微生物菌种保藏

1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。

传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。

一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。

传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。

2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。

3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如

①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。

使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。

②砂土保存法：取清洁的砂，过60目筛去掉大砂粒，并用磁铁吸去砂中铁屑，再用NaOH 溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于试管或安瓶管中保持2～3cm深，再经

干热灭菌后，加入1ml菌种培养液，经充分混匀后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂(经HCl预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌，再进行菌种保藏。

③硅胶保存法：以6～16目的无色硅胶代替砂子，干热灭菌后，加入菌液。加菌液时，由于硅胶的吸附热常使温度升高，因而需设法加以冷却。

④磁珠保存法：将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水CaSO4)，上铺玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两年半时间。

⑤麸皮保存法：在麸皮内加入60%的水，经灭菌后接种培养，最后干燥保藏。

⑥纸片(滤纸)保存法：将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥后，置于装有干燥剂的容器内进行保存。

4、悬液保存法：即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的有，

①蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。

②糖液保存法：适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。

5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。

6、冷冻保存法：适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤，而对其它大多数微生物而言，无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结，都会对菌体造成损伤，因此当采用这种保藏方法时，应注意以下几点，

①要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞；

②要选择适宜的培养基，因为某些微生物对冷冻的抵抗力，常随培养基成分的变化而显示出巨大差异；

③要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长；

④最好在菌液内不添加电解质(如食盐等)；

⑤可在菌液内添加甘油等保护剂，以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效。

⑥原则上应尽快进行冷冻处理，但当加入保护剂时，可静置一段时间后再进行处理。

⑦就动物细胞而言，应在－20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温，此后必须尽快降到贮藏温度；而对绝大多数微生物而言，则不必如此，如结构较为复杂的原虫则可在－35℃范围内进行缓慢降温，而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻；

⑧若进行长期保存，则贮藏温度越低越好；

⑨取用冷冻保存的菌种时，应采取速融措施，即在35～40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说，则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后，应尽量避免再次冷冻，否则菌体的存活率将显著下降。

常用的冷冻保存法包括：

①低温冰箱保存法(－20℃、－50℃或－85℃)：低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便，也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多，有些可添加保护剂。此外，也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器内，再放入低温冰箱内进行保存的。

②干冰保存法(－70℃左右)：即将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷冻保存。

③液氮保存法(－196℃)：是适用范围最广的微生物保存法。其操作步骤如下，

a、装安瓶管：使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭菌溶液中，将0.2～1ml的这种溶液分装于安瓶中，或在装有分散剂的安瓶中直接接种，或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。

b、熔封安瓶管：若直接贮存于气相液氮中(－150℃～－170℃)时，则不需熔封。

c、检查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡2～30分钟后，观察有无色素进入安瓶。

d、缓慢冷却：将熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮气以约1℃/min的速度冷却至－25℃左右，也可在－20℃～－25℃的冰箱内缓慢冷却30～60min。

e、速冷：最后浸入液氮中快速冷却至－196℃。

7、冷冻干燥保存法：其原理是首先将微生物冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上，从菌体中除去大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，因此可以达到长期维持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)的保存。

在进行冷冻干燥时，需注意以下几个问题：

a、冷冻干燥前的培养条件：首先检验菌种纯度。一般地说，将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜；菌龄以达到对数生长期为好；若为有芽孢或孢子的微生物，则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好；菌液浓度以高为好，如细菌应达到109～1010/ml。

b、菌株号码等的标记：可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。

c、安瓶的准备：将安瓶在2%HCl中浸泡过夜，自来水冲洗3次后，蒸馏水刷净，干燥，塞棉塞，贴标签，干热灭菌或温热灭菌后，60℃恒温干燥。

d、添加保护剂：常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加

7.5%葡萄糖的血清等等。

8、Bordelli氏法：取干净的小试管(8×60mm)塞上棉塞，灭菌。用灭菌的脱脂牛乳洗脱试管斜面上的菌苔，制成浓厚菌悬液。然后用无菌吸管将菌悬液滴入小试管底部。每管一滴，然后转动小试管使菌液分散在试管底部的壁上。标记菌名。将小试管装在15×150mm

的试管中，在大试管底部事先装上1.5cm高的(P2O5或KOH)，管口用带玻璃管的橡皮塞塞紧，蜡封。将大试管与真空泵连通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱时，将玻璃管熔封，置室温暗处或冰箱保存。

仪器与材料

1、斜面菌种：丝状真菌、酵母菌、芽孢杆菌和无芽孢杆菌各一支。

2、接种用具一套。

3、灭菌物品：1ml、5ml吸管，长滴管，安瓶管，9ml无菌水试管，砂土管，液体石蜡，脱脂牛乳。其中，液体石蜡的处理为1.5kg/cm2压力灭菌1小时或1kg/cm2压力灭菌3次，每次30分钟。接着检查是否彻底无菌，即接入肉汤中检查有无杂菌生长。最后放在60～80℃轰烤以去除水分。脱脂牛乳的处理为2000rpm离心10分钟脱脂，然后0.5kg/cm2压力灭菌20分钟，或间歇灭菌3次，经检查无菌后备用。

4、P2O5，无水CaCl2各一瓶。

5、真空干燥器，真空泵。

方法

1、液体石蜡覆盖法：取待保存的菌种斜面，用5ml无菌吸管向内加入灭菌石蜡，要求液体石蜡高出菌斜面1cm左右，若不够此高度，则常会引起斜面抽干现象。

2、砂土管法：用1ml无菌吸管吸取0.2～0.5ml菌悬液，滴入砂土管中，充分混匀后，将砂土管放入真空干燥器内，抽干，真空干燥器内需放置无水CaCl2。最后，将干燥好的砂土管取出，迅速于火焰上蜡封管口，并在室温下或冰箱中进行保存。

3、冷冻干燥保藏法：

①用灭菌长滴管取出2滴(约0.1ml)无菌脱脂牛乳，置于无菌安瓶管中，然后用另一支无菌滴管取出等体积的浓菌液，同样置于此安瓶管中，充分混匀。

②集中安瓶管，置于100ml烧杯中，将烧杯装进真空冷冻干燥器的钟罩内，开机并开冷却水后，使菌液在－20℃温度下迅速冻结成固体，然后抽真空使水分升华，2小时后，可以停止冷冻并在稍高的温度下进行干燥，直至全干为止。

③最后取出安瓶管，并将其与真空泵连接，再抽真空后，迅速将安瓶管熔封，最后冰箱保存。

4、甘油管保藏法：在5ml菌种保藏管中，将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后，于－20℃冰箱中保存。

微生物菌种保藏及复壮

点击次数：55 发布时间：2011-5-19

5.1. 微生物菌种保藏

在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。

微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。

5.1.1. 蒸馏水悬浮法

这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可用此法保存。

5.1.2. 斜面传代保藏

斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。

5.1.3. 矿物油中浸没保藏

此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3年也应做一次存活试验。

5.1.4. 干燥-载体保藏

此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有机物，用水漂洗至中性，烘干，然后装入高度约1cm的河沙于小试管中，121℃间歇灭菌3次。用无菌吸管将孢子悬液滴入砂粒小管中，经真空干燥8 h，于常温或低温下保藏均可，保存期为1~10年。土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，经风干、粉碎，然后同法过筛、灭菌即可。一般细菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。

5.1.5. 冷冻保藏

冷冻保藏是指将菌种于-20℃以下的温度保藏，冷冻保藏为微生物菌种保藏非常有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了保藏的结果更加令人满意，通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂；同时还要认真掌握好冷冻速度和解冻速度。冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难。

普通冷冻保藏技术(-20℃)：将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，于冰箱的冷藏室中贮藏，或于温度范围在-5~20℃的普通冰箱中保存。或者将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分别接到试管或指管内，严格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力 1~2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。

超低温冷冻保藏技术：要求长期保藏的微生物菌种，一般都应在-60℃以下的超低温冷藏柜中进行保藏。超低温冷冻保藏的一般方法是：先离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞，再用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞，然后加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1~2℃/ min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。

液氮冷冻保藏技术：近年来，大量有特殊意义和特征的高等动、植物细胞能够在液氮中长期保藏，并发现在液氮中保藏的菌种的存活率远比其他保藏方法高且回复突变的发生率极低。液氮保藏巳成为工业微生物菌种保藏的最好方法。具体方法是：把细胞悬浮于一定的分散剂中或是把在琼脂培养基上培养好的菌种直接进行液体冷冻，然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。进行液氮冷冻保藏时应严格控制致冷速度。液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤是先制备冷冻保藏菌种的细胞悬液，分装0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口。然后以1.2℃／min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)。待细胞冻结后，将致冷速度降为1℃／min，直到温度

达到-50℃，将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相 (-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可用如下方法代替：将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。

5.1.

6. 真空冻干保藏

真空冷冻干燥的基本方法是先将菌种培养到最大稳定期后，一般培养放线菌和丝状真菌约需7~10天，培养细菌约需24~28小时，培养酵母约需3天。然后混悬于含有保护剂的溶液中，保护剂常选用脱脂乳、蔗糖、动物血清、谷氨酸钠等，菌液浓度为109~1019个/ml，取

0.1~0.2ml菌悬液置于安瓿管中冷冻，再于减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华至1%~5%，使培养物干燥。最后将管口熔封，保存在常温下或冰箱中。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一，大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。但操作过程复杂，并要求一定的设备条件。

5.1.7. 寄主保藏

适用于一些难于用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。

5.1.8. 基因工程菌的保藏

随着基因工程的不断发展，越来越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由于它们的载体质粒等所携带的外源DNA片段的遗传性状不太稳定、且其外源质粒复制子很容易丢失。另外，对于宿主细胞质粒基因通常为生长非必需，一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。而由质粒编码的抗生素抗性在富集含此类质粒的细胞群体时极为有用。当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。由此看来基因工程菌最好应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。例如，质粒pBR322。它除了能将外源DNA 输入E．coli细胞外，还赋予E．coli细胞Ampr和Tetr。如果在培养基中加入Amp和Tet，则培养时可选择出含pBR322质粒的细胞。

5.2.1. 菌种的退化现象

随着菌种保藏时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗传性状可能得到延续，也可能发生变异。变异有正变(自发突变)和负变两种，其中负变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失均称为菌种的退化。但是在生产实践中，必须将由于培养条件的改变导致菌种形态和生理上的变异与菌种退化区别开来。因为优良菌株的生产性能是和发酵

工艺条件紧密相关的。如果培养条件发生变化，如培养基中缺乏某些元素，会导致产孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变；温度、pH值的变化也会使发酵产量发生波动等。所有这些，只要条件恢复正常，菌种原有性能就能恢复正常，因此这些原因引起的菌种变化不能称为菌种退化。常见的菌种退化现象中，最易觉察到的是菌落形态、细胞形态和生理等多方面的改变，如菌落颜色的改变，畸形细胞的出现等；菌株生长变得缓慢，产孢子越来越少直至产孢子能力丧失，例如放线菌、霉菌在斜面上多次传代后产生“光秃”现象等，从而造成生产上用孢子接种的困难；还有菌种的代谢活动，代谢产物的生产能力或其对寄主的寄生能力明显下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素发酵单位的减少，枯草杆菌产淀粉酶能力的衰退等。所有这些都对发酵生产均不利。因此，为了使菌种的优良性状持久延续下去，必须做好菌种的复壮工作。即在各菌种的优良性状没有退化之前，定期进行纯种分离和性能测定。

5.2.2. 菌种退化的原因

菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子性能下降。一般而言，菌种的退化是一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施而一味移种传代，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后占优势，从而使整个群体表现出严重的退化现象。因此，突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性状的表现就更加明显，逐渐成为一株退化了的菌体。同时，对某一菌株的特定基因来讲，突变频率比较低，因此群体中个体发生生产性能的突变不是很容易的，但就一个经常处于旺盛生长状态的细胞而言，发生突变的机率比处于休眠状态的细胞大得多，因此，细胞的代谢水平与基因突变关系密切，应设法控制细胞保藏的环境，使细胞处于休眠状态，从而减少菌种的退化。

5.2.3. 防止退化的措施

合理的育种选育菌种时所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞；

合理选择诱变剂的种类和剂量或增加突变位点，以减少分离回复；在诱变处理后进行充分的后培养及分离纯化，以保证保藏菌种纯碎。这些可有效的防止菌种的退化。

选用合适的培养基有人发现用老苜蓿根汁培养基培养“5406”抗生菌—细黄链霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌产生菌—藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天门冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物质时，也有防止菌种退化的效果。也有选取营养相对贫乏的培养基做菌种保藏培养基，如培养基中适当限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因为变异多半是通过菌株的生长繁殖而产生的，当培养基营养丰富时，菌株会处于旺盛的生长状态，代谢水平较高，为变异提供了良好的条件，大大提高了菌株的退化几率。

创造良好的培养条件在生产实践中，创造和发现一个适合原种生长的条件可以防止菌种退化，如低温、干燥、缺氧等。在栖土曲霉3．942 的培养中，有人曾用改变培养温度的措施(从20-30℃提高到33-34℃)来防止它产孢子能力的退化。

控制传代次数由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生而表现出来的。所以应尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代降低到最低水平，以降低自发突发的机率。菌种传代次数越多，产生突变的几率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。这要求不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种的移种传代次数，并根据菌种保藏方法的不同，确立恰当的移种传代的时间间隔。如同时采用斜面保藏和其它的保藏方式(真空冻干保藏、砂土管、液氮保藏等)，以延长菌种保藏时间。

利用不同类型的细胞进行移种传代在有些微生物中，如放线菌和霉菌，由于其菌的细胞常含有几个核或甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就没有这种现象发生。有人在实践中发现构巢曲霉如用分生孢子传代就容易退化，而改用子囊孢子移种传代则不易退化；还有人采用灭过菌的棉团轻巧地沾取“5406”孢子进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止退化的效果。

采用有效的菌种保藏方法用于工业生产的一些微生物菌种，其主要性状都属于数量性状，而这类性状恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌种保藏方法以防止菌种退化。

5.2.4. 退化菌种的复壮

退化菌种的复壮可通过纯种分离和性能测定等方法来实现，其中一种是从退化菌种的群体中找出少数尚未退化的个体，以达到恢复菌种的原有典型性状。另一种是在菌种的生产性能尚未退化前就经常而有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以达到菌种的生产性能逐步有所提高。所以这实际上是一种利用自发突变不断从生产中进行选种的工作。具体的菌种的复壮措施如下：

纯种分离采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。

微生物菌种保藏及复壮

微生物菌种保藏及复壮 5.1. 微生物菌种保藏 在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重 要。 微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。 5.1.1. 蒸馏水悬浮法 这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可 用此法保存。 5.1.2. 斜面传代保藏 斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。

因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。 5.1.3. 矿物油中浸没保藏 此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3 年也应做一次存活试验。 5.1.4. 干燥-载体保藏 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡

实验12-微生物菌种常用简易保藏法

实验15 微生物菌种保藏方法 一、实验原理 为了保持微生物菌种原有的各种优良特征及活力，使其存活，和丢失，不污染，不发生变异。根据微生物自身的生物学特点，通过人为的创造条件，使微生物处于低温、干燥、缺氧的环境中，以使微生物的生长受到抑制，新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保藏的目的。 常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备，操作简便易行，故为一般实验室及生产单位所广泛采用。 常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4-5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。 含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油，然后再置于-20或-70℃冰箱内保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且，在-20或-70℃条件下，可大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。 沙土管保藏法，将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制后孢子悬浮液，无菌操作将孢子悬浮液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙土上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 二、操作步骤 (一) 斜面传代保藏法 l．贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。 2．斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。 3．培养细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。

微生物菌种保藏方法

菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要. （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等.其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态.这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果. （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染. 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏.使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分. 由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1～2年,或更长.这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年.但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种. 3、砂土管保藏法 这是一种常用的长期保藏菌种的方法,适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用. 其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛,土用120目筛),按砂与土的比例为(1～2)：1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约1cm,以121℃蒸汽灭菌1～1.5h,间歇灭菌3次.50℃烘干后经检查无误后备用.也有只用砂或土作载体进行保藏的.需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养,再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入

菌种保存方法

菌种保存方法 未知 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水 分（真空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 2．液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。 （2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。 （3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。

国内外微生物保藏中心缩写

ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 SIA 四川抗菌素工业研究所 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS 中国科学院微生物研究所 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 CIVBP 中国兽医药品监察所 YM 云南省微生物研究所 GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCTCC 中国典型培养物保藏中心，武汉大学 CCDM 华中农业大学菌种保藏中心，华中农业大学 CMBGCAS 海洋微生物中心 HKUCC 香港大学保藏中心，香港大学 CUHK 香港中文大学保藏中心，香港中文大学 BCRC 台湾生物资源保藏研究中心，台湾新竹 国外 ATCC(American Type Culture Collection）美国典型菌种保藏中心 ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。 该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。 另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。 NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心 NBRC（IFO）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。 该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。该中心保藏的菌种可出售。 NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心

设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定 以及保藏技术

设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果

菌种的选育

第一章菌种选育 第一节工业常用微生物及要求 一、常见微生物 （一）细菌（bacteria） 发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有： 醋杆菌属（Acetobacter） 乳杆菌属（Lactobacillus） 杆菌属（Bacillus）:α-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。其中最为重要的是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 短杆菌属（Brevibacterium）：谷氨酸 棒杆菌属（Corynebacterium）：谷氨酸 （二）放线菌（actinomyces） 属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。 链霉菌（Streptomyces）：红，金，土，氯，链霉素 小单孢菌属（Micromonospora）：庆大霉素 （三）霉菌（mould） 亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。） 1.曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger）产蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，变异菌株产柠檬酸 米曲霉（A. oryzae）产淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和酱油曲 黄曲霉（A. flavus）产黄曲霉毒素 米曲霉和黄曲霉均为半知菌。 2.青霉属（Penicillum）：例如桔子上的绿色斑点 桔青霉（P. citrinum）：产生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。 3.根霉属（Rhizopus）接合菌

米根霉（R. oryzae） 华根霉（R. chinensis） 酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。 4.红曲霉属（Monascus） 淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。可生产食用红色素。 （四）酵母（yeast） 单细胞真核微生物，低等真菌。 ①酵母属（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） ②假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。可利用糖蜜，土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。 ③毕赤酵母属（Pichia） 产膜酵母，在液面形成白膜，是酿造物和酒类饮料的污染菌。 （五）其它微生物 1.担子菌（basidiomycetes） 即菇类（mushroom）担子菌资源的利用已经引起人们的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。 2. 藻类（alga）是分布极广的一类自养微生物资源，许多国家把它用作人类保健 食品和饲料。从蛋白质产率看，螺旋藻是大豆的 28倍，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20～35倍。 （六）噬菌体（phage）凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业，均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是： ①体积比细菌小的多，可以通过细菌滤器。 ②没有细胞结构，由核酸的蛋白质构成。 ③营专性活物寄生，即只能在特异性寄主细胞中增殖。 烈性噬菌体——引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。 温和噬菌体——随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。

第二章 生产菌种的扩大培养、选育与保藏[1]

第二章生产菌种的扩大培养、选育与保藏 目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；及对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。 种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件： （1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； （2）生理形状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； （4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。 第一节种子的制备过程 在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段： （1）实验室种子制备阶段 （2）生产车间种子制备阶段 一、实验室种子的制备 实验室种子的制备一般采用两种方式： 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液

体培养法。 （一）孢子的制备 1，细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。 2，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时间一般为4~14天。 3，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间为5~14天。 （二）液体种子制备 1，好氧培养 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下： 试管→三角瓶→摇床→种子罐 2，厌氧培养（略） 二、生产车间种子制备 实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。 1，种子罐的作用： 主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 2，种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于： （1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； （2）所采用发酵罐的容积。 比如： 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27℃，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐

微生物菌种保藏方法

微生物菌种保藏方法 1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。 传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。 传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。 2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。 3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如： ①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。

《食品微生物学》授课教案第六章微生物的遗传变异与菌种选育

《食品微生物学》授课教案 第六章微生物的遗传变异与菌种选育 教学目的： 1、掌握微生物基因突变的类型、特点和机制。 2、掌握微生物分离纯化的方法步骤。 3、掌握营养缺陷型突变菌株的筛选方法和具体应用。 教学重点与难点：掌握微生物分离纯化的方法步骤。 教学课时：2学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 微生物在遗传上特点：1、微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。2、很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。3、对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。大多是无性生殖，变异易保留。 一、微生物遗传变异的物质基础 1、证明经典实验 1）转化实验 2）噬菌体T2的感染实验 3）病毒拆开与重建实验 2、遗传物质在细胞中存在方式 1）细胞水平 2）核水平（plasmid）

3）染色体水平 4）核酸水平 5）基因水平（遗传功能单位） 6）密码子水平（遗传信息单位） 7）核苷酸水平（最低突变或交换单位） 质粒种类： 1）F因子（致育因子）：大肠杆菌中发现，含质粒为F+（♂）；无质粒为F-（♀）；质粒DNA整合到染色体上为Hfr. 2）R因子（耐药性）：痢疾杆菌，多价耐药性，耐药信息携带在质粒上。 3）Col因子（大肠杆菌素产生因子） 4）青霉素酶质粒 5）Ti质粒（诱癌质粒）：植物根癌，植物基因工程重要载体。 6）降解质粒：Pseudomonas 二、微生物的基因突变 突变是指遗传物质核酸中的核苷酸顺序突然发生了可遗传的变化。包括基因突变（点突变）和染色体畸变 （一）基因突变 1、类型 形态突变型、生化突变型 营养缺陷型：由基因突变引起某酶合成能力丧失，必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能生长。 致死突变型：基因突变导致个体死亡。

第14章 微生物的保存技术

第14章 微生物的保存技术 工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微 生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例 子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中， 用先进的DNA重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。 微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保 存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样 性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此， 世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的 国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物 菌种保藏委员会（CCCCM）。 微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不 同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造 一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存 的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少 代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能 减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。 与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的 定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。 最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念 冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC在1985年第16版《细菌、噬菌体和rDNA载体目录册》及1987年第17版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000株细菌、噬菌体和rDNA载体及 21 000株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna等 本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜

微生物菌种保藏方法

微生物菌种保藏注意事项 摘要：一般利用菌种的休眠体(孢子、芽孢等)，创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到方法经济、简便 菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。保藏时，一般利用菌种的休眠体(孢子、芽孢等)，创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到方法经济、简便。由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方法保藏较好，要根据具体情况而定。 菌种保藏要获得较好的效果，需注意如下三个方面： 1、菌种在保藏前所处的状态 绝大多数微生物的菌种均保藏其休眠体，如孢子或芽孢。保藏用的孢子或芽孢等要采用新鲜斜面上生长丰满的培养物。菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量。培养时间过短，保存时容易死亡；培养时间长，生产性能衰退。一般以稍低于最适生长温度下培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。 2、菌种保藏所用的基质

斜面低温保藏所用的培养基，碳源比例应少些，营养成分贫乏些较好，否则易产生酸，或使代谢活动增强，影响保藏时间。砂土管保藏需将砂和土充分洗净，以防其中含有过多的有机物，影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒的物质。冷冻干燥所用的保护剂，有不少经过加热就会分解或变性的物质，如还原糖和脱脂乳，过度加热往往形成有毒物质，灭菌时应特别注意。 3、操作过程对细胞结构的损害 冷冻干燥时，冻结速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶，对细胞结构造成机械损伤。真空干燥程度也将影响细胞结构，加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏。细胞结构的损伤不仅使菌种保藏的死亡率增加，而且容易导致菌种变异，造成菌种性能衰退。

菌种的衰退、复壮和保藏

第五节菌种的衰退、复壮和保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。 由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。 一、斜面冰箱保藏法 一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。保存期3月到6月。 二、沙土管保藏法

适合于产孢子或芽孢的微生物。 首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。一般沙80目，土80一100目。 其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。 保存期1年左右。 三、菌丝速冻法 不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。甘油最终浓度为25％。 操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。 四、石蜡油封存法 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。保存期约1年 五、真空冷冻干燥保藏法 是目前国内外较理想的常用方法。其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。菌种可保存5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种M 都适用。所以，都已较普遍地应用。 基本操作：将M制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓿管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封。低温保藏。 保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使M疏松地固定在上面。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。

微生物菌种保藏方法

实验十 微生物菌种保藏方法 [日期：2009- 5-30]来源： 作者：孔庆学 [字体：大 中 小] 实验十微生物菌种保藏方法 菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。 (一)常规保藏方法 1 目的 1.1 了解菌种保藏的基本原理 1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。 2 原理 菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。 3 材料 3.1菌株 待保藏的适龄菌株斜面 3.2培养基 肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。 3.3 试剂 10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。 3.4 器具 用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。 4 流程 斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏

5 步骤 5.1斜面保藏 5.1.1流程 标记试管→接种→培养→保藏 5.1.2步骤 5.1.2.1贴标签 取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.1.2.2斜面接种 将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。 5.1.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.1.2.4保藏 斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一船可保藏三个月至半年。 5.2半固体穿刺保藏 5.2.1流程 标记试管→穿刺接种→培养→保藏 5.2.2 步骤 5.2.2.1贴标签 取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.2.2.2穿刺接种 用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。 5.2.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.2.4保藏 半固体直立柱长好以后，放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。

(生物科技行业类)菌种保存和微生物常识

菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基

消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。 方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。

菌种选育与培养

第三章菌种选育与培养 教学目的：1、熟悉工业发酵常用微生物种类；2、掌握菌种分离、筛选和选育的方法；3、掌握种子扩大培养方法和质量控制方法；4、掌握常规的菌种保藏方法。 教学方法：讲授 教学手段：使用多媒体课件 教学内容： 第一节重要工业微生物的分离及菌种要求 1、微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。 2、有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。 3、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 4、由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。 一、工业生产常用的微生物 1、细菌（bacteria）：枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等； 2、酵母菌（yeast）：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等； 3、霉菌（mould）：根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等； 4、放线菌（actinomycetes）：链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等； 5、担子菌（basidiomycetes）：通常所说菇类（mushroom）微生物，用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发； 6、藻类（algae）：用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻；可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能。 二、微生物工业对菌种的要求 目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求： 1、原料廉价、生产迅速、目的产物产量高； 2、易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短； 3、抗杂菌和噬菌体的能力强； 4、菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。 三、重要工业微生物的分离 分离是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。

实验室菌种保存方法

实验室菌种保存方法 1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。 传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。 传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。 2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。 3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如： ①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。