植物膜蛋白提取方法

植物蛋白质提取方法总汇

植物蛋白质提取方法总汇 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml 2、甘油(Glycerol)75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量) 倒转混匀，置室温10min

膜蛋白提取

1分离组织膜蛋白的方法： 1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。 2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。 3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。 4、收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 2 取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。样品蛋白含量测定采用酚试剂法。 3 我们实验室提取膜蛋白的方法如下： 1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。3．按 2.5毫升（T75）/每瓶或5毫升（T175/ 每瓶加入冰冷的匀浆液（HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM）于离心管中，将溶液和沉淀转移到匀浆器中，匀浆。 4．将匀浆液转入离心管中，加入适量的Tris –HCl (50mM, PH7.4) 4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟。在沉淀中加入同前量的匀浆液，再匀浆，匀浆后加入适量的tris-HCl buffer. 4度18000rpm(40000g)离心，共离心三次。 5．在最后一次离心得到沉淀中按250微升每瓶（T75）或500微升每瓶（T175）加入tris-HCl buffer，匀浆，取50微升匀浆液测量蛋白浓度。 6．按实验要求，将匀浆分装于1毫升的Eppendoff 管中，其于-80oC 冰箱中待用。 主要基于膜蛋白分子量较大，在40000g时易沉降来分离。 做膜蛋白的免疫荧光，可以用荧光抗体染色，然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，具体的protocol可以找到，就不多说了。需要注意的是，要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域，如果是胞外，可以直接染色；如果在胞内，则需要用无水甲醇在-20度处理10min，使细胞膜通透，然后再用抗体孵育，这样抗体才能进入细胞内与蛋白结合。

提取蛋白的常规方法

1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间

植物总蛋白提取

一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）： 1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质 花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-20度2个小时(必要时过夜)，4度25000g离心20min后去上清，用含1%DTT的acetone溶液悬浮沉淀，-20度1个小时,再次离心去上清，将真空干燥的沉淀在等电聚焦缓冲液中(8M urea，20mmDTT,4%CHAPS,2%ampholyte,PH:3-10) 20度震荡1小时，20度25000g离心20min，收集上清，沉淀再次用IEF缓冲液离心收集上清，可为后续试验做准备。 2．苯酚（phenol）提取法 花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，添加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）继续研磨5min,加提取缓冲液（0.1mol/L 8.8 Tr i s –HCl，5mmEDTA,20mmDTT,30%sucrose）。将样本转移至离心管中，4度震荡30min，25000g离心10min，将上层的phenol层转移进另一个试管，将下边的水相层加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）及提取缓冲液，震荡，离心，将再次收集到的phenol与前边收集的混合，加5倍体积的0.1 M ammonium acetate in 100%methanol，在-20度震荡沉淀蛋白质，必要时过夜，4度 25000g离心10min，将沉淀用0.1 M ammonium acetate in 100%methanol及80% acetone各洗两次, 含10mmDTT的80% acetone再洗一次，在每一步中蛋白沉淀都要完全重悬— -20度震荡30min，4度 25000g离心20min，洗剂完成后，沉淀真空干燥，IEF buffer提取蛋白质，如方法1。3．直接IEF buffer提取蛋白质 直接IEF buffer提取蛋白质，花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，然后加入IEF buffer(8M尿素，20mmDTT,4%CHAPS，5mmEDTA，5mmTris base,2%ampholyte,PH:3-10).如方法1。 4．Tris-HCL缓冲液法 花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，加入Tris-HCL缓冲液（50mm,8.8,Tris-HCL, 5mmEDTA,20mmDTT,100mmKCL,2mmPMSF）,在融化后，混合液在4度放30min, 25000g离心20min,收集上清，对沉淀重新提取一次，将收集到的上清混合，用5倍体积的100%丙酮沉淀蛋白质，-20度孵育2h,离心后，用80%的丙酮洗剂沉淀2次，IEF buffer重悬沉淀，方法如1 5．利用Bradford试剂法估测提取的总蛋白浓度，并调整浓度行蛋白电泳，-80度保存。 本人翻译的，具体方法流程见附件原文。 ·

脂肪组织蛋白的提取方法.doc

①用液氮研磨的方法更佳，具体方法可以联系本公司****@***.c*m索取详细资料。 beibokit https://www.wendangku.net/doc/8f778296.html, - 2 - 产品说明书 相关产品： 产品 总蛋白提取试剂盒核蛋白提取试剂盒 膜/胞浆/核蛋白分步提取试剂盒Bradford蛋白定量试剂盒ECL化学发光检测试剂盒细胞蛋白提取试剂盒组织蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒昆虫蛋白提取试剂盒磷酸化蛋白提取试剂盒SDS-PAGE凝胶配制试剂盒总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）植物蛋白提取盒（2D电泳用）细菌膜蛋白提取盒（2D电泳用） 产品号BB-3101 BB-3102 BB-3104 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3122 BB-3123 BB-3125 BB-3126 BB-3105 BB-3702 BB-3181 BB-3183 BB-3187 产品 磷酸化蛋白富集试剂盒膜蛋白提取试剂盒活性蛋白提取试剂盒BCA蛋白定量试剂盒植物核蛋白提取试剂盒细菌膜蛋白提取试剂盒植物总蛋白提取试剂盒植物膜蛋白提取试剂盒

蛋白酶抑制剂混合物真菌蛋白提取试剂盒磷酸酶抑制剂混合物SDS-PAGE上样Buffer 细菌蛋白提取盒（2D电泳用）酵母蛋白提取盒（2D电泳用）线粒体蛋白提取盒（2D电泳用） 产品号BB-3108 BB-3103 BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3127 BB-3311 BB-3703 BB-3182 BB-3185 BB-3191 beibokit https://www.wendangku.net/doc/8f778296.html, - 3 -

第三章植物蛋白质

第五章植物蛋白质 目前，人类在对蛋白质代谢的研究和认识过程中，逐步得出了以下四个方面的结论：（1）任何生物细胞并不会合成全部自身遗传信息中所具有的蛋白质。但那些维持细胞生命活动基本代谢过程所需要的酶和蛋白质是必须合成的。 （2）由于细胞分化作用导致了各种专业化细胞的生成，使得不同的生物细胞所拥有的蛋白质各不相同，而且细胞的专业化可导致某些基本酶和蛋白质的合成终止。例如，在种子中，专门贮存蛋白质的细胞所含有的蛋白质，在叶片细胞中就没有；反之，在叶片细胞中专门进行光合作用的蛋白质在种子中也不存在。 （3）在一个细胞内，其合成和拥有的蛋白质种类，将随着生物的生长发育过程而发生一定的变化。例如，同工酶谱的变化。 （4）由人类DNA测序结果可知，真核生物基因不是一个基因决定一种蛋白质多肽链。由于DNA转录产物RNA可剪接和编辑，因而一个基因可以编码两条以上蛋白质多肽链。 第一节种子贮存蛋白质 人们通常将植物在某发育阶段合成、需保存到另一发育阶段才能发挥作用的蛋白质称为贮存蛋白质（storage proteins）。典型的贮存蛋白质一般都具有水溶性低、细胞中存在量大和脱水状态下几乎无生物活性的特征。 在粮食作物中最重要的种子贮存蛋白主要有两种，即谷类作物种子蛋白和豆类作物种子蛋白。 一、谷类作物种子蛋白 禾谷类种子的胚乳除含有大量淀粉外，还含有许多蛋白质。虽然胚中的蛋白质含量很高，但由于胚比胚乳小得多，所以从种子蛋白的总量上看，大部分蛋白质存在于胚乳中。 禾谷类种子蛋白质的分离提取通常按溶解性不同分为四个组分，即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。其中清蛋白可溶于水；球蛋白则溶于稀盐溶液中。由于这两种蛋白在胚乳中含量较少，所以，有人认为它们可能是种子形成过程中酶蛋白的剩余物，并不是典型的种子贮存蛋白。 禾谷类种子中的蛋白质含量因品种、气候和栽培条件而异，其主要谷类蛋白质含量变化幅度见表1。 由表1可见，燕麦与其它谷物不同，其主要贮存蛋白是一种球蛋白。这种球蛋白由6条α-链和6条β-链组成，α-链分子量为22000Da，β-链分子量为32000Da。 用甲醇、乙醇、异丙醇提取的种子蛋白称为醇溶谷蛋白。它是大部分禾谷类作物种子中最主要的贮存蛋白，而且它常集中分布于一种专门用于贮存蛋白质的特化细胞器——蛋白体

植物蛋白质提取方法

一、植物蛋白质提取 1. TCA-丙酮法 （1）称量一定量的样品置于液氮预冷的研钵中，加少许PVPP，反复加液氮研磨至粉末。 （2）研磨好的样品用10 倍体积（w/V）的10%的TCA-丙酮溶液悬浮，加入0.1 M PMSF、 1 M DTT 至终浓度为1 mM PMSF、10mM DTT，超声5 分钟，于-20℃静置6 小时或 过夜后，4℃，20000g 离心15 分钟，弃上清。 （3）沉淀用10 倍体积于样品的丙酮溶液重悬浮，于-20℃静置1 小时后，4℃，20000g 离 心15 分钟，弃上清。 （4）重复步骤（3）一次。 （5）沉淀用10 倍体积于样品的乙醇/乙醚=1:1 洗，于-20℃静置1 小时后，4℃，20000g 离 心15 分钟，弃上清。 （6）重复步骤（3）一次。 （7）取出沉淀真空干燥约5 分钟，除尽有机溶剂。 （8）按10mg 干粉末加200 微升裂解液的比例，加入1 mM PMSF、10mM DTT，超声5 分钟，充分溶解1 小时，10℃，35000g 离心30 分钟，上清为所需的蛋白溶液。（9）用Bradford 法测定蛋白样品的蛋白浓度。 （10）蛋白样品溶液小量分装，-80℃保存。 注意事项： （1）TCA 有利于去除酚类色素等物质，但不利于蛋白的抽提，使用浓度不宜过高，在后 面丙酮处理中，尽量除去。 （2）蛋白样品保存：样品浓度不宜过高，建议将高浓度样品适度调整，为避免反复冻融 应分装保存，长期保存用-80℃，短期保存用-20℃。 （3）1M DTT：0.1542g DTT 用1ml MilliQ 水溶解，-20℃保存。 （4）0.1M PMSF：0.0174g PMSF 用1ml 异丙醇溶解，-20℃保存。

植物膜蛋白提取方法的研究(2D电泳用)

植物膜蛋白提取试剂盒（2D电泳用） 货号：BB-31841 V2.16 试剂盒组成： 产品组成 BB-31841-1 BB-31841-2 组份编号 规格 50T 100T 试剂A：植物膜蛋白提取液A 25ml 50ml 31841A 试剂B：植物膜蛋白提取液B 250ul 500ul 31841B 试剂C：膜蛋白溶解液C 10ml 20ml 31841C 试剂D：蛋白酶抑制剂混合物 100ul 200ul 31841D 使用说明书 1 1 知识产权： 贝博TM BBproExtra TM试剂盒及其使用方法包含专有技术。 产品简介： 膜蛋白承担各种生物功能，扮演重要角色。膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构，因而妨碍了膜蛋白的功能研究。 贝博TM BBproExtra TM植物膜蛋白提取试剂盒（二维电泳用）是一种基于化学方法的高产膜蛋白提取试剂盒。植物膜蛋白提取试剂盒可以从各种植物中提取膜蛋白，可用于纯化膜蛋白的粗品制备及膜蛋白制备。提取过程简单方便。该试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。 本试剂盒提取的蛋白用于双向电泳。如需要用于报告基因检测、SDS-PAGE电泳检测、Western blotting、凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活分析等下游实验的试剂盒，请联系贝博，选用其它产品号的产品。 使用方法： 1、试剂准备： 每500ul膜提取液A中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。 2、取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200mg植物组织样本用手术剪刀尽可能剪碎，加 入500ul提取液A，用组织匀浆机/匀浆器充分匀浆。 3、匀浆或研磨后加入500ul提取液A，混匀后于一个干净离心管中在2-8℃振荡1小时。 4、将提取液在2-8℃条件下12000g离心5分钟，取上清。 5、在上清中加入5ul提取液B，充分混匀。 6、在37℃水浴10分钟。 7、在37℃ 1000g离心3分钟。 8、此时液体分为2层，小心移除上层部分，吸取下层管底部大约50ul液体。 9、用50-150μl冷的膜蛋白溶解液C溶解下层溶液，即得膜蛋白样品。

膜蛋白的提取方法-全攻略

https://www.wendangku.net/doc/8f778296.html, 膜蛋白的提取方法-全攻略 一、膜蛋白简介 膜蛋白在细胞中扮演着重要的角色：例如被熟知的识别、信号转导、运输等功能，也是用药的理想的靶点，虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。 根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。 (1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。 (2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般只有用去垢剂(detergent)使其膜解后才可分离出来。 附注：使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整合膜蛋白。 二、膜蛋白的提取方法 谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解

https://www.wendangku.net/doc/8f778296.html, 度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取. 但是与胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于膜蛋白是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，然后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS(一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂。 1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过梯度离心得到含有膜蛋白的粗组分。（例如：用液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂，然后差速离心、蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白） 2）用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难。在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定。去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤。虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂。这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题。如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如 triton X-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm 处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂. 将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（<5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 酸溶解法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4℃时所有的蛋白质原则上都溶于Triton X-114水溶液，在温度超过20℃时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。 3 )膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP)：CMP分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量。利用原子散射法研究cAMP的

植物蛋白提取

植物全蛋白提取方法： TCA丙酮沉淀法、Tris-HC1法、Trizol沉淀法提取法。 1 TCA丙酮沉淀法 基于蛋白在酸或疏水条件下变性使蛋白浓缩并去除污染物原理的TCA丙酮沉淀法，最早用于小麦蛋白的提取，是目前提取植物蛋白的常用方法之一。 具有降低次生代谢物质的干扰、减少蛋白降解等优点。 TCA能有效地抑制蛋白酶对蛋白质的水解作用，保证在制样过程中蛋白质不被降解；丙酮溶液能除去样品中的酚类及色素等干扰物质，同时实验过程中采用的高速离心办法能较好地去除多糖的影响。然而该方法的一个最大缺点是蛋白质很难重新溶解，而且样品中的非蛋白成分很难除去，可能会丢失膜蛋白和疏水性蛋白，导致2-DE图谱上有明显的横纵条纹。 在研磨样品时加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)用来吸附样品中富含的酚、醌类物质。它们能通过疏水键与酚类形成复合物，离心可以去除该复合物。然而，TCA丙酮沉淀法中与蛋白共沉淀的污染物在随后的有机溶剂清洗步骤中通常难以去除，可以通过振荡和延长蛋白沉淀在裂解缓冲液中温育时间的方法来增加蛋白的溶解能力。在提取的过程中同时加入了TCA、β-巯基乙醇及DTT 3 种药剂可以更好的抑制蛋白质的水解及去除干扰物质。TCA丙酮提取法耗时少且容易操作，一般作为植物蛋白提取的初始方案，该方法常用于幼嫩组织中蛋白的提取，对更为复杂的植物组织该方法并非最佳选择。但该方法还是在植物蛋白的提取中占有重要位置，很多木本植物的样品应用该方法效果很好，如鹅掌楸叶片、巴东木莲的雌蕊柱头、槟榔叶片、银杏叶片及枝条、茶树叶片及芽、红豆杉的愈伤组织、石斛叶片等。草本植物中的大豆叶片、生菜叶片、黄瓜叶片、番茄子叶、龙胆花芽、灰木相思叶片等应用该方法都获得了较清晰的2-DE图谱。 TCA protein precipitation protocol Stock Solutions: 100% (w/v) Trichloroacetic acid (TCA) recipe: dissolve 500g TCA (as shipped) into 350 ml dH2O, store at RT. Precipitation Protocol: 1. Add 1 volume of TCA stock to 4 volumes of protein sample. i.e. in 1.5ml tube with maximum vol., add 250μl TCA to 1.0ml sample. 2. Incubate 10 min at 4°C. 3. Spin tube in microcentrifuge at 14K rpm, 5 min. 4. Remove supernatant, leaving protein pellet intact. Pellet should be formed from whitish,fluffy ppt. 5. Wash pellet with 200μl cold acetone. 6. Spin tune in microfuge at 14K rpm, 5min. 7. Repeat steps 4-6 for a total of 2 acetone washes. 8. Dry pellet by placing tube in 95°C heat block for 5-10 min to drive off acetone. 9. For SDS-PAGE, add 2X or 4X sample buffer (with or without bME) and boil smaple for 10 min in 95°C herat block before loading smaple onto polyacrylamide gel. 2 Trizol沉淀法 与TCA 丙酮沉淀法相比，Trizol沉淀蛋白质的方法可有效地除去色素、酚类等干扰电泳的化学物质，特别是对植物样品中高丰度蛋白——Rubisco1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，通常简写为RuBisCO）。采用此方法能够减少高丰度蛋白对2-DE结果的干扰。植物样品中高丰度蛋白（如Rubisco）的存在对其他蛋白质，尤其是低丰度蛋白的检测的影响也很大，因此，选择合适的蛋白质制备方法尤其重

植物蛋白提取方法研究进展

植物蛋白提取方法研究进展 研究简介： 本方法介绍了植物样本常见的几种蛋白的提取方法。 使用方法： 一、BBproExtra植物总蛋白提取 1.组织样本： 1、提取液准备：每500ul冷的提取液中加入4ul蛋白稳定剂和2ul蛋白酶抑制剂， 混匀后置冰上备用。 2、取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200mg鲜嫩植物组织样本剪碎，采用以下一 种方法处理： i.加入500ul提取液A后用匀浆机/匀浆器匀浆。 ii.置于研钵中用液氮研磨，研磨后加入500μl冷的提取液A。 iii.加入500ul提取液A直接置冰上研磨。 3、研磨后吸入一个预冷的干净离心管中在冰上或4℃冰箱静置1小时。 4、在4℃，12000rpm以上条件下离心10-15分钟。 5、将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。 上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。 2.细胞样本： 1、提取液准备：每500ul冷的提取液中加入4ul蛋白稳定剂和2ul蛋白酶抑制剂， 混匀后置冰上备用。 2、细胞用PBS洗涤2次。 3、加入细胞体积5-10倍体积的蛋白提取液，振荡1小时。 4、在4℃，12000rpm以上条件下离心10-15分钟。 5、将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。 上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。 3.冻存样本： 1、冻存组织样本参照上述组织样本步骤操作。 2、冻存细胞样本中直接加入5-10倍体积的蛋白提取液，振荡30分钟。 3、在4℃，12000rpm以上条件下离心15分钟。 4、将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。 上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。 二、BBproExtra植物膜蛋白提取 1、每500ul抽提液A中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。 2、取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200mg植物组织样本剪碎，置于研钵中用液氮 研磨。（没有液氮也可直接置冰上研磨即可） 3、研磨后加入500ul提取液，混匀后于一个预冷的干净离心管中在冰上静置2-3小时。 4、将提取液在低温下12000×g离心5分钟，取上清。

蛋白提取方法

蛋白质提取的方法总汇 https://www.wendangku.net/doc/8f778296.html, 2005-4-15 23:00:00 来源：生命经 1、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准 备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 2、植物组织蛋白质提取方法 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm 以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm 以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心 （15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃ 待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 3、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量） 倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量） 振荡，置室温20min 离心： 7500g，5 min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加入100％乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。

植物蛋白质提取方法总汇

1、根据样品重量(1g样品加进3.5ml提取液，可根据材料不同适当加进)，预备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加进提取液中在冰上静置(3-4小时)。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl(PH8)45ml 2、甘油(Glycerol)75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加进样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。 3、加进等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加进裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放进-80℃备用。 药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的往离子水中(终体积为5ml)，使用前再加进1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

目的：WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加进异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量) 倒转混匀，置室温10min 离心：12000g，10min，4度，弃上清 加进0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量) 振荡，置室温20min 离心：7500g，5min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加进100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀

植物总蛋白提取

Extraction, Clean-Up, and Assay of Protein Extraction: Phenol Extraction Followed by Methanolic Ammonium Acetate Precipitation Variation on Hurkman and Tanaka, 1986, Plant Physiology 81:802-806 1. Grind 2 g (0.3g for small scale extractions) of fresh tissue to a powder with liquid nitrogen with a mortar and pestle. Keep the tissue frozen at all times. Transfer the tissue to 50 ml conical tubes (2 ml Eppendorf tubes) and drop into liquid nitrogen if not ready to begin step 2 immediately. 2. Add 5 ml (600 μl) of chilled Tris pH 8.8 buffered phenol and 5 ml (600 μl) of chilled extraction buffer and vortex immediately until all tissue is wet and immediately place sample on ice. Use phenol and extraction buffer only IN THE HOOD. CAUTION: Wear two layers of nitrile gloves when using phenol. Change the outer layer frequently to avoid workspace/instrument contamination. If phenol droplets get on the gloves, change gloves as soon as possible. 3. Vortex on high for 30 min at 4 °C (or periodically chilling on ice). If you have many samples, rotate them between vortexing and chilling in the ice bucket every 60 sec. Adjust the volume of the samples with extraction buffer so that they may be balanced in the centrifuge. 4. Centrifuge 10 min at 5000 g, 4 °C. 5. Remove phenol phase (should be top phase) and transfer to a new 50 ml conical tube (2 ml tube). [If you do not plan to do step 9 then transfer to ultracentrifuge tube.] Use a 1000 μl tip with a 10 μl tip on the end to avoid transferring other layers. Store on ice. 6. Back-extract aqueous phase: Add 4 ml extraction buffer (0 μl) and 4 ml (400 μl) phenol to aqueous phase and vortex until thoroughly mixed (1-2 minutes). Adjust volume with extraction buffer to balance tubes. 7. Centrifuge 10 min at 5000 g, 4 °C. 8. Remove phenol phase and combine with first extraction.

(推荐)细胞组织裂解(提蛋白)方法

第一种方法 蛋白匀浆缓冲液： 50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl 5 mM EDTA 1 % NP-40 1 mM PMSF 操作步骤 直接用这个进行组织匀浆 然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清 作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。 将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。70v 浓缩，150v分离 第二种方法 裂解液配方： 尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤： 取300mg样品在液氮环境下研磨， 加入1ml裂解液混匀， 室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻）， 15000g离心1小时， 取上清测定蛋白质浓度。 在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？ （可以的，最后上胶条的时候可以再加） 不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好） 第三种方法 建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热 做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为 30~50 ug/ul 测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。再用减后的值做标准曲线。查得未知蛋白浓度时，也要用减后的值在标准曲线上查得。 培养细胞 细胞培养于100 mL/L FCS+RPMI1640培养基中，待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集．按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，40 g/LCHAPS，65 mmol/L DTT)，同时加入1 mmol/L苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsufosyl，PMSF)，

膜蛋白抽提

二、蛋白抽提 谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取. 但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS(一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol 等表面活性剂。 1、分离膜蛋白的方法（原则性）： 1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。（例如：michael11液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白） 2 ）用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题.如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如triton X-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂. 将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（<5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，在温度超过20度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。 3 )膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。 层析柱提取https://www.wendangku.net/doc/8f778296.html,/ （参步骤） 4) 顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用Tris 碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。 5)centrifugal protein extraction 原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心 评价：尽管分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。（codegreen）