】R512.91 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）12-0038-02 A contrast study of chemiluminescence immunoassay and enzyme-linked immunoassay for detecting HIV antibody He Hua1,Sun Hongmei2(Corresponding author). 1 Department of Blood Transfusion,No.1 Affiliated Southwest Hospital of Military Medical University,Chongqing 400038,China; 2 Chongqing Angel's Obstetrics and Gynecology Hospital,Chongqing 401120,China 【Abstract】Objective To compare the results of chemiluminescence immunoassay (CLIA) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for HIV antibody detection, and to analyze the value of the two methods. Methods From 2017 to 2018, serum of 288 HIV high-risk patients who underwent HIV antigen antibody screening in our hospital, including those who were screened voluntarily before invasive diagnosis and treatment, before blood transfusion, maternal, outpatient and physical examination, were examined.Results The positive rate of CLIA and ELISA was 95.83% and 89.93%, respectively.Conclusion CLIA has a higher positive rate than ELISA, but both methods have their own advantages and disadvantages. Therefore, the two methods can be combined for clinical detection. 【Key words】Chemical spectroscopic immunoassay;Enzyme-linked immunosorbent assay;AIDS antibody 艾滋病是一种对人类生命安全造成严重威胁的传染性疾病，该病属于一种免疫系统缺陷疾病，艾滋病是由HIV病毒（人类免疫缺陷病毒）所引起的疾病，临床中通过对患者血清中的HIV抗体的检测诊断艾滋病。但是，检测方法的准确度也不尽相同，酶联免疫法（ELISA）是一种传统的艾滋病抗体的检测方法，化学发光免疫分析法（CLIA）是一种新兴的检测方法，本次研究，笔者分别通过两种方法对艾滋病抗体进行检测，分析阳性情况，从而对两种方法的检测价值进行评价，现报道如下。 1.资料与方法 1.1 一般资料对2017年1月—2018年12月到我院进行自查的288名艾滋病高危患者进行检查，患者中男性205例，女性83例，最小年龄16岁，最大年龄78岁，平均年龄（46.21±2.0）岁，所有患者均在保证书上签署姓名，实验之前上报我院伦理委员会，并得到批准。 1.2 方法

常见化学发光免疫分析技术比较

常见化学发光免疫分析技术比较 1、化学发光免疫分析化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，英音：[,kemi,lju:mi'nes?ns] [,imju:n?u?'sei] 是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 1.1、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。 1.2、化学发光免疫分析类型

化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种: (1)化学发光标记免疫分析法; (2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法 1.2.1化学发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) , 是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法, 大分子抗原则采用夹心法, 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。 1.2.2化学发光酶免疫分析从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。 12.2.1HRP 标记的CLEIA

乙肝病毒血清学检验采用化学发光法与酶联免疫法的效果对比闫桂敏

乙肝病毒血清学检验采用化学发光法与酶联免疫法的效果对比闫桂敏发表时间：2018-11-21T09:53:06.807Z 来源：《世界复合医学》2018年第09期作者：闫桂敏 [导读] 乙肝病毒血清学检验，采用化学发光法检验结果阳性率高，提高临床对乙肝患者确诊率，能够准确地对乙肝患者进行定性与定量检测，值得在临床上进行推广应用。哈尔滨市传染病院黑龙江哈尔滨 150030 摘要：目的：研究应用乙肝病毒血清学检验采用化学发光法与酶联免疫法的效果对比。方法：选取2018年1月-2018年5月我院门诊以及住院患者中疑似乙肝患者64例作为研究对象。采集空腹静脉血，分别进行化学发光检测法和酶联免疫检测法，观察并对比两种检测方法阳性检出率。结果：采用化学发光法检测的32例疑似乙肝患者中，阳性乙肝患者为17例，阴性患者为15例，化学发光法阳性检出率为51%，显著高于酶联免疫法的36%，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：乙肝病毒血清学检验，采用化学发光法检验结果阳性率高，提高临床对乙肝患者确诊率，能够准确地对乙肝患者进行定性与定量检测，值得在临床上进行推广应用。关键词：乙肝病毒血清学检验；化学发光法；酶联免疫法 Comparison of the effects of chemiluminescence and enzyme-linked immunosorbent assay on hepatitis B virus serological test OBJECTIVE: To compare the effects of chemiluminescence and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) on the serological test of hepatitis B virus. METHODS: Sixty-four patients with suspected hepatitis B in our outpatient clinic and inpatients from January 20 to 2018 were selected as subjects. Fasting venous blood was collected, and chemiluminescence detection and enzyme-linked immunosorbent assay were performed respectively. The positive detection rates of the two detection methods were observed and compared. RESULTS: Of the 32 suspected hepatitis B patients detected by chemiluminescence, 17 were positive for hepatitis B and 15 were negative. The positive rate of chemiluminescence was 51%, which was significantly higher than 36% of enzyme-linked immunosorbent assay. The difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion: Hepatitis B virus serological test, using chemiluminescence test results, high positive rate, improve the clinical diagnosis of hepatitis B patients, can accurately and qualitatively and quantitatively detect hepatitis B patients, it is worthy of clinical application. Key words: hepatitis B virus serological test; chemiluminescence method; enzyme-linked immunosorbent assay 乙型肝炎是慢性传染性疾病之一，是肝癌等肝脏疾病的危险因素之一。我国是乙型肝炎感染人数较多的国家之一，对于我国居民的正常生活有着一定的恶劣影响，因此对其进行及早的治疗有着一定的重要意义。乙型肝炎病毒感染后，无特效药物和治疗方法彻底清除病毒，患者患病后为终身带有病毒。所以，要及时控制乙肝感染率。临床检验应用酶联免疫法和化学发光法检测血清中的乙肝病毒，本文对两种方法检出率进行比较，现报道如： 1.资料与方法 1.1 一般资料选取2018年1月-2018年5月我院门诊以及住院患者中疑似乙肝患者64例作为研究对象。其中男性患者为34例，女性患者为30例；年龄为20-56岁，平均年龄43岁。将64例患者随机地分为两组，每组均含有32例患者，其中一组选择化学发光法进行乙肝病毒血清学检验，另一组患者选择酶联免疫法进行分析，得出两组患者的阳性检出率，以此作为对比分析两种治疗方法的效果。 1.2方法所有患者清晨空腹，两只真空管分别采集静脉血 4 mL，高速离心分离血清备用。其中化学发光法使用罗氏Cobas601全自动电化学发光免疫分析系统，检测患者血清，检测结果由检验医师核对后汇报分析；酶联免疫法则使用双抗体夹心法手动操作，使用乙肝表面抗原检测试剂盒，取出试剂盒常温放置30 min，设置空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔各1个，加入阳性对照、阴性对照标准液或待测样本50μL，加入特异性酶50 μL，封膜，振荡器混匀30 s，37℃水浴箱孵育60 min，洗反应板，加入底物A、B液各1滴，37℃避光孵育15 min，加入终止液1滴。 1.3 统计学方法本次研究所涉及的相关数据均采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计数资料以百分数（%）表示，采用x2 检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 2.结果化学发光法阳性检出率为51%，显著高于酶联免疫法的36%，差异有统计学意义（P＜0.05）。化学发光法检测乙肝病毒的准确性为90%，相较于酶联免疫法75%的准确性更加具有可行度，因而在乙肝病毒的检测中使用化学发光法可以得出更加准确的结果，使乙肝病毒患者能够拥有更加具体的检查，在治疗过程中能够及时地开展相关工作，加快乙肝患者的痊愈速度。 3.讨论目前，乙型肝炎无根治药物和方案。我国乙肝病毒表面抗原携带者占9%，部分患者感染该病毒后，可产生针对乙肝表面抗原的特异性抗体。临床诊断乙肝病毒感染主要是检测乙肝表面抗原、乙肝表面抗原抗体、乙肝病毒核心抗原、乙肝病毒核心抗原抗体等，通常称为“乙肝两对半检测”。本次研究中，化学发光法阳性检出率为51%，显著高于酶联免疫法的36%，差异有统计学意义（P＜0.05）。临床常用酶联免疫法进行定性试验，价格低、操作简便、容易推广和开展。但是酶联免疫法不能进行定量分析，而且操作水平的差异使得假阳性发生率较高。化学发光法能够定性检测的同时进行定量分析，由仪器统一加试剂，降低系统误差，假阳性和假阴性发生率低。本次研究中未发生假阳性和假阴性结果，结果可信。综上所述，乙肝病毒血清学检测使用化学发光法和酶联免疫法均具有一定可行性。其中，化学发光

化学发光方法学比较

免疫学技术的迅速发展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已逐渐无法适应这种形势的需要。现今发展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避免污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的实验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的新纪元。发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。70年代末以来得到了迅速发展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，基本上可以分为：化学发光、时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致发光和电致发光)几种。 1、化学发光化学发光是指在化学反应过程中发出可见光的现象。通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照射，通过吸收化学能(主要为氧化还原反应)，从基态激发至激发态。退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。其主要特点为消耗发光剂。同时量子效率相对较低。 1.1 按化学反应类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过

最，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，即含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短；如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次性测量。所以重复性较差。为降低检测成本并实现重复测量，目前普遍采用原位进样加流动池的时间积分测量方式。因此仪器成本及维护费用较高，而且反复使用的流动池可能导致交叉污染；并目冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外，使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。 1.2 按发光持续时间分类：可分为闪光和辉光两类，闪光型发光时间在数秒内，如吖啶酯系统。其检测方式一般采用原位进样和时间积分法测量，即在检测器部位加装进样器，并保证加入发光剂和检测2个过程同步进行；同时以整个发光信号峰的面积为发光强度。而辉光型发光时间在数分钟至数十分钟以上，如HRP一鲁米诺系统、ALP—AMPPD 系统、黄嘌呤氧化酶-鲁米诺系统等。其信号检测无需原位进样，一般以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域任意点测量单位时间的发光强度。测量化学发光反应的光强度，求得某些化学物质和生物物质的

化学发光与酶联免疫检测血清甲胎蛋白的比较(精)

化学发光与酶联免疫检测血清甲胎蛋白的比较颜多清 442400湖南桂阳县人民医院检验科摘要目的：化学发光与酶联免疫检测血清甲胎蛋白的比较。方法：化学发光法、酶联免疫法，按仪器操作手册各用配套试剂测定质控品。结果：线性实验：化学发光检测更宽；精密度试验：化学发光的重复性较酶联免役法更好。结论：化学发光法与酶联免役法之间差异无显著性，但化学发光法优点更多。关键词甲胎蛋白线性范围精密度化学发光酶联免疫材料和方法标本来源：随机抽取150份临床送检血清标本，包括正常和异常标本，异常标本中超过仪器检测范围的结果不予统计。仪器与试剂：化学发光仪使用Bayer Centaur CP。使用原装配套试剂。酶表仪洗板机使用URANUS AE全自动酶免仪和配套洗板机，严格根据使用说明操作。方法：按仪器操作规程操作，用配套试剂测定，数值在标定值允许的变异范围内，接着做线性、相关性、回收率、精密度测试。结果线性试验：将AFP测定值在1000～1200ng/ml范围内的5份血清标本混合，反复测定5次，取其均值作为原倍血清测定值即为理论值。将此混合血清做5点倍比稀释，随机排列测定顺序，各反复测定5次，以原倍血清测定值为标准按稀释倍数算得其理论值，求两者相关性并进行回归分析。化学发光回归方程为：Y=10235X+65594，R=09999。酶联免疫法回归方程为：Y=06578X+38885，R=09558。化学发光法在2～900ng/ml范围内线性良好，酶联免疫法在5～400ng/ml范围内线性良好，可见化学发光免疫法的检测范围更宽，更能充分满足临床要求。相关性试验：用上述二种方法分别对受检血清标本进行AFP定量分析，结果表明，二种方法差异无显著性（P>005），直线回归方程为：Y=1 0667X-05433，R=09858，提示二种方法相关性良好。回收试验：取三种浓度的血清(1071ng/ml，1808ng/ml，46 83ng/ml)，分别用不同浓度定值血清混合，配制成浓度分别为211ng/ml， 300ng/ml，773ng/ml，278ng/ml，367ng/ml，84 0ng/ml， 538ng/ml，626ng/ml，1100ng/ml的样本，用化学发光法与酶联免疫法测得的回收率分别为961～979和953～97 1，平均回收率为977和964。精密度试验：采取批内和批间差异来确定。用上述二种方法分别对低、中、高值质控品进行精密度试验，每份标本连续测定20次，计算 X，S，求批内CV 值。每日测定1次，连续测定20天，计算X ，S，求批间CV值。结果表明，化学发光免疫法的重复性比酶联免疫法的更好，特别是高值化学发光明显优于酶联免疫法。见表1。

乙肝病毒血清学检验采用化学发光法与酶联免疫法的效果比照观察

乙肝病毒血清学检验采用化学发光法与酶联免疫法的效果比照观察发表时间：2019-03-17T10:53:38.563Z 来源：《医师在线》2018年9月18期作者：于子建[导读] 使患者的乙型肝炎发展得到有效控制，实验室目前主要采用化学发光法和酶联免疫法对乙肝标志物进行检测[2-3]。（勃利县人民医院；黑龙江七台河154500）【摘要】目的：探究乙肝病毒血清学检验采用化学发光法与酶联免疫法的效果比照观察。方法：选取2015年1月到2018年1月间我院接诊的乙型肝炎患者32例作为研究对象，全部患者均采集静脉血，分别采用化学发光法和酶联免疫法进行检测，对比两种检测方式的检测结果。结果：两种检测方法中对HBsAb、HBeAg以及HBeAb检测结果对比，差异不具有统计学意义（P＞0.05）；化学发光法检测HBsAg 和抗-HBc检测显著高于酶联免疫法，统计学有意义（P＜0.05）。结论：化学发光法与酶联免疫法检测乙肝病毒均具有较高的应用价值，化学发光法优势更为明显，值得推广。【关键词】乙肝病毒；血清；化学发光法；酶联免疫法 [ 中图分类号 ]R2 [ 文献标号 ]A [ 文章编号 ]2095-7165（2018）18-0370-01 乙型肝炎主要是由于患者的肝部受到乙肝病毒侵袭所致，且检验结果呈阳性，患者的临床症状主要表现为乏力、恶心、肝区疼痛等症状，若不能够得到有效治疗，严重的患者可伴有肝掌、脾大、肝功能持续异常等症状，并能够引发肝硬化、肝癌等疾病的发生。乙型肝炎是一种传染性疾病，已经受到了世界卫生组织的重视，目前我国为乙型肝炎病毒高发国家，主要采用乙肝两对半实验检测乙型肝炎病毒，并具有较高的诊断准确率，实验室最为广泛应用的方法为酶联免疫法和化学发光法[1]。因此，本文和主要对乙肝病毒血清学检验采用化学发光法与酶联免疫法的效果比照观察进行探究，报告如下。 1资料与方法 1.1一般资料将我院于2015年1月到2018年1月间收治的32例乙型肝炎患者进行实验研究分析，全部患者均采集静脉血，分别采用化学发光法和酶联免疫法进行检测。参与本实验乙型肝炎患者中，15例为男性患者，患者的年龄在18-64岁之间，平均年龄为（41.25±3.77）岁，17例为女性患者，患者的年龄在19-65岁之间，平均年龄为（42.65±3.63）岁。 1.2方法参与本实验的患者均采用相同品牌的试剂盒、并使用相同全自动化学发光分析仪、酶标仪、洗板机等。酶联免疫法：取患者晨起、空腹静脉血，并将表面抗原的定值进行设定，并将血清作为质控，取空白孔一个，阴阳对照孔两个，并对血清标本进行加样、加酶、孵育、洗板等处理，核心抗体检测过程中，需要进行稀释，稀释液可以使用生理盐水，浓度为9%，稀释比例为1:30。酶联免疫法检验过程均符合实验相关操作。化学发光法：血液实验的标本的检测方法前期与酶联免疫法基本相同，在显色环节有所差异，此步骤中与样本中加入化学发光底物液，并在微孔板发分析仪器的指导下，按照相关顺序测定各各孔的发光值，并能够计算出各个标志物的含量。 1.3观察指标对比两种检测方式的检测结果。 1.4 统计学分析全部32例乙型肝炎患者所有数据均行SPSS17.0软件处理，乙肝病毒标志物检出率对比用率（%）的形式表示，行卡方检验，当数据对比呈现为P<0.05的差异性时，统计学意义存在。 2结果两种检测方式乙肝病毒标志物检出率对比，化学发光法检测HBsAb、HBeAg、HBeAb结果与酶联免疫法对比，差异不具有统计学意义（P＞0.05）；化学发光法检测HBsAg和抗-HBc检测显著高于酶联免疫法，存在统计学意义（P＜0.05），见表1。表1 两种检测方式乙肝病毒标志物检出率对比[n(%)] 3讨论乙型肝炎是我国最为常见的传染性疾病之一，乙肝病毒的病原体本身不仅具有传染性，同时还能够使患者发生肝硬化、肝癌疾病，能够威胁患者的生命健康，因此，临床中应通过有效的检测手段诊断乙型肝炎，并能够对乙型肝炎患者采取有效的治疗手段，切断传染源，使患者的乙型肝炎发展得到有效控制，实验室目前主要采用化学发光法和酶联免疫法对乙肝标志物进行检测[2-3]。化学发光法和酶联免疫法是目前检测乙肝标志物的常用手段，两种检测方法各有优缺点。酶联免疫检测法，在检测乙肝标志物过程中，具有成本低、操作简单等优势，并且该种检测方法适合大批量标本检测[4]。但该总检测方式在操作过程中能够受到微孔板的影响，容易使标本受到污染，并且检测过程中所使用的相关试剂仍然存在一定差异性，容易导致乙型肝炎检测结果出现假阳性或假阴性[5]。化学发光法在检测乙肝病毒标志物中具有检测快速、灵敏度高等特点，能够影响检测结果的因素相对较少，具有较高的稳定性，该种检测方式能够减少医疗资源损耗，并能够实现自动化检验，对监测病情以及动态观察乙型肝炎患者的治疗效果有着重要意义，但该种检测方式不适用于大批量检验[6]。从本文探究可知，在检测HBsAb、HBeAg、HBeAb方面两种检验方式并无差异，化学发光法检测HBsAg和抗-HBc检测显著高于酶联免疫法，具有统计学意义（P＜0.05）。综上所述，化学发光法检测乙肝病毒更加具有优势，值得推广。

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点概念化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。原理化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。应用化学发光免疫分析技术（CLIA）各种激素、病毒抗原抗体、肿瘤标志物、感染性疾病、心脏标志物、治疗药物检测等各种抗原、抗体和半抗原时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）应用广泛 1.多肽类：蛋白质、激素（甲状腺激素、甾体类激素）。 2.病原体抗原/抗体 3.病毒性肝炎标志物 4.肿瘤相关抗原 5.药物 6.核酸优缺点

酶联免疫吸附法和化学发光法对甲胎蛋白检测效果的比较

酶联免疫吸附法和化学发光法对甲胎蛋白检测效果的比较发表时间：2013-08-02T11:09:06.187Z 来源：《中外健康文摘》2013年第25期供稿作者：刘雅萍王爱燕 [导读] CL较ELISA稳定性好、敏感性高、重复性好，而ELISA具有经济、在AFP浓度值低于400μg/L时也具有较好的敏感性。刘雅萍王爱燕 (山东潍坊市坊子区人民医院检验科 261200) 【摘要】目的比较ELISA (enzyme linked immuno-sorbent assay)和CL(chemi-luminescence)两种检测方法对AFP检测的稳定性、敏感性及重复性。方法2012年5月以来，我院对120名患者同时采用酶联免疫法以及化学发光法进行AFP检测，分析两种方法对AFP的敏感性、稳定性以及重复性。结果化学发光法具有较好的重复性以及稳定性，当AFP<400μg/L时，ELISA和CL法检测AFP敏感性相似，当AFP>400μg/L时，CL法敏感性高于ELISA（P<0.05）。结论CL较ELISA稳定性好、敏感性高、重复性好，而ELISA具有经济、在AFP浓度值低于400μg/L时也具有较好的敏感性。【关键词】甲胎蛋白酶联免疫吸附法化学发光法肿瘤标志物(Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。最常见的有甲胎蛋白（alpha fetal protein, AFP）和癌胚抗原（carcinoma antigen embryo，CEA）等，其中甲胎蛋白（AFP）被公认为是诊断原发性肝癌的重要肿瘤标志物[1]。甲胎蛋白(AFP)是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，由胚胎期肝脏卵黄囊合成的一种糖蛋白，分子量约70000，含糖40g/L，由96%蛋白质和4%的碳水化合物组成，正常人血清中AFP含量在2-8g/L之间，AFP正常值一般低于25g/L，AFP是诊断肝癌最特异的标志物，是目前最好的可实际用于早期诊断原发性肝癌的指标，可在症状出现之前作出诊断。 1 临床资料 1.1一般资料 2012年5月以来，我院对120名患者同时采用酶联免疫法以及化学发光法进行AFP检测，其中男80例，女40例，年龄45-75岁，平均年龄60岁。 1.2方法对同一患者的血清分别用ELISA和CL法进行AFP检测，每份标本每天检测1次，连续检测20天，比较ELISA和CL在AFP检测上的重复性和稳定性，同时比较ELISA和CL检测AFP的敏感性。 2 结果 2.1AFP敏感性测定：当AFP小于400ug/L时，酶联免疫法与化学发光法在检查数量上，差别不大，不具有统计学意义；当AFP大于400ug/L时，可见化学发光法测定的患者的数量明显高于酶联免疫法，P小于0.05,二者比较具有统计学意义。 2.2 重复性和稳定性测定：采用批内和批间差异进行确定。ELISA和CL两种检测方法分别对低、中、高值质控品进行精密度试验,每份标本连续测定20次，计算均数和标准差,求批内变异系数（coefficient variable，CV）值。每份标本每日测定1次，连续测定20 天，计算均数和标准差，求批间CV值。我们得到的结果CL较ELISA重复性好、稳定性高。 3 讨论 3.1酶联免疫法1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即:酶联免疫吸附法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫技术 (immunoenzymatic techniques) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 [2]。 3.2化学发光现象是一种常见的自然现象，利用化学发光测定化学发光反应反应物、催化剂、增敏剂、抑制剂，偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂的方法叫做化学发光法。化学发光是物质在化学反应过程中，其物质分子吸收化学能产生光的辐射现象。 3.3化学发光法优于酶联免疫法首先CL具有较好的稳定性：CL 是一种特异性化学发光反应,，是当今国内外最新最先进的临床免疫技术的集中体现，根据待测物的不同灵活选择不同的分析技术、分析步骤和分析过程，以达到最佳的检测效果、最高的检测精密度，结果准确可靠，因此具有较好的稳定性；其次CL具有较高的敏感性；最后CL具有较高的稳定性。总之，化学发光法的应用实现了免疫测定的自动化，具有结果稳定可靠、敏感性高、重复性好的优点，显示出具有良好的应用前景，ELISA法具有快速、简便、成本低廉的优点,及在健康体检, 人群普查, 良性肝病患者定期检查中起到很好筛查作用。参考文献 [1] 林英,柳丽娟,林秀珍.荧光酶免定量测定甲胎蛋白的临床评价[J].国际检验医学杂志,2006,27（2）:182-184. [2] 卫生部临床检验中心和中国医院协会临床检验管理专业委员会、《医疗机构临床实验室管理办法》及配套文件.

酶组织化学和组织化学染色

第14章酶组织化学和组织化学染色酶酶是由细胞合成的生物催化剂，它们增加整个过程的反应速率，而自身的数量和特性不会改变。组织化学组织化学被Pearse定义为“用化学或物理的测试方法对细胞和组织中的特定物质、反应基团和酶催化物质进行鉴定、定位和定量的方法”。因此，采用化学方法技术将组织细胞中的物质进行定位，以用于显微观察的过程就是组织化学技术。酶组织化学技术酶组织化学技术是将免疫学和分子生物学相结合的一种组织学技术。组织中酶的表现与其他无活性组织成分完全不同，酶必须是具有活性的。而且，细胞内酶的表达主要取决于酶在活性位点的特定底物和形成不溶物质，这种不溶物质随后变成有色体或不透明体。组织必须尽可能新鲜才适合酶的表达，尸检组织/尸体解剖通常不适合用于研究。经处理不能被用于酶表达的组织要保存在冰箱中。对于大多数酶来说，它们的表达需要新鲜组织（如细胞培养物）或冷冻/晶体组织和冷冻干燥的组织切片，但是，一些酶如碱性磷酸酶或酸性磷酸酶对底物具有抵抗性，因此它们无法表达。定影液冰箱冷却丙酮，并用甲醛盐水或95％乙醇作为缓冲剂，在大多数情况下，冷丙酮用于酶的表达。酶组织化学原理组织化学方法是基于生化反应，含有酶的组织或细胞当置于溶液中时，它们与溶液发生化学反应，产生着色的不溶性产物，然后可以在细胞或组织中评估最终产品的位置和数量。经典组织化学反应通常遵循以下四个原则之一： *简单离子相互作用。 *醛与希夫试剂或银化合物的反应。 *芳香族重氮盐与芳香族残基的偶联。 *底物和酶的转化形成着色沉淀。酶的分类 *氧化还原酶：它是一个大组，由以下亚组组成： -氧化酶：在氧气存在下催化底物的氧化。 -脱氢酶：通过除去氢原子来催化底物的氧化。 -过氧化物酶：通过除去与过氧化氢结合的氢原子来催化底物氧化。 -Diaphoresis酶：通过除去氢原子来催化NADH和NADPH的氧化。 *水解酶：催化引入水中元素成为特定的底物键。 *转移酶：催化两种化合物基团的转移，但不利用也不损失水分。 *裂解酶：催化从底物中去除基团从而形成碳双键。脱羧酶是该组一个亚类。组织化学反应类型主要有四种类型：