水中大肠杆菌的检测方法

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水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法

NIEA E201.54B

一、方法概要

本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ±

1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之

水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。

二、适用范围

本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。

三、干扰

(一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。

(二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。

四、设备

(一) 量筒：100至1000 mL之量筒。

(二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。

(三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。

(四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。

(五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。

(六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。

(七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。

(八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。

(九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。

(十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。

(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在 121℃（压力约15 lb/in 2 或 1.1 Kg/cm 2）灭菌15分钟以上者。

(十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在 160℃达2小时或170℃达1小时以上者。 (十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) pH 计：精确度达0.1 pH 单位。 五、 试剂

(一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在 25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 培养基，应使用市售商品化培养基。

１、 硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth ，简称LST ） 1倍浓度LST 培养基含有下列成份：

胰化蛋白胨（Tryptose ） 20.0g

乳糖（Lactose ） 5.0g

氯化钠（NaCl ）

5.0g

磷酸氢二钾（K 2HPO 4）

2.75g

磷酸二氢钾（KH 2PO 4）

2.75g

硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate ） 0.1g

试剂水

1L

配成2倍浓度（取71.2 g LST 培养基粉末溶于1 L 试剂水），完全溶解后，分取10 mL 注入装有

倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH 值应在 6.8 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。

２、 煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth ，简称BGLB ） 1公升的BGLB 培养基中含有下列成份：

蛋白胨（Peptone ） 10.0g 乳糖（Lactose ） 10.0g

牛胆粉（Oxgall Powder ） 20.0g

煌绿色试剂（Brilliant Green ）

0.0133g

试剂水

1L

取40 g BGLB 培养基粉末溶于1 L 试剂水，完全溶解后，分取5至10 mL 注入装有倒置发酵管之

试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，其pH 值应在7.2 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。

(三) 无菌稀释液

１、 磷酸二氢钾储备溶液

取3.4 g 磷酸二氢钾（KH 2PO 4）溶于50 mL 的试剂水中，俟完全溶解后，以1.0 N NaOH 溶液调

节其pH 值为7.2 ±0.1，然后加试剂水至100 mL ，灭菌（过滤灭菌或121 ℃高温高压灭菌15分钟）后储存于冰箱中备用。4 ± 2 ℃下保存期限为3个月。 ２、 氯化镁储备溶液

取8.1 g 氯化镁（MgCl 2?6H 2O ），先溶于少量试剂水，俟完全溶解后，再加试剂水至全量为100 mL ，

灭菌（过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟）后，储存于冰箱中备用。4 ± 2 ℃下保存期限为3个月。 ３、 无菌稀释液

分别取10 mL 氯化镁储备溶液和2.5 mL 磷酸二氢钾储备溶液再加入试剂水至2,000 mL ，混摇均匀

后，分装于稀释瓶中，经121℃灭菌15分钟，作为无菌稀释液备用。如欲用于水样稀释，分装之无菌稀释液灭菌后体积须为90 ± 2.0 mL 。4 ± 2 ℃下保存期限为3个月。

六、 采样与保存

(一) 盛装水样检验微生物之容器，应使用清洁并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌采样袋，且于采

样时应避免受到污染。水样若含有余氯时，无菌容器中应加入适量之无菌硫代硫酸钠（采取加氯之废水时，每100 mL 水样中加入0.1 mL 、10%硫代硫酸钠可还原15 mg/L 余氯。采取含氯之饮用水水样时，每100 mL 之水样如加入0.1 mL 之3%硫代硫酸钠，可中和之余氯量约为5 mg / L 。）。

(二) 采样前应清洁手部，再行采水样，所采水样应具有代表性。

(三) 运送时水样温度应维持在小于10 ℃且不得冻结，而实验室内保存温度应维持在4 ±2 ℃。

(四) 水样应于采样后24小时内完成推定实验之水样添加步骤（七、步骤(一)４、），并置入培养箱中培养。

(五) 水样量须以能做完所需检验为度，但不得少于120 mL。

七、步骤

试验分两阶段进行。首先进行推定试验，若推定试验结果为阳性反应，则继续进行第二阶段之确定试验，如结果仍是阳性反应则显示有大肠杆菌群存在。各试验步骤如下述：

(一) 推定试验

１、慎选发酵管中没有气泡且未污染之10 mL、2倍浓度LST试管。

２、水样在进行检测或稀释之前必须剧烈摇晃25次以上，以使样品充分混摇均匀。

３、视水样中微生物可能浓度范围进行水样稀释步骤，使用无菌吸管吸取10 mL水样至90 mL无菌稀释液中，形成10倍稀释度水样，混合均匀，而后自10倍稀释度水样以相同操作方式进行一系列适当之100、1000、10000倍等稀释水样，进行稀释步骤时，均需更换无菌稀释吸管，水样稀释步骤如图一所示（注

1）。

４、以无菌吸管分别取各稀释度10 mL水样至内含10 mL 2倍浓度的LST试管中，每一稀释度各作5支，小心混合均匀，混合后发酵管内不可产生气泡。

５、在35 ± 1℃培养箱中培养48 ± 3小时，观察并记录发酵情形，若有气体产生则推定试验为阳性反应，若无气体产生则推定试验为阴性反应，但若培养液呈混浊状态，虽无产气，亦应进行确定试验。

(二) 确定试验

若推定试验之发酵管中有气体或混浊产生时，则使用BGLB进行确定试验：

１、慎选发酵管中没有气泡且未污染之BGLB试管。

２、利用无菌接种环自产生气体以及混浊之LST培养基试管中，接种一圈培养液至BGLB培养基试管中。

３、在35 ± 1℃培养箱中培养48 ± 3小时。

４、在48 ± 3小时内，BGLB 培养基试管如有气体产生，则确定试验为阳性反应。

八、结果处理

(一) 经确定试验确认BGLB试管为阳性反应后，应以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」计算及记

录。5支发酵管连续三种稀释度之MPN可查表一。

(二) 表一所示接种之水样量为10 mL、1.0 mL 及0.1 mL，若所用之稀释度有三种以上时，采用最具意义之三

种稀释度，查表后再计算100 mL水中大肠杆菌群最大可能数。稀释度之选取方式如下：

１、先选取5管均呈阳性反应的最高稀释度（此时稀释度较低之各组试管必须全部呈阳性反应），再选取下两个稀释度（如表二水样别a）。

２、如果稀释度最低的一组并非5管均呈阳性反应，则选取稀释度最低的一组，再选取下两个稀释度（如表二水样别b、c）。

３、如果依据上述原则（１、及２、）选取3个稀释度后，下一稀释度试管组仍有阳性反应试管，则舍弃原先3组中稀释度最低的一组，纳入下一稀释度的数据（如表二水样别d）。

４、如果依据上述原则（１、至３、）选取3个稀释度后，更高稀释度之试管组仍有阳性反应试管，则把更高稀释度之阳性反应试管数加至原先3组中稀释度最高的一组（如表二水样别e）。

(三) 100 mL水中大肠杆菌群最大可能数（MPN/100 mL）之计算公式如下：

结果小于100时，以整数表示（小数字数四舍五入），菌落数大于100以上时，只取两位有效数字：例如110以1.1 × 102表示，16,000以1.6 × 104表示。

(四) 检测纪录须注明采样时间、培养起始及终了时间、培养基名称、培养温度及各稀释度的数据等相关数据。

九、质量管理

(一) 微生物采样人员及检测人员应具备微生物基本训练及知识。

(二) 每批次采样时应进行运送空白。

(三) 每批次或每10个水样需进行试剂空白实验。

(四) 新购入之培养基，每批号均须以大肠杆菌群阳性控制菌株（如E. coli、Enterobacter aerogenes、Citrobacter

freundii）进行测试，以确保数据质量。

(五) 若一季期间水样均未检出大肠杆菌群，则须以大肠杆菌群菌株进行培养基测试，以确保数据质量。

(六) 本方法培养所得之细菌可能具有感染性，检测后之培养基及器皿应经高温高压灭菌处理。

十、精密度及准确度

略

十一、参考数据

(一) APHA. 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st Edition, Section 9221.

American Public Health Association, Washington, D.C.

(二) Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media. 2003. BD Diagnostic Systems.

注1：水样如须稀释，建议于稀释后30分钟内完成检测步骤，以免造成细菌死亡或增生，影响实验结果。

图一水样稀释步骤

表一

三连续稀释度（10 mL、1 mL、0.1 mL）五试管重复测试时，阳性结果组合之MPN指数及95%信赖区间

水中大肠杆菌的检测方法

水中大肠杆菌的检测方法 一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在351 ℃、483小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用范围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。 三、干扰(一)水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。(二)检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备(一)量筒：100至1000 mL之量筒。(二)吸管：有 0、1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。(三)试管：大小约15015 mm之试管或有盖螺旋试管。(四)发酵管（fermentation tube）：大小约229 mm 之玻璃管。(五)稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六)锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。(七)采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。(八)冰箱：温度能保持在42℃者。(九)天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0、01 g；待测物重量不大于2 g

时，须能精秤至0、001 g。()培养箱：温度能保持在351℃者。 (一)高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2 或1、 1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。(二)高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。(三)接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。(四)pH计：精确度达0、1 pH单位。 五、试剂(一)试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。(二)培养基，应使用市售商品化培养基。１、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 1倍浓度LST培养基含有下列成份：胰化蛋白胨（Tryptose） 20、0g乳糖（Lactose） 5、0g氯化钠（NaCl） 5、0g磷酸氢二钾（K2HPO4） 2、75g磷酸二氢钾（KH2PO4） 2、75g硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate） 0、1g试剂水 1L 配成2倍浓度（取 71、2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，

水中大肠杆菌地检测方法

附件 水肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、 48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所 产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。

5.水中大肠杆菌的检测(多管发酵法)

水中大肠杆菌群书的监测（发酵法） 一、试验目的： 1.了解和学习水中大肠杆菌的测定原理和测定意义。 2.学习和掌握水中大肠杆菌的监测方法。 二、试验原理： 水的微生物学的检验，特别是大肠杆菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水的标准规定饮用水中大肠杆菌群书每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。 水中大肠杆菌的检验方法，常用多管发酵发和滤膜法。多管发酵发可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅用于自来水和深井水。操作简洁快速，但不适用于杂质较多，易于阻塞滤孔的水样。 三、试验材料： 1.培养基：乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基 2.器材：灭菌三角瓶、无菌平皿、无菌吸管、无菌试管等。 四、试验内容 第一天： 1.水样的采集

自来水洗将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，在开放水龙头取水流5ｍｈ，以灭菌山角瓶接水取样以备分析。 2.用发酵法检查大肠杆菌 （1）生活饮用水的检验 ①初步发酵试验：在2个各装有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培养液的三角瓶中，以无菌操作各自加水样10ｍｈ。摇匀后，37℃培养24ｈ 第二天： ②平板分离：经24ｈ培养后。特产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMD培养基上），37℃培养18～24ｈ。大肠杆菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。 第三天： ③复发酵试验：将革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同一类型菌群1～3个，37℃培养24ｈ，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。 第四天： ④报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管，查附录1或2，报告每升水样品中大肠菌群数（MPN）

水中大肠杆菌地检测方法

附件 水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释 度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用范围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。

(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在 121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。 (十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在 160℃达2小时或170℃达1小时以上者。 (十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) p H计：精确度达0.1 pH单位。 五、试剂 (一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在 25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 培养基，应使用市售商品化培养基。 １、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 1倍浓度LST培养基含有下列成份： 胰化蛋白胨（Tryptose）20.0g 乳糖（Lactose） 5.0g 氯化钠（NaCl） 5.0g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75g 硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate）0.1g 试剂水1L 配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。 灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配 制培养基。 ２、煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth，简称BGLB） 1公升的BGLB 培养基中含有下列成份：

大肠杆菌检测方法

大肠菌群及检验 、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而就是卫生细菌领域得用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指得就是具有某些特性得一组与粪便污染有关得细菌，这些细菌在生化及血清学方 面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37 C能分解乳糖产酸产气得革兰氏阴性 无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌与阴 沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便与自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动得场所以及有粪便污染得地方，人、畜粪便对外界环境得污染就是大肠菌群在自然界存在得主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其她型别较多。 大肠菌群就是作为粪便污染指标菌提出来得，主要就是以该菌群得检出情况来表示食品 中有否粪便污染。大肠菌群数得高低，表明了粪便污染得程度，也反映了对人体健康危害性得大小。粪便就是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者得粪便，所 以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染得可能性，潜伏着食物 中毒与流行病得威胁，必须瞧作对人体健康具有潜在得危险性。 大肠菌群就是评价食品卫生质量得重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生

工作中。 二、大肠菌群检验方法： 由于大肠菌群指得就是具有某些特性得一组与粪便污染有关得细菌，即:需氧及兼性厌氧、在37 C能分解乳糖产酸产气得革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群得检测一般都就是按照它得定义进行。 目前国内采用得进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准与原国家商检局制订得行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 (一)国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培 养与证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。 36 ± C培养48戈h,观察就是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36 ±1 C培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上得可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36 ±1 C 培养24±2h,观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性得管数，查MPN表，报告每100ml (g)大肠菌群得 MPN 值。

菌落总数、大肠菌群测定方法

菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。

3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等

水中大肠杆菌群检测方法-滤膜法

室內空氣中細菌濃度檢測方法 NIEA E301.10C 一、方法概要 本方法係用將一定體積容量之空氣樣本直接衝擊於適合細菌生長之培養基上。並於30±1o C培養48±2小時生長後，計數培養基上細菌之菌落數，以計算一立方公尺空氣中之總細菌濃度。 二、適用範圍 本方法適用於設有機械通風及空調系統的大樓或辦公、營業場所等室內環境空氣中細菌濃度之檢測。 三、干擾 （一）採樣器操作時流量變異可能影響微粒注入。 （二）空氣體積計算的誤差可能來自流量或採樣時間測量所產生。通常以流量控制設備用以減少空氣體積計算的誤差，此外亦可使 用計時器將採樣時間測量的誤差減至最小。 （三）採樣器不可直接放置於空調進出口下方或正對空調進出口。 四、設備 （一）可攜式衝擊採樣器。 （二）培養箱：溫度能保持30±1o C者。 （三）加熱板：可調溫度，並附磁石攪拌功能者。 （四）天平：能精稱至0.01 g者。 （五）菌落計數器：用於計算菌落數目。 （六）高壓滅菌釜：能以中心溫度121o C（壓力約1 kg/cm2）滅菌15 分鐘以上者。 （七）乾熱滅菌器（烘箱）：用於玻璃器皿等用具之滅菌。溫度能保持160o C達2小時或170o C達1小時以上者。 （八）培養皿：90×15或100×15 mm之滅菌玻璃培養皿或市售無菌塑膠培養皿，底面平滑無氣泡、刮傷或其他缺點者。 （九）三角錐瓶：一般使用250至2000 mL能耐高壓滅菌之硼矽玻璃製品。 （十）冰桶：溫度能保持在4o C者。 （十一）水浴槽：溫度能保持在約48±2o C者。 （十二）無菌操作檯。 （十三）流量校正器。

五、試劑 （一）培養基，選擇適合許多種類之細菌之廣效性之胰蛋白大豆瓊脂培養基（Tryptic Soy Agar），其每一公升培養基組成成分：胰化蛋白腖（Tryptone）15.0 g 5.0 g 大豆蛋白腖（Soytone）或 硫化蛋白腖（Thiopeptone或Thiotone） 氯化鈉（NaCl） 5.0 g 瓊脂（Agar）15.0 g 將上述成分40 g溶於之1公升蒸餾水中pH＝7.3±0.2（在 25o C），經121o C滅菌15分鐘。置於約50o C的水浴槽中，避 免凝結，冷卻至45~50o C，分裝約15 mL之培養基至直徑90×15 或100×15 mm培養皿中，置於室溫下凝固。 （二）70%酒精﹕消毒擦拭用。 六、採樣與保存 （一）採樣點應避免在完全密閉且未設置機械通風及空調系統（或設有獨立機械通風及空調系統）的空間，如雜物間、電氣（機） 房等非污染源頭之位置採樣。 （二）進行大樓採樣規劃時，原則上應涵蓋高、中、低樓層。每樓層至少應採1點，採樣人員可視大樓內不同樓層之公眾使用密 度，增加採樣點數。 （三）執行辦公、營業場所採樣時，應充分考量該場所之不同營運特性。原則上，辦公場所可選擇2至4個不同時段，並平均分配 在辦公時間內採樣；營業場所之採樣時段，應包括室內空氣品 質最惡劣的情況（如人潮最多的時段）。採樣點之佈置應避開 如電梯出入口、走道等人行干擾，或如吸煙區、打印室等其他 污染物干擾的位置，並選擇受干擾影響最小之處採樣。 （四）同一大樓或辦公、營業場所，可能有不同的個別通風及空調系統分區，採樣點應平均分佈於不同分區中。各分區的採樣點應 距離其區隔（如牆壁）或角落最少50公分以上。採樣時，採 樣口之位置應放置於地面約120至150公分之高度。 （五）上述地點如發現有微生物生長痕跡，或曾經遭抱怨有不適感之處，皆應列為優先採樣地點。 （六）採樣時應記錄採樣點環境温度及溼度。 （七）採樣前、後培養基應保存於4o C的冰桶中。 七、步驟

大肠杆菌检测方法

大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工

作中。 二、大肠菌群检验方法： 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

水中大肠杆菌的检测办法

附件水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果， 二、 三、 (一) (二) 四、 (一) (二) (三) (四) (五) (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。

(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。 (十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。 (十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) pH计：精确度达0.1 pH单位。 五、试剂 (一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 5.0g 2.75g 2.75g 配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。 ２、煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth，简称BGLB） 1公升的BGLB 培养基中含有下列成份： 蛋白胨（Peptone）10.0g

大肠杆菌的检测(MPN计数法)

食品微生物检验技术课程综述 大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号： 114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟 大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌 Petrifilm测试法

1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂 2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏

大肠杆菌 菌落总数检测步骤

大肠杆菌及菌落总数检测方法 为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。 下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。 一、大肠杆菌： 1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例） 双料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。 单料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。 2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。

4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后与25g样品混合均匀。（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合） B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。 C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。 D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。 E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。 F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。 G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml吸管取样品液体分别注入双料试管中 H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。 I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。 J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。 二、菌落总数的测定 1、取平板计数琼脂23.5g与100ml灭菌后的蒸馏水混合均

大肠杆菌检测方法的研究

大肠杆菌检测方法的研究 大肠杆菌是人和动物肠道中的常居菌，在食品卫生质量的评价和控制中，通常将其作为指示菌来评价食品粪源性污染的程度。本文简述了大肠杆菌的传统检测方法-滤膜法、多管发酵法、平板计数法等技术，以及一些快速方法-酶底物法、聚合酶技术，这些方法应用缩短了检测流程和时间，为在大工业生产中微生物控制提供了具有时效性的检测技术。 标签：大肠杆菌检测技术食品安全 0 引言 大肠杆菌又称大肠埃希氏菌（Escherichia coli），在1885年由德国细菌学家Theodor Escherich分离出来的，其属于细菌域、变形菌门、γ—变形菌纲，能够在人和动物的肠道中正常寄居，随着人和动物的粪便排出体外。其中五种肠毒素性大肠杆菌与人类疾病相关：肠毒素性、致病性、出血性、侵袭性和粘附性大肠杆菌。乳品中大肠杆菌一旦被检测出，就意味着其受到直接或间接的污染。因此，该菌很早就已经被用作食品粪源性污染的卫生学指标，并相应的出现了大量的检测方法。本研究介绍以往采用的传统方法，及目前所使用的新检测技术。 1 大肠杆菌的生物学特性及其致病性 1.1 生物学特性 大肠杆菌体积约为0.6-0.7μm3两端钝圆的短杆菌，有时会近似球状菌。有些菌株有荚膜或微荚膜，无芽孢，含有4-6根鞭毛，会游动，长有菌毛。该类菌是需氧或兼性厌氧性菌，最适生长温度为37摄氏度。属于单细胞微生物，其结构特点为：细胞壁、细胞膜、细胞质和核质。细胞壁的内测是细胞膜，细胞壁主要由肤聚糖和外部膜结构组成，具有坚韧而富有弹性的膜状结构；细胞膜主要是由磷脂及蛋白质组成；细胞质是细菌进行新陈代谢的场所，含有蛋白质、脂类、水、核酸等物质成份。 1.2 致病性 大肠杆菌一般没有致病性，但当大肠杆菌的菌落数超过人体自身的承受能力时就可能产生疾病隐患。婴儿感染大肠杆菌可能引起新生儿脑膜炎，老人以及免疫力低下的人群可能会引起败血症等疾患；肠道感染时会出现如水泻、带血腹泻、腹绞痛、发烧、呕吐等，严重时，可并发急性肾炎；如果肠道以外的器官被大肠杆菌感染，则可能引起人体肠胃炎、尿道炎、膀胱炎、阑尾炎等。 2 测定方法 传统检测方法：多管发酵法、比浊法、稀释平板计数法等；其特点：不具时

大肠杆菌检测

大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。1.2 冰箱:0～4℃。1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。1.4 天平。1.5 显微镜。1.6 均质器或乳钵。1.7 平皿:直径为90mm。1.8 试管。1.9 吸管。1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。1.13 酒精灯。1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置 36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养 18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 3.4 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 3.5 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。

大肠杆菌的检验方法

大肠杆菌的检验方法 样品制备： 以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。 LST和EC初步筛选： 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于36±1℃培养48±2h。 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。 EMB平板： 取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。 生化试验： 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。 1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。 2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至 13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。 将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。 3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。 4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。 5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：

饮用水大肠杆菌检测方法

1、饮用水中大肠杆菌快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)水样中微生物的收集及其DNA的提取：采用灭菌后的滤膜或滤器过滤水样，在装有无菌水的EP管中，洗涤滤膜，离心，弃上清液，备用；(2)水样中微生物DNA的提取：A、向EP管中加入TE缓冲液，使之重悬；B、加入SDS和蛋白酶K，混匀，温育45min～1h；C、加入氯仿/异戊醇，混匀，离心，将上清液转入一个新EP管中；D、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心，将上清液转入一个新EP管中；E、加入异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心；F、弃上清，沉淀物用乙醇洗涤，晾干；G、将沉淀重溶于TE缓冲液，摇匀；H、用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA模板的0D 值，计算其DNA浓度，计算方法为：DNA浓度(μg/μL)＝OD值260nm×样品稀释倍数×50/1000 I、将基因组DNA模板做好标记，贮存，备用；(3)PCR扩增；反应引物：上游引物：5’-tgttcagtggcaagagtt-3’下游引物：5’-taatcgatatacccgctc-3’50μL反应体系：10×PCR缓冲液5μL Tag酶2U/μL1μL MgCl2(25mM)5μL dNTP(2.5MM)5μL ddH2029μL 上游引物10μM2μL 上游引物10μM2μL 模板DNA1.5μg/μL1μL (4)产物观察：A、凝胶的准备：先配置琼脂糖溶液，加热，使其充分溶解，再加入溴化乙锭溶液；B、配置TAE电泳液；C、倒胶：将配置好的琼脂糖溶液倒入胶板中，待其凝固后，放入电泳槽中；D、电泳：将扩增好的PCR产物与缓冲液按比例混合，加入到凝胶加样孔中，同时加入DNA分子量标准，接通电源，设定电压和电流，开始电泳。E、观察；将扩增产物在紫外光下观察，拍摄图片。

大肠杆菌的检测(最新知识点)

大肠杆菌的检测 食品微生物检验技术课程综 述 大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科11４ 姓名: 张花 学号：１140３１431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟 大肠杆菌Peｔrifilｍ测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌.其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致

病菌的可能性。Pｅtriｆilｍ大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRＢ平板培养基系统,并添加了TTＣ作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用.该方法目前已被多数权威机构认可,并在国内很多实验室开展运用。...感谢聆听... 关键词大肠杆菌Ｐetrｉfｉｌm测试法 1设备和材料 1.1恒温培养箱:36±1℃。 1.2冰箱２~5℃。 1．3恒温水浴箱：44。5±0。２℃。 1．４天平：感量0．１g. １．5均质器 1。6振荡器。 １．7无菌吸管：lｍL(具0。01 mＬ刻度）、10ｍＬ(具0.1mＬ刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL. 1.9 玻璃珠：直径约５mm. 1.1０pH计或pH比色管或精密pH试纸 1。１1试管架。 2。培养基和试剂 2．1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LＳＴ）肉汤。

２。２EＣ肉汤。 ２．3蛋白胨水。 2．4缓冲葡萄糖蛋白胨水(MP-ＶP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液. 2。6无菌生理盐水:称取8．５ｇ氯化钠溶于１000ml 蒸馏水中,121℃高压灭菌15mｉn。 2.71mol／L氢氧化钠(NaＯH ）：称取40g 氢氧化钠溶于100０ml蒸馏水中。 2．81mｏl／L 盐酸（HCI ) :移取浓盐酸90ml,用蒸馏水稀释至1０0０mｌ。 3检验程序 4.样品稀释

饮用水中大肠杆菌的检测方法

饮用水中大肠杆菌的检测方法 (一)水样的采集 供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4h，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。 1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。 2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。 (二)初发酵试验 1.水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。 2.接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL，小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。此即5管法。 3.结果观察：37℃中培养24h后取出观察，观察有无气体(杜汉氏小管内有无气体)和酸产生(培养基有无变色)。在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。 若所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培养和观察。

大肠杆菌的检测方法

大肠杆菌的检测方法 一、大肠杆菌的生物学特性 大肠杆菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 二、培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。 在普通营养琼脂上有3中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株 三、大肠菌群及大肠杆菌测定——MPN法检验流程（FDA BAM）检样50g+450ml稀释液，适当十倍稀释样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL，如没有产气，则报告为阴性；如有产气，

则分别接种BGLB肉汤管（35 ±℃，48 ± 2h）和EC肉汤（44.5±0.5 ℃（水浴培养）24 ± 2h ~48 ± 2h ），对于接种BGLB肉汤管的查MPN表报告结果，验证是否为大肠菌群；对于接种EC肉汤的产气管接种EMB平板（35℃、18~24h）从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气查MPN表报告结果验证是否为大肠杆菌。

大肠菌群测定的操作细则

大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。 1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3 操作步骤 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL 灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。