两种分离人胎盘间充质干细胞方法的比较

两种分离人胎盘间充质干细胞方法的比较

李昆1，于艳秋2，李世正3

（１．辽宁医学院附属第一医院检验科，辽宁锦州１２１００１；２．中国医科大学基础医学院病理生理教研室，沈阳１１０００１；３．辽宁医学院附属第一医院普外科，辽宁锦州１２１００１）

摘要：寻找简便易行的人胎盘间充质干细胞（hPDMSCs ）的提取方法。关键词：胎盘间充质干细胞；组织块培养法；酶消化法中图分类号：R329

文献标志码：B

文章编号：0258-4646（2010）08-0675-02

Comparison of Two Methods in the Isolation of Human Placenta -derived Mesenchymal Stem Cells 近年来，人们已成功从骨髓、外周血、肌肉、脂肪及胎盘等组织中分离并鉴定出间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）。其中，ｈＰＤＭＳＣｓ不仅来源广泛，且对其研究不会涉及伦理道德和法律问题，因此成为寻找人类间充质干细胞新来源及提高临床应用效果的研究热点。目前，ｈＰＤＭＳＣｓ的原代培养大多采用常规的酶消化法，但其存在着操作过程繁琐、

由于操作过程繁琐致污染机率增加、长时间酶的消化对细胞损伤较大及成本高等弊端。本实验采用组织块培养法，与常规的酶消化法进行比较，以求得最佳的ｈＰＤＭＳＣｓ原代培养方法。1材料与方法１．１材料

１．１．１标本来源：经产妇同意后，无菌条件下剖宫产的足月

健康新生儿胎盘组织（来源于辽宁医学院附属第一医院产

科）．１．１．２

试剂：ＤＭＥＭ，ＦＢＳ，非必需氨基酸，Ｌ-谷氨酰胺，青链霉素，β-巯基乙醇，鼠抗人ＦＩＴＣ直标单克隆抗体ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４，鼠血清，ＰＢＳ。１．２方法

１．２．１ｈＰＤＭＳＣｓ的原代培养

１．２．１．１

酶消化法：取足月健康新生儿胎盘羊膜下组织，采用酶消化法分离细胞，将细胞以１×１０５／ｃｍ２接种于盛有１０％ＤＭＥＭ培养皿内，３７℃、５％ＣＯ２及饱和湿度条件下培养，每３ｄ换液１次。观察细胞贴壁时间、细胞生长形态、原代生长周期。１．２．１．２

组织块培养法［１］：取上述胎盘羊膜下组织，ＰＢＳ反复

冲洗去除血迹，将胎盘组织剪碎至１ｍｍ３大小，均匀置于培养皿底，倒置培养皿待干约１０ｍｉｎ，沿培养皿壁添加１０％ＤＭＥＭ，３７℃、５％ＣＯ２及饱和湿度条件下培养，每３ｄ换液１次。观察细胞由组织块爬出的时间、细胞生长形态、原代生长周期。

１．２．２不同方法分离的ｈＰＤＭＳＣｓ的传代培养：取上述两种

方法分离培养的ｈＰＤＭＳＣｓ以每孔５×１０３个／ｃｍ２的密度接种于２４孔板中。采用胰酶消化台盼蓝染色法，每日取４孔计数细胞，绘制细胞生长曲线，细胞达到生长抑制时停止实验。１．２．３不同方法分离的ｈＰＤＭＳＣｓ细胞生物学特性的比较１．２．３．１

流式细胞仪检测细胞表面标记特征：取上述两种方

法分离培养的细胞进行扩增。扩增至第２代时，

流式细胞仪检测细胞表面ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＨＬＡ-ＡＢＣ及ＨＬＡ-ＤＲ。１．２．３．２流式细胞仪检测细胞周期：取上述两种方法分离培

养的细胞进行扩增。扩增至第２代时，流式细胞仪检测细胞

周期。１．２．４

统计学分析

用ＳＰＳＳ１０．０统计学软件处理，做χ２检验，Ｐ＜０．０５为差异有显著性。2结果２．１酶消化法

培养３ｄ左右仅见少量单个贴壁细胞，呈圆形或短梭形，培养１０ｄ左右，细胞形态逐渐伸展开来，呈长梭形，类似成纤维细胞，并逐渐形成漩涡状的集落，培养３周左右，可达到８０％￣９０％融合（图１Ａ）。２．２

组织块培养法

培养３ｄ左右有少量细胞沿组织块周边爬出，呈短梭形，形态饱满；随后细胞慢慢向外扩长，呈长梭形，类似成纤维细胞，并逐渐形成漩涡状的集落，随着细胞数量的增多，组织块逐渐脱落，培养３周左右，仅有少量组织块残留，细胞可达到８０％￣９０％融合（图１Ｂ）。２．３

不同方法分离的ｈＰＤＭＳＣｓ传代培养生长速率的比较酶消化法与组织块培养法分离的ｈＰＤＭＳＣｓ传代培养后均可稳定生长，生长速率无统计学差异（Ｐ＞０．０５）。２．４ｈＰＤＭＳＣｓ细胞生物学特性的比较

２．４．１

不同方法分离培养的ｈＰＤＭＳＣｓ经２代扩增后细胞表

面标记特征表达率的比较：流式细胞仪检测结果显示，酶消化法与组织块培养法原代培养的ｈＰＤＭＳＣｓ经２代扩增后，均表达ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＨＬＡ-ＡＢＣ，而

作者简介：李昆（1980-），女，检验师，硕士.

E-mail ：kun_li1980@https://www.wendangku.net/doc/931473827.html,

收稿日期：2010-01-11

中国医科大学学报第39卷第8期2010年8月Journal of China M edical University V o l.39N o.8A ug.2010

675··

A enzymatic digestion method ：A1cultured 3d ；A2cultured 10d ；A3cultured 3w ；A4passage 2；

B tissue pieces method ：B1cultured 3d ；B2cultured 10d ；B3cultured 3w ；B4passage 2图１酶消化法与组织块培养法原代培养的ｈＰＤＭＳＣｓ的形态学比较×１００Ｆｉｇ．１ＣｏｍｐａｒｉｓｉｏｎｏｆｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｈＰＤＭＳＣｓｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓ×１００

ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＨＬＡ-ＤＲ不表达，呈现与骨髓来源的ＭＳＣｓ相似的细胞表面抗原标记特点，且两种方法分离培养的ｈＰＤＭＳＣｓ经２代扩增后的细胞表面标记特征表达率无统计学差异（Ｐ＞０．０５）。２．４．２

不同方法分离培养的ｈＰＤＭＳＣｓ经２代扩增后细胞周

期的比较：流式细胞仪检测结果显示，酶消化法与组织块培养法原代培养的ｈＰＤＭＳＣｓ经２代扩增后，均以Ｇ１期和Ｓ期为主，且两期比率、Ｇ１＋Ｇ２期比率之和及Ｇ１／Ｇ２无统计学差异（Ｐ＞０．０５）。3讨论

近年来研究发现，ｈＰＤＭＣｓ不仅支持造血系统，同时具有多项分化的潜能，而且其免疫原性较低［２￣５］。因此，ｈＰＤＭＣｓ有望成为临床再生医学、组织工程学、发育生物学及药物研发等领域新的干细胞种子来源。

胎盘间充质干细胞体外提取技术相对成熟，目前多采用酶消化法，但该方法存在着操作过程繁琐、由于操作过程繁琐致污染机率增加、

长时间酶的消化对细胞损伤较大及成本高等弊端。本实验应用酶消化法和组织块培养法均成功分离出ｈＰＤＭＳＣｓ。实验结果显示，两种方法分离的ｈＰＤＭＳＣｓ原代细胞生长形态及生长周期没有明显差别，传代培养后的细胞生长速率、

细胞表面标记特征表达率和细胞周期没有明显差异（Ｐ＞０．０５），但是，组织块培养法较酶消化法节省了消化组织等步骤，不仅大大的节省了操作时间，避免了由于长时间

酶的消化对细胞的损伤，降低了可能由于操作过程繁琐所致培养污染机率，同时也节省了提取ｈＰＤＭＳＣｓ过程中的部分开支。因此，组织块培养法是一种简便易行、经济实用的提取ｈＰＤＭＳＣｓ的方法。参考文献：

［1］Xiaohong Zhang ，Ayako Mitsuru ，Koichi Igura ，et al.Mesenchymal

progenitor cells derived from chorionic villi of human placenta for cartilage tissue engineering ［J ］.Biochemical and Biophysical Research Communications ，

2006，340（3）：944-952.［2］Koc ON ，Gerson SL ，Cooper BW ，et al.Rapid hematopoietic recovery

after co -infusion of autologous -blood stem cells and culture -expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high -dose chemotherapy ［J ］.J Clin Oncol ，2000，18（2）：307-316.

［3］Yen BL ，Huang HI ，Chien CC ，et al.Isolation of multipotent cells

from human term placenta ［J ］.Stem Cells ，2005，23（1）：3-9.［4］Klyushenenlova E ，Misca J ，Zernetkina V ，et al.T cell responses to

allogeneic human mesenchymal stem cells ：immunogenicity ，toler －ance ，and suppression ［J ］.J Biomed Sci ，2005，12（1）：47-57.［5］Jang YK ，Jung DH ，Jung MH ，et al.Mesenchymal stem cells feeder

layer from human umbilical cord blood for ex vivo expanded growth and proliferation of hematopoietic progenitor cells ［J ］.Ann Hematol ，2006，85（4）：343-344.

（编辑孙宪民，英文编辑赵传胜）

中国医科大学学报第39卷

Ａ１Ａ２Ａ３Ａ４

Ｂ１Ｂ２Ｂ３Ｂ４

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脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定 【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。 【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学 Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%～70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering. Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。脐血(umbilical cord blood, UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB来源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。

脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略

脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略 脐带间充质干细胞（UCMSC ）具备药品的“工厂化、规模化、标准化”生产特点，是目前“成药”性最高的成体干细胞（ASC ）之一。UCMSC 还有广泛的生物效应，对各种损伤、退变和炎症性疾病的疗效明确，且具有免疫原性低、异体治疗无免疫排斥反应、临床应用的安全性高、无伦理限制等临床应用优势。UCMSC 的研究与应用受到了国内外研究者的广泛关注，已对其高效制备技术、体内生物学行为、临床疗效与机制及安全性进行了深入研究，解决了临床前关键技术和理论问题，进入了迈向临床验证的最后一公里，即将成为临床疾病治疗的新型“药物”和技术。但如何科学、合理、规范、循序渐进地推进UCMSC 向临床转化，是管理部门和研究者共同面临的问题。笔者在对UCMSC 进行系统性临床前研究的基础上，对UCMSC 治疗系统性损伤和自身免疫性疾病的临床技术及规范进行了探讨。 1 . UCMSC 治疗的临床适应证 UCMSC 制剂可在临床上用于涉及组织细胞损害（变性、坏死、缺失）、自身免疫和炎症反应引起的疾病的治疗，但在同种疾病的不同阶段、不同个体之间，疗效可能不尽相同，其原因在于UCMSC 来源、质量及临床实施方法的差异。根据UCMSC 的生物学特性及疾病治疗机制研究进展，UCMSC 的临床适应证主要有： （1）机械性创伤：包括武器、交通与意外伤害、自然灾害等导致的各种类型的组织器官损伤； （2）退变性疾病：如衰老、器官纤维化、骨质疏松、器官萎缩、动脉硬化等； （3）缺血性疾病：心脑血管意外、血管栓塞等； （4）中毒性疾病：如酒精、食物、药物、毒剂、环境等导致的肝、肾、神经中毒等； （5）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮，再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肝病等； （6）炎症性疾病：慢性炎症、急性系统性炎症综合征等； （7）代谢性疾病：糖尿病、甲状腺功能异常、高血酯症、高血压等； （8）组织残缺性疾病：主要用于组织缺损的局部再生及人工组织构建与移植治疗。 总之，UCMSC 的适应范围很广，可通过多种机制发挥治疗作用，对并发多种疾病的患者有“一药治多病”的效应。

间充质干细胞培养方法

间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多

脐带间充质干细胞综述(转)

脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。 图1图

2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明

间充质干细胞在人胎盘组织中的染色定位

间充质干细胞在人胎盘组织中的染色定 位 本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！ 【摘要】目的探索间充质干细胞(mscs)在人胎盘组织中的分布规律。方法取正常剖宫产之足月健康产妇的新鲜胎盘组织,按中央带、中间带、边缘带、绒毛板层、中间层和基底板层分为9组:aa、ab、ac、ba、bb、bc、ca、cb、cc。连续切片,以抗cd166、抗cd44、抗cd29分别做免疫荧光和免疫组化染色。显微镜下观察阳性细胞分布区域,采用彩色病理图像分析系统进行图像分析。结果cd166、cd44、cd29阳性表达细胞的分布情况较一致,主要集中于血管内皮下及血管附近间质内。胎盘中央带中间层(ab)阳性细胞较集中,阳性表达的强度较强,其od值与其它组差异有统计学意义(p伦理委员会批准,获取临床正常剖宫产之足月健康产妇的新鲜胎盘组织,所选择的胎盘脐带附着点均在胎盘中央或稍偏位,大小及重量在正常范围内。 方法 分组将胎盘组织分为中央带即脐带附着处(a)、

边缘带即距脐带附着点最远处(c)和中间带即两者之间中点处(b)3大组,每组从胎儿面向母体面再分为绒毛板层(a)、中间层(b)和底板层(c)3小组。 冰冻切片取aa、ab、ac、ba、bb、bc、ca、cb、cc 9处新鲜组织,大小为1cm×1cm×,以oct包埋于冻台上,速冻后切5μm薄片,贴附于载玻片。 石蜡切片取前述9处组织,大小为1cm×1cm×,中性福尔马林液中固定24h,梯度酒精溶液脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋后切5μm薄片,贴附于涂布多聚赖氨酸的玻片。 染色 免疫组化染色(sabc法) 切片置60℃烘箱内过夜,取出后以二甲苯脱蜡,梯度酒精洗去二甲苯、水化,pbs 冲洗3min×3次,置枸橼酸钠溶液中微波加热以修复抗原,自然冷却后以pbs冲洗3min×3次,滴加抗体(cd29、cd44,阴性对照滴加pbs),室温1h,pbs冲洗3min×3次,滴加免疫反应增效剂,dab显色3～10min,充分水洗,苏木素复染5s,盐酸酒精分化1s,流水促蓝,梯度酒精脱水,二甲苯透明后以中性树胶封片,置显微镜下观察。 免疫荧光染色将冰冻切片稍稍风干后即滴加ι抗(cd166,浓度为1∶400,阴性对照滴加pbs),置37℃水浴箱中1h,pbs冲洗3min×3次,洗去多余抗体,滴加fitc

脐带血间充质干细胞体外分离_纯化及培养

脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养 陈 镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王 玲3,陆 华3,吴智远2,芦 奕2 (1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019; 3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006) 摘 要:目的 研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。方法 无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。结论 脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。 关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养 中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03 THE ISOLATION PURIFICATION AND CULTURE OF HUCA MSCs CHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling, LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li (1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz hou University ,Suz hou,Jiangsu ,215006) ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbil ical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs. KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro 脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的 血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem 收稿日期:2003-12-16 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。 12 实用临床医药杂志 Journal of Clinical M edicine in Practice 2004年第8卷第1期

间充质干细胞分离与培养

文章编号:100025404(2001)0520553203论著 骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提　要:目的　摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法　采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果　以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论　建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective　T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods　C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults　The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion　The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1　材料与方法 1.1　骨髓MSC的分离 从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2　不同贴壁时间对MSC增殖的影响 选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3　不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响 细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4　比较不同种植密度对MSC生长的影响 用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5　培养细胞生长曲线 细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月 第　三　军　医　大　学　学　报 ACT A　AC ADE MI AE　ME DICI NAE　MI LIT ARIS　TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001

间充质干细胞培养方法

间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。

人脐带间充质干细胞操作规范

人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2， 有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶 体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即 得到P0代脐带间充质干细胞;

胎盘间充质干细胞的分离和培养

胎盘间充质干细胞得分离,原代与继代培养及鉴定 刘亭 2016、7。21 目录 前言 (2) 1分离制备PMSC组织得选取 (3) 2脐带,胎盘MSC得分离与纯化 (5) 2、1胎盘组织得获取,存储与清洗 (5) 2—2 脐带,胎盘MSC得分离及纯化方法 (6) 3 原代培养与继代培养 (10) 3-1培养基 (10) 3-2培养密度 (11) 3—3培养条件 (11) 3—4换液 (11) 3-5 传代培养 (12) 3-6细胞形态与生长速度 (12) 3-7 MSC得冻存与复苏: (12) 4细胞表面抗原检测 (13) 5生长曲线 (13) 6细胞周期 (13) 7分化潜能 (13) 参考文献 (13) 附件1不同实验室从脐带血,脐带与胎盘等各组织中分离MSC得方法 (15) 脐带血 (15) 脐带 (15) 羊膜 (17) 绒毛膜 (18) 蜕膜层 (18) 胎盘 (19) 整体灌注法 (20) 附件2 背景知识 (20) 附件3 PMSC实验所需试剂 (21)

前言 干细胞(Stem cell,SC)就是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系得细胞。在一定得条件下,干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。按照来源与分化潜能不同,干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)与成体干细胞(Adult stem cell,ASC)两类。胚胎干细胞来源于早期得胚泡与胚胎内层得细胞群,并且具有向3个胚层细胞分化得能力。但就是胚胎干细胞应用时产生得免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及得伦理问题等影响并制约了临床应用。成体干细胞形成于原肠胚形成后得胎儿与成体组织,早期研究认为,成体干细胞主要分化为其来源组织得细胞类型。然而,近几年来得很多研究表明,成体干细胞具有能够分化成为除来源以外得其她胚层组织得能力。 间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)又称为基质干细胞,就是属于成体干细胞得一种,最早从骨髓中分离而来、MSC就是由早期中胚层发育而来得非造血成体干细胞,该细胞在体外可以贴壁生长,并呈现梭状。胞质丰富,细胞核呈圆形,1-3个核仁、在适当得条件下可以大量扩增,并转化为间充质祖细胞,进而分化成包括三个胚层得各种组织细胞,如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。 MSC具有低得免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节与造血支持等功能,而且易于外源基因导入表达,就是基因治疗中重要得载体细胞。此外,一些研究学者还发现,MSC具有类似免疫抑制剂作用,可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中得免疫反应,并同时抑制T细胞得异基因增殖反应、所以,MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛得应用前景。近年来MSC已逐步成为干细胞研究得热点(张慧娟等,2014)、 目前所报道得间充质干细胞主要来源于骨髓,采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便,但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦得手术,并在取材过程中及取材后会有很高得感染机会;由于人体骨髓中间充质干细胞得含量极其稀少,每105-106个单个核细胞中大约只有1个;而且随着年龄得增加,骨髓中间充质干细胞得数量、增殖与分化能力均显著下降,使其在研究与应用尤其就是临床应用中受到限制。其她组织中,如动员得外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干细胞,然而,从这些组织中获得得细胞数量较为有限。以上因素,都限制了间充质干细胞

人脐血间充质干细胞来源的外泌体_分离鉴定及生物学特性_张娟

中国组织工程研究 第18卷 第37期 2014–09–03出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5955www.CRTER .org 张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙古医科大学免疫学在读硕士，医师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究。 通讯作者：王彩生，硕士，主任医师，内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031 并列通讯作者：魏来，博士，教授，北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 [https://www.wendangku.net/doc/931473827.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31 Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China Accepted: 2014-07-31 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性 张 娟1，刘 峰2，张 薇2，丛 旭2，王彩生1， 3，魏 来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大 学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031) 文章亮点： 1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，含有来源细胞的膜蛋白成分，可以选择性地将含有的蛋白质、RNA 等递送至受体细胞，调节细胞间的信号传导。故可将间充质干细胞来源的外泌体开发成为一种既具有间充质干细胞的作用特点，又能规避其不良分化和肿瘤形成缺陷的新型治疗手段。因此，通过间充质干细胞来源的外泌体促进组织损伤修复是今后具有重要探讨价值的研究方向。 2 分离提取及鉴定外泌体是进行深入研究的基础，实验主要通过超滤及差速离心法分离出外泌体，通过透射电镜及流式鉴定相结合来鉴定，为后续的外泌体功能研究奠定基础。 3偏倚或不足：人脐血间充质干细胞源性外泌体生物学功能及相关机制还需要进一步分析；人脐血间充质干细胞的外泌体最终要移入体内研究，所以尚需建立动物模型。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；外泌体；人脐血间充质干细胞；分离鉴定；活性 主题词： 胎血；间质干细胞；外泌体；膜蛋白质类 摘要 背景：外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，越来越多的研究表明，间充质干细胞可能通过旁分泌外泌体而发挥对组织损伤的修复作用，目前人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定尚未见报道。 目的：分离纯化人脐血间充质干细胞来源的外泌体，并鉴定其生物学特性。 方法：收集人脐血间充质干细胞培养上清，采用超滤及梯度离心法分离并纯化外泌体，通过透射电镜观察其形态，流式细胞术检测其表面标志 CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。 结果与结论：人脐血来源的间充质干细胞能够分泌外泌体，电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构，直径40-100 nm 。外泌体表达其共性表达标志CD63、CD81及间充质干细胞表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果表明采用超滤及梯度离心法可以成功从间充质干细胞培养上清中分离纯化外泌体，间充质干细胞分泌的外泌体具有外泌体的胞膜蛋白组分。 张娟，刘峰，张薇，丛旭，王彩生，魏来. 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性[J].中国组织工程研究，2014，18(37):5955-5960. Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: isolation, identification and biological characteristics Zhang Juan 1, Liu Feng 2, Zhang Wei 2, Cong Xu 2, Wang Cai-sheng 1, 3, Wei Lai 2 (1Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2 Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China; 3the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China) Abstract BACKGROUND: Exosomes are membrane vesicles secreted by mesenchymal stem cells. Increasing studies have shown that mesenchymal stem cells can secrete exosomes via paracrine function to play a role in tissue injury. However, reports on how to isolate and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells are few. OBJECTIVE: To extract, purify and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells. METHODS: The cell culture supernatant of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells was collected. Exosome was extracted and purified with ultrafiltration and gradient centrifugation methods. The morphology of exosome was observed by transmission electronic microscope, and the expressions of CD63, CD81, CD90, CD73, CD105, CD29, and CD166 in exosome of mesenchymal stem cells were analyzed by fluorescent activated cell sorting. RESULTS AND CONCLUSION: Mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood secreted exosome