第二十四章免疫细胞的分离与检测Chapter24SeparationandAssays
第二十四章免疫细胞的分离与检测
Chapter 24 Separation and Assays for Immunocyte
第一部分教学内容和要求
一、目的要求
·掌握：Ficoll-hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测，NK细胞的活性、中性粒细胞、巨噬细胞功能的检测方法；熟悉：T细胞功能的体内试验、T细胞介导的细胞毒检测的方法；了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。
二、教学内容
1。免疫细胞的分离与纯化：细胞的分离，外周血单个核细胞的分离，淋巴细胞的纯化与亚群分离，吞噬细胞的分离。
2。淋巴细胞的数量检测：T细胞数量检测，B细胞数量检测。
3。淋巴细胞的功能检测：T细胞功能检测，B细胞功能检测，NK细胞活性测定。
4．吞噬细胞功能检测：中性粒细胞功能检测，巨噬细胞功能检测。
第二部分测试题
一、选择题
（一）单项选择题（A型题）
1．外周血中的单个核细胞主要是指
A．淋巴细胞B．嗜酸性粒细胞C．单核细胞-淋巴细胞
D．单核细胞E．中性粒细胞
2．分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为
A．1.030 B．1.035 C．1.092 D．1.020 E．1.077
3．用Ficoll-hypaque分层液分离PBMC，分离的PBMC层位于试管的
A．血浆层之上B．血浆层之中C．血浆层与分层液之间
D．分层液之中E．试管底部
4．用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex-G10柱分离细胞时，从柱上洗脱下的细胞主要是A．粒细胞B．淋巴细胞C．单核细胞D．T细胞E．B细胞
5．能与SRBC结合形成E花环的细胞主要是
A．T细胞B．B细胞C．单核细胞D．粒细胞E．血小板
6．用小鼠抗人CD3单克隆抗体检测T细胞，其结果代表的是
A．T细胞总数B．Th细胞数C．Ts细胞数D．CD4+细胞数E．CD8+细胞数
7．用尼龙棉柱分离细胞时，不易黏附尼龙棉纤维而被洗脱的细胞是：
A．粒细胞B．B细胞C．单核细胞D．T细胞E．血小板
8．表示淋巴细胞的活力常用
A．活淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比B．活细胞浓度C．淋巴细胞浓度
D．活细胞和总细胞的比值E．T细胞和B细胞的比例
9．用腹腔渗出法可从动物的腹腔渗出液中分离出
A．血小板B．B细胞C．单核细胞D．T细胞E．巨噬细胞10．活细胞经台盼蓝染色后呈
A．蓝色B．棕色C．红色D．不着色E．天青色
11．荧光标记法计数外周血B淋巴细胞，检测的特有的表面标志是
A．CD19 B．CD20 C．补体受体D．SmIg E．FcR
12．NK细胞特有的表面抗原是
A．CD2 B．CD16 C．无特异的表面抗原D．CD23 E．CD56 13．仅能使T细胞发生淋巴母细胞转化的因子是
A．PHA B．PWM C．LPS D．ConA E．EBV
14．能使B细胞和T细胞发生淋巴母细胞转化的因子是
A．PHA B．PWM C．LPS D．SPA E．EBV
15．检查体液免疫功能最常用的方法是
A．血清免疫球蛋白定量测定B．溶血空斑试验C．B淋巴细胞计数
D．淋巴母细胞转化试验E．SmIgG测定
16．溶血空斑试验用于检测下列何种细胞的功能？
A．T细胞B．B细胞C．中性细胞D．吞噬细胞E．NK细胞17．测定T淋巴细胞功能的体内试验是
A．锡克试验B．狄克试验C．结核菌素试验
D．天然血型抗体滴度E．血清IgG测定
18．正常人外周血T淋巴细胞转化率为
A．＜40% B．40~50% C．60~80% D．80% E．＞90% 19．常用检测细胞毒效应的方法是
A．3H-TdR掺入法B．125I释放法C．51Cr释放法
D．形态学检测法E．CD8检测法
20．包被有抗Ig抗体的亲和板，其吸附的是
A．T细胞B．B细胞C．NK细胞D．NKT细胞E．吞噬细胞21．Ficoll-hypaque液分离淋巴细胞是一种
A．不连续密度梯度离心法B．连续密度梯度离心法C．亲和层析法
D．离子交换层析法E．自然沉降法
22．Ficoll-hypaque淋巴细胞分离液的主要成分是
A．聚蔗糖B．泛影葡胺C．聚乙二醇
D．聚蔗糖+泛影葡胺E．聚蔗糖+聚乙二醇
23．Percoll分离液的主要成分是
A．聚蔗糖B．泛影葡胺C．聚乙二醇
D．聚乙烯吡咯烷酮E．经聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒
24．检测中性粒细胞杀菌功能的方法是
A．NBT还原试验B．白细胞计数C．溶血空斑试验
D．淋巴母细胞转化试验E．补体介导的细胞毒试验
25．MTT比色法检测IL-2活性，下列哪项是错误的？
A．需要IL-2依赖细胞株
B．增殖细胞具有吸收MTT的能力
C．颜色的深浅代表细胞代谢活性的强弱
D．可反映B细胞的功能
E．可反映T细胞的功能
（二）多项选择题（X型题）
1．淋巴细胞分离液要求符合的条件有
A．对细胞无毒B．高渗C．不溶于血液D．无色E．有合适的比重2．与T细胞计数有关的表面抗原是
A．CD2 B．CD3 C．CD4 D．CD8 E．CD19
3．与B细胞计数有关的表面标志是
A．SmIg B．CD19 C．CD20 D．CD21 E．CD2
4．符合淋巴母细胞转化的形态学特征有
A．细胞体积变小
B．核仁明显、核染质疏松
C．可见有丝分裂
D．胞浆极少，呈天青色
E．胞内可见空泡
5．用酶联免疫斑点试验检测B细胞功能的优点有
A．稳定、特异
B．可检测抗体分泌细胞
C．可检测抗体的分泌量
D．可同时进行B细胞计数
E．可同时检测不同抗原诱导的不同抗体的分泌
6．细胞免疫功能测定包括以下哪些？
A．T细胞计数B．B细胞计数C．T细胞功能测定
D．Tc细胞效应测定E．细胞因子测定
7．检测淋巴细胞亚群常用的方法有
A．免疫荧光法B．流式细胞仪测定C．酶免疫组化法
D．放射免疫法E．免疫金染色法
8．细胞免疫功能体内试验方法有
A．细胞毒试验B．混合淋巴细胞反应C．皮肤试验
D．淋巴细胞增殖试验E．接触性过敏试验
9．T细胞增殖试验常用的检测方法有
A．流式细胞仪法B．形态学方法C．51Cr释放法
D．MTT检测法E．3H-TdR掺入法
10．检测吞噬细胞功能的方法有
A．吞噬试验B．杀菌试验C．NBT还原试验
D．化学发光测定法E．趋化功能测定法
11．淋巴细胞亚群的分离方法有
A．E花环分离法 B．尼龙棉柱分离法 C．亲和板结合分离法
D．免疫磁珠分离法 E．超速离心分离法
12.T细胞数量检测包括
A. T细胞增殖试验
B.间接荧光免疫法
C.酶免疫组织化学法
D.微量细胞毒试验
E.花环技术
13.检测T细胞数量的花环试验有
A.酵毌菌花环试验
B.补体C3b花环试验
C.E花环试验
D.葡萄球菌花环法
E.抗体致敏细胞花环法
14.B细胞表面具有
A.mIg
B.CD抗原
C.Fc受体
D.补体受体
E.EB病毒受体
15.B细胞数量检测的方法包括
A.mIg的检测法
B.CD抗原检测法
C.Fc受体检测法
D. 补体受体检测法
E.小鼠红细胞受体检测法
16.B淋巴细胞功能的测定方法有
A.B细胞增殖试验
B.溶血空斑试验
C.酶联免疫斑点法
D.体内测定法
E.形态学检查法
17.中性粒细胞吞噬和杀菌功能的测定方法
A. 形态学检查法
B. 显微镜检查法
C. 溶菌法
D. NBT还原试验
E. 化学发光测定法
18.巨噬细胞功能的检测方法包括
A.炭粒廓清试验
B.吞噬功能检测
C. 巨噬细胞溶酶体酶测定
D.细胞毒作用测定
E. 巨噬细胞促凝血活性测定
二、填空题
1．PBMC包括和。
2．在反相溶血空斑试验中，每一个空斑代表一个。
3．B细胞表面特异的标志有。
4．常用的测定淋巴细胞活力的方法是。
5．淋巴细胞转化情况的判定方法有、和。
6．淋巴细胞转化试验应用的同位素是，细胞毒试验应用的同位素是。7．分离外周血白细胞常用的方法是和。
8．去除白细胞悬液中残留红细胞的常用方法有和。
9．去除单个核细胞悬液中单核细胞的常用方法有和。
10．检测T细胞数量的花环技术包括、和；检测B细胞数量的花环技术主要有和。
三、名词解释
1．外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）
2．E花环试验（erythrocyte rosette test）
3．淋巴母细胞转化试验(lymphoblast transformation assay)
4．溶血空斑试验(hemolytic plaque assay)
5．四唑氮蓝还原试验(nitroblue terazolium recovery assay，NBT还原试验)
四、问答题
1．简述T淋巴细胞转化的试验原理和镜下淋巴细胞转化形态学特征。
2．简述Ficoll-hypaque分离液分离PBMC的原理、步骤和注意事项。
3．叙述T细胞介导的细胞毒试验的原理、意义和方法分类。
4．测定吞噬细胞功能有哪些常用方法？
第三部分参考答案与题解
一、选择题
（一）单项选择题（A型题）
1.C
2.E
3.C
4. B
5. A
6.A
7.D
8.A
9.E 10.D
11.D 12.C 13.A 14.B 15.A 16.B 17.C 18.C 19.C 20.B
21.A 22.D 23.E 24.A 25.D
（二）多项选择题（X型题）
1.ACDE
2.ABCD
3.ABCD
4.BCE
5.ABCDE
6.ACDE
7.ABCE
8.CE 9. BDE 10.ABCDE 11.ABCD 12.BCDE 13.CDE 14.ABCDE
15.ABCDE 16.ABCD 17.BCDE 18.ABCDE
二、填空题
1. 淋巴细胞、单核细胞。
2. 分泌Ig的细胞。
3. SmIg。
4. 台盼蓝染色法。
5. 形态学方法、3H-TdR掺入法、MTT检测法。
6. 3H，51Cr。
7. 自然沉降法、聚合物加速沉降法。
8. 无菌蒸馏水低渗裂解法、0.83％氯化铵处理法。
9. 粘附去除法、羰基铁粉吞噬去除法。
10. E花环试验、葡萄球菌花环法、抗体致敏红细胞花环法，EA花环试验、EAC花环试验。
三、名词解释
1．PBMC：外周血单个核细胞主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T
细胞和B细胞分离纯化的重要环节。
2．E花环试验：T细胞表面有特异性绵羊红细胞(SRBC) 受体，即E受体。将T细胞与SRBC按一定比
例混匀，置4℃至少2h或过夜，T细胞表面的E受体能与SRBC结合形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC
的花环样结构，镜检计数可得总花环(Et)形成率，亦即T细胞的百分率。
3．淋巴母细胞转化试验：细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞出现一系列的增殖反应，主要
表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，并发生形态返祖变化，如细胞变大、胞质增多、胞质出现空泡、核染
色质疏松、核仁明显，这种淋巴细胞增殖反应又称淋巴细胞母细胞转化(lymphoblast transformation)。
4．溶血空斑试验：该方法用于检测实验动物抗体形成细胞数目。其基本原理是抗体形成细胞分泌的Ig与SRBC上的抗原结合，在补体作用下出现溶血反应。方法是将SRBC与其免疫的小鼠脾细胞、补体及适量
琼脂糖液混合倾注平板，或者将吸附有已知抗原的SRBC与待检B细胞、补体及适量琼脂糖液混合倾注平板，温育一定时间，抗体形成细胞释放的抗体会使周围SRBC致敏，并在补体作用下出现肉眼可见的溶血
空斑，每一空斑中央含有一个抗体形成细胞，因此空斑数量即代表抗体形成细胞数。
5．NBT还原试验：活化的中性粒细胞与NBT一起温育，由于中性粒细胞吞噬杀菌过程中产生超氧阴离子
（O －
2），使被吞进细胞内的NBT由原来呈淡黄色还原成不溶性的蓝黑色颗粒,沉积在细胞浆中，称为NBT
阳性细胞。光学显微镜下计数NBT阳性细胞，其百分率可反映中性粒细胞的杀菌功能。
四、问答题
1．T淋巴细胞转化试验原理：T淋巴细胞在受到非特异性有丝分裂原或特异性抗原刺激后能发生增殖反应，细胞代谢旺盛，蛋白质和核酸合成增加；与此同时细胞体积增大，分裂呈母细胞样，此为淋巴细胞转化现象。因此可借助形态学方法观测淋巴细胞形态变化情况，3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法测定DNA合成情况，或MTT比色法测定线粒体代谢活性即可判定淋巴细胞转化程度。
镜下淋巴细胞形态可以见到以下几种类型。
(1)淋巴母细胞胞体比未转化淋巴细胞大3~4倍，呈圆形或椭圆形，胞浆染色淡蓝，可有伪足、空泡，细胞核增大，核质疏松，呈细网状，可见分裂现象。
(2)过渡型淋巴细胞形态介于淋巴母细胞和正常淋巴细胞之间，体积稍大，多为12~15 m，胞浆稍多，淡蓝色，核稍大，核质疏松。注意与大淋巴细胞区别，后者虽然体积较大，但核质致密，胞浆较少，嗜碱性强。
(3)正常淋巴细胞与未经刺激的淋巴细胞一样，体积小，核质致密，胞浆少，嗜碱性强。
2．Ficoll-hypaque分离液分离PBMC的原理：血液单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。人外周血单个核细胞的密度为 1.050~1.077，而粒细胞和红细胞的密度在 1.080~1.110。利用密度为 1.077±0.001的Ficoll-hypaque分层液，将待分离的细胞悬液小心铺于其上，经离心后单个核细胞悬浮于分层液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底，据此可将血液中的单个核细胞与其他细胞分离开。
Ficoll-hypaque分离液分离PBMC的步骤：
（1）取静脉血，加肝素溶液抗凝，再加入等量Hanks液，混匀。
（2）取分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2:1~3:1为宜。
（3）置水平离心机中离心2000r/min 20min。
（4）离心后从离心管底部到液面分为五层，依次为红细胞沉淀层、粒细胞层、分层液层、白雾状单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
（5）用滴管直接吸出单个核细胞层，置于另一离心管中。
（6）加入5倍量以上的Hanks液，充分混匀，离心1000r/min 10min。离心后倾弃上清液，再用Hanks 液洗涤2次。
（7）用含10％~20％灭活小牛血清的Hanks液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝染色检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。
注意事项：
（1）将血液适当稀释，减低血液粘稠度有利于提高单个核细胞的收获率。
（2）温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18~25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。
（3）分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。
（4）将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。
（5）分离时的转速与时间应根据不同标本作相应调整。离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间；若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或缩短离心时间。
3．细胞毒T细胞(CTL)在体外能特异性杀伤带有相同抗原的某些敏感传代瘤细胞株(靶细胞)。将适当的靶细胞悬液按一定比例与受检淋巴细胞混合，培养数小时后观察靶细胞的破坏情况可判断受检者的CTL杀伤能力，进而判断其细胞免疫状态。常用方法有形态学检查法和51Cr释放法。
CTL杀伤功能测定是体外检测机体细胞免疫功能的一种常用方法。利用靶抗原与淋巴细胞的相互关系阐明靶细胞的抗原性；用于判断肿瘤患者的预后及免疫治疗效果；观察药物、肿瘤抗原以及其它抗原对CTL 杀伤功能的影响；鉴定淋巴细胞的功能性亚群等。
4．吞噬细胞功能测定从趋化、吞噬和杀菌三个方面进行检测。常用的方法：趋化功能测定的有滤膜渗透法、琼脂平板法，吞噬功能测定的有吞噬试验，杀菌功能测定的有NBT还原试验、杀菌功能试验、化学发光试
验等方法。
(张学宁)
免疫细胞的分离及表面标志检测技术免疫细胞功能
第十四章免疫细胞的分离及表面标志检测技术 第十五章免疫细胞功能检测技术 Separation and Assays for Immunocyte 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：Ficoll—hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、 方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测，NK细胞的活性、中性粒细胞、巨噬细胞功能的检测方法；熟悉：T细胞功能的体内试验、T细胞介导的细胞毒检测的方法；了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。 二、教学内容 1．免疫细胞的分离与纯化：细胞的分离，外周血单个核细胞的分离，淋巴细胞的纯化与亚群分离，吞噬细胞的分离。 2．淋巴细胞的数量检测：T细胞数量检测，B细胞数量检测。 3．淋巴细胞的功能检测：T细胞功能检测，B细胞功能检测，NK细胞活性测定。 4．吞噬细胞功能检测：中性粒细胞功能检测，巨噬细胞功能检测。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1．外周血中的单个核细胞主要是指 A．淋巴细胞 B．嗜酸粒细胞 C．单核细胞一淋巴细胞 D．单核细胞 E．中性粒细胞 2．分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为 A． 1.030 B． 1.035 C． 1.092 D． 1.020 E． 1.077 3．用FicolI—hypaque分层液分离PBMC,分离的PBMC层位于试管的 A．血浆层之上 B．血浆层之中 C．血浆层与分层液之间 D．分层液之中 E．试管底部 4．用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex-G10柱分离细胞时，从柱上洗脱下的细胞主 要是 A．粒细胞
免疫细胞分离及检测技术
第十三章免疫细胞分离及检测技术 本章考点 1.免疫细胞的分离 2.淋巴细胞表面标志的检测 3.淋巴细胞功能检测技术 4.免疫细胞检测的临床意义 第一节免疫细胞的分离 一、外周血单个核细胞的分离 1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。 2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种 （1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。见下图。 图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图 引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷 （2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。 图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图 引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷
免疫细胞的分离及其表面标志检测技术题库1-0-8
免疫细胞的分离及其表面标志检测技术题 库1-0-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]从单个核细胞中去除单核细胞最便捷的方法是（） A.E花环沉淀法 B.尼龙棉吸附法 C.亲和板结合法 D.黏附贴壁法 E.免疫磁珠 单核细胞具有黏附玻璃、塑料、尼龙毛的特性，通过黏附贴壁法可去除单个核细胞中的单核细胞，从而获得纯淋巴细胞。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]能长期保存分离细胞的方法是（） A.含10%～20%灭活小牛血清的Hanks B.液氮深低温（-196℃）保存 C.Tc-199 D.RPMI1640 E.4℃保存 液氮深低温-196℃能长期保存分离细胞，需加入二甲亚砜作为保护剂。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]哪一种分化抗原又称作绵羊红细胞受体（） A.CD2 B.CD3 C.CD4 D.CD8 E.CD28 CD2表达于全部人T细胞和NK细胞表面，因其能与绵羊红细胞结合，又称绵羊红细胞受体。https://www.wendangku.net/doc/9017850244.html,/ 英超直播
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]细胞毒T细胞的标志性抗原为（） A.CD3+、CD4+、CD8+ B.CD3+、CD4+、CD8- C.CD3+、CD4+、CD25+ D.CD3-、CD4-、CD8+ E.CD3+、CD4-、CD8+ CD3+、CD4-、CD8+为细胞毒T细胞；CD3+、CD4+、CD8+为辅助性T细胞；CD3+、CD4+、CD25+为调节性T细胞。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]单核巨噬细胞的典型的表面标志是（） A.CD2 B.CD3 C.CD14 D.CD16 E.CD28 单核巨噬细胞的典型的表面标志是CD14。
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术 用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为 1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的
免疫功能评估报告
免疫功能评估 解读 重庆斯德姆生物技术有限公司干细胞与再生医学技术研究院重庆再生医学与健康技术研究院
2018 年美国免疫学家詹姆斯·艾利森(James P.Alison) 和日本免疫学家本庶佑 (Tasuku Honjo) 因为在抑制消极免疫调节机制的研究 中发现了新癌症疗法作出的贡献，荣获年度诺贝尔生理学或医学奖。 詹姆斯·艾利森发现阻断CTLA-4 能够激活免疫系统的T 细胞，激活的 T 细胞会重新攻击癌细胞。 本庶佑首先鉴定PD-1 为活化 T 淋巴细胞上的诱导型基因，这一发现为 PD-1 阻断建立癌症免疫治疗原理作出了重大贡献。曾在201 3 年被《 Science 》评为年度十大科学突破之首。
2011 年美国免疫学家和遗传学家布鲁斯·博伊特勒(Bruce A.Be utler) 、卢森堡科学家朱尔斯·霍夫曼 (Jules A.Hoffmann) 和加拿大生 物学家拉尔夫·斯坦曼(Ralph M.Steinman) 三名科学家发现免疫系统 激活的关键原理，革命性地改变人们对免疫系统的理解，从而分享年 度诺贝尔医学奖。 布鲁斯·博伊特勒和朱尔斯·霍夫曼发现了关键受体蛋白质， 称为Toll 样受体（ Toll-like receptors ， TLR ）。 拉尔夫·斯坦曼在上世纪 70 年代第一个发现 DC(树突状细胞 )。D C 是目前已知功能最强大的专职抗原递呈细胞，具有强大的活化T 细胞能力，在获得性免疫启动中发挥重要的“信使”作用，从而引起一系列反应，制 造出抗体和“杀手”细胞等“武器”杀死被感染的细胞以及入， 侵的病原体。
〉〉〉安全防御系统 居家地点不同，保护住家安全的方法就不同。有些公寓有看门卫，有些房子建有栅栏，如果你有城堡，就需要配备一条护城河和一支弓箭部队，或者你可以选择其他一些特殊的家庭防御装置，比如安装锁、电子安全系统，养一只狗。 无论你选择的防御方法是什么，输入通行密码也好，用链条拴门也罢，还是要那种看门护院狗，其中的原因都在于你想要一个的安全 系统来保护你家里所有有价值的东西，从相册、立体声音响设备到传 家宝以及孩子们。 你的身体内也有自己的安全体系来抵御入侵者。皮肤和骨骼能在车祸中或是遇到打偏的高尔夫球时保护体内器官，头发保护头皮不受 紫外线侵害，眼睑保护眼球以防伸向眼睛的指头，但是你体内最重要 的安全系统是一个隐形的系统，你无法感觉或是看见它，而它却承担着抵御入侵病原体和帮助你康复的重任，这个系统就是人体的防御系统。 〉〉〉人体防线 人体有三道防线构成的防御系统，主要功能是抵御病原体的攻击。是由皮肤、黏膜、黏膜分泌物、杀菌物质 (如溶菌酶 )、免疫器官、免疫细胞、免疫活性物质等构成。 第一道防线 是由皮肤和黏膜构成的，他们不仅能够阻挡病原体侵入人体，而
第二十四章免疫细胞的分离与检测Chapter24SeparationandAssays
第二十四章免疫细胞的分离与检测 Chapter 24 Separation and Assays for Immunocyte 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：Ficoll-hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测，NK细胞的活性、中性粒细胞、巨噬细胞功能的检测方法；熟悉：T细胞功能的体内试验、T细胞介导的细胞毒检测的方法；了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。 二、教学内容 1。免疫细胞的分离与纯化：细胞的分离，外周血单个核细胞的分离，淋巴细胞的纯化与亚群分离，吞噬细胞的分离。 2。淋巴细胞的数量检测：T细胞数量检测，B细胞数量检测。 3。淋巴细胞的功能检测：T细胞功能检测，B细胞功能检测，NK细胞活性测定。 4．吞噬细胞功能检测：中性粒细胞功能检测，巨噬细胞功能检测。 第二部分测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A型题） 1．外周血中的单个核细胞主要是指 A．淋巴细胞B．嗜酸性粒细胞C．单核细胞-淋巴细胞 D．单核细胞E．中性粒细胞 2．分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为 A．1.030 B．1.035 C．1.092 D．1.020 E．1.077 3．用Ficoll-hypaque分层液分离PBMC，分离的PBMC层位于试管的 A．血浆层之上B．血浆层之中C．血浆层与分层液之间 D．分层液之中E．试管底部 4．用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex-G10柱分离细胞时，从柱上洗脱下的细胞主要是A．粒细胞B．淋巴细胞C．单核细胞D．T细胞E．B细胞 5．能与SRBC结合形成E花环的细胞主要是 A．T细胞B．B细胞C．单核细胞D．粒细胞E．血小板 6．用小鼠抗人CD3单克隆抗体检测T细胞，其结果代表的是 A．T细胞总数B．Th细胞数C．Ts细胞数D．CD4+细胞数E．CD8+细胞数 7．用尼龙棉柱分离细胞时，不易黏附尼龙棉纤维而被洗脱的细胞是： A．粒细胞B．B细胞C．单核细胞D．T细胞E．血小板 8．表示淋巴细胞的活力常用 A．活淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比B．活细胞浓度C．淋巴细胞浓度 D．活细胞和总细胞的比值E．T细胞和B细胞的比例
免疫检测点介绍
（一）免疫检测点简介 “免疫检验点”，为抑制受体和抑制信号通路，这些“检验点”在正常情况下能抑制T 细胞的功能，同时在肿瘤组织中可能被肿瘤利用形成免疫逃逸。 PD-1 、PD-L1、CTLA-4、B 和T 细胞衰减器（B and T cellattenuator，BTLA）、T 细胞免疫球蛋白以及Tim-3 等分子均属于“检验点”分子，在肿瘤组织中可能被肿瘤利用形成免疫逃逸，它们通过控制胞外以及胞内信号来控制细胞周期进程。 淋巴细胞活化基因3（LAG-3）是表达在活化T细胞、NK细胞及 B细胞上的免疫抑制检验点分子。目前已知的唯一配体是MHC-II分子。 NK细胞表面存在杀伤抑制受体（KIRs，可抑制NK细胞的杀伤作用），在肿瘤微环境中可能会被诱导表达，从而抑制NK细胞的杀伤功能。因此，KIRs也被认为是免疫抑制检验点，通过阻断其信号可增强NK细胞的杀伤肿瘤的功能[53]。目前已有针对KIRs单抗进入临床实验（lirilumab单抗治疗急性粒细胞白血病已进入I期临床实验）很多免疫抑制检验点在肿瘤细胞中与PD-1/PD-L1共表达，另一方面，免疫抑制检验点的联合阻断中可供选择的目标增多有利于筛选出最佳组合从而达到最佳效果。 （二）临床常用的检测点 “程序性死亡分子1”（programmed deah-1，PD-1）和“细胞毒T淋巴细胞相关抗原4”（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）表达在T细胞表面，同属于抑制性共刺激分子，在免疫系统
中扮演着类似“刹车”的角色。 CTLA的配体（即CD80和CD86）只表达在抗原递呈细胞上，而非肿瘤细胞表面，因此CTLA-4抑制T细胞活化发生在次级免疫器官（淋巴结）内，而不是肿瘤微环境中。同时CTLA-4主要表达在CD4+ T细胞而非CD8+ T细胞，CTLA-4单抗的抗肿瘤作用可能是通过增强CD4+ T细胞间接促进CD8+ T细胞的功能。 不同于CTLA-4的是，PD-1的配体PD-L1在肿瘤细胞及肿瘤浸润淋巴细胞上均有表达，而不是在抗原递呈细胞上，因此PD-1/PD-L1抑制T细胞活化主要在肿瘤微环境中[5-7]。目前，在肺癌领域研究得比较多的免疫检验点抑制剂有抗PD-1（Nivolumab，Pembrolizumab）和PD-L1单抗（MPDL3280A和MEDI-4736）。 PD-L1仍然是现阶段PD-1/PD–L1类药物最有前景的预测疗效的生物标记物之一 在黑色素瘤相关研究中发现，抗PD-1抗体的疗效要好于抗CTLA-4抗体。在NSCLC，CTLA-4抗体单药治疗鲜有疗效，而PD-1/PD-L1阻断剂的单药均表现出肿瘤活性。 PD-1有两个配体，PD-L1和PD-L2；PD-L1有两个受体PD-1和CD80（B7.1）。所以，尽管抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体都作用于PD-1/PD-L1信号轴，但阻断PD-1并不等同于阻断PD-L1。抗PD-1抗体能阻断PD-1与PD-L1、PD-L2结合，却不能阻断PD-L1与CD80相互作用，而抗PD-L1抗体能阻断PD-L1与PD-1、CD80结合，却不能阻断PD-1与PD-L2的结合。
细胞免疫功能测定
项目14：细胞免疫功能测定 【目的要求】 1、熟悉非特异性免疫细胞功能的测定方法 2、了解特异性免疫细胞的测定方法和应用 【实验内容】 一、吞噬细胞吞噬功能测定 【原理】 具有吞噬功能的细胞称为吞噬细胞，包括小吞噬细胞和大吞噬细胞二类。小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。 病原微生物、红细胞等异物侵入机体或在体外与吞噬细胞接触，吞噬细胞即进行吞噬。取细胞作涂片，镜检计算吞噬百分率和吞噬指数，可估计吞噬细胞的吞噬功能。吞噬细胞（巨噬细胞）在体液免疫和细胞免疫中均起着重要作用，吞噬细胞（巨噬细胞）与抗肿瘤免疫也有重要的关系。因此，测定吞噬细胞的吞噬和消化功能，可在一定程度上反映机体的免疫状态，也可作为判断疗效的指标之一。 【实验动物与试剂】 1、实验动物：小白鼠 2、实验试剂：无菌生理盐水、5%无菌可溶性淀粉溶液、瑞氏染液、白色葡萄球菌培养物 3、实验器材：无菌注射器、吸管、载玻片、解剖器械、显微镜等。 【方法】 1、试验前3天，小鼠腹腔注射5%无菌可溶性淀粉溶液1ml。 2、试验当天，小鼠腹腔注射1mL白色葡萄球菌悬液。 3、注射后30min，断颈处死小鼠，仰位固定小鼠，正中剪开腹部皮肤，吸出腹腔液制定涂片，自然干燥后瑞氏染液染色。 4、瑞氏染液染色：在涂片上滴3~5滴瑞氏甲液，30~60sec后,滴加瑞氏乙液,并用洗耳球吹数下,将乙液与甲液充分混均,5~10min后,水洗,干燥,镜检. 5、镜检：低倍对光，用油镜下观察巨噬细胞吞噬细菌的情况。 【结果观察】 1、吞噬细胞吞噬现象镜下观：如染色结果正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而白细胞浆则为淡红色。 2、吞噬细胞吞噬功能的测定 （1）吞噬百分率：观察100个吞噬细胞，计数被吞噬百分率以表示吞噬