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2009---广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离与培养

第3期(责任编辑王珞)

参考文献:

[1]

SHEN M M ,HODGKIN J.Mab-3,a gene required for sex specific yolk protein expression and a male specific lineage in C.elegans [J ].Cell ,1988,54:1019-1031.

[2]BURTUS K C ,BAKER B S.Drosophila double sex gene control somatic sexual differentiation by producing alteratively spliced mRNAs encoding related sex specific polypeptides [J ].Cell ,1989,56:997-1010.

[3]RAYMOND C S ,SHAMU C E ,SHEN M M ,et a1.Evi-dence for evolutionary conservation of sex determining genes [J ].Nature ,1998,391:691-695.

[4]GRANDI A D ,CALVARI V ,BERTINI V ,et a1.The ex-pression pattern of a monse doublesex ·related gene is con-sistent with a role in gonadal differentiation [J ].Mech Dev ,

2000,90:323-326.[5]

REN L L ,CHENG H H ,GUO Y Q ,et a1.Evolutionary conservation of Dmrt gene family in amphibians reptiles and birds [J ].Chin Sci Bull ,2001,46(23):1992-1996.

[6]姚凯,赵洋,张涛,等.哺乳动物DMRT1基因调控区分

析[J ].遗传,2006,28(7):825-830.

[7]

RAYMOND C S ,PARKER E D ,KETTLEWELL J R ,et a1.A region of human chromosome 9p required for testis de-velopment contains two genes related to known sexual regula-tors [J ].Hum Molec Genet ,1999,8:989-996.

[8]

PASK A J ,BEHRINGER R R ,RENFREE M B.Expression of DMRT1in the mammalian ovary and testis-from marsupi-als to mice [J ].Genome Res ,2003,101:229-236.

第48卷第3期2009

3

月湖北农业科学

H ubei A gricultural S ciences

Vol.48No.3Mar .,2009

收稿日期:2009-01-09

基金项目:国家高技术研究发展计划(863)项目(2007AA100505)

作者简介:杨素芳(1972-),女,广西兴安人,副教授,博士,(电话)137********(电子信箱)ysfang3511@163.com ;通讯作者,石德顺。

广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离与培养

杨素芳,汪彩珠,陈凌声,覃兆鲜,黄雅琼,石德顺

(广西大学动物繁殖研究所,南宁

530005)

摘要:试验主要对广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离和培养进行了研究。利用组织块法能够成功分离培养广西巴马香猪耳皮成纤维细胞,其大小范围在1~3mm 3,去除表皮有利于组织块贴壁和细胞的游出;而采用0.25%胰蛋白酶消化液4℃冷处理过夜,不仅有利于去表皮操作,减少取材处理时间,而且操作时间自由度大。在酶消化法中采用胰蛋白酶消化30min ,胶原酶继续消化30~40min ,能够成功分离培养广西巴马香猪耳皮成纤维细胞。广西巴马香猪皮肤成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为

0~2d 、2~8d 、8~12d 。

关键词:广西巴马香猪;成纤维细胞;体外培养;分离中图分类号:S828.9+9(674BM );Q954.6-33+2

文献标识码:A

文章编号:0439-8114(2009)03-0547-06

Dissociation and Culture of Ear Skin Fibroblasts in Guangxi Bama Miniature Pigs

YANG Su-fang ,WANG Cai-zhu ,CHEN Ling-sheng ,QIN Zhao-xian ,HUANG Ya-qiong ,SHI De-shun

(Animal Reproduction Institute ,Guangxi University ,Nanning 530005,China )

Abstract :Dissociation and culture of ear skin fibroblasts in Guangxi Bama m iniature pigs was studied.Tissue piece culture could dissociate ear skin fibroblast in Guangxi Bama m iniature pigs successfully.Tissue piece with removaling epidermis and the size of 1~3mm 3were contributed to cell swimming out and cell adherence.Tissue piece undergoing 0.25%trypsin cold treatment overnight was helpful to remove its epidermis ,decrease the time of treating material and to operate freely.The fi-broblasts could be disassociated and cultivated successfully by adopting trypsin digestion for 30min firstly and collagenase digestion for 30~40min continuously.The detention period ,log phase and platform time of the ear skin fibroblast in Guangxi Bama m iniature pigs was 0~2d ays ,2~8d ays ,8~12d ays respectively.Key words :

Guangxi Bama m iniature pig ;fibroblast ;in vitro culture ;disassociation

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

湖北农业科学2009年

细胞体外培养能够使细胞在体外人为控制的条件下维持正常的生命活动,因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法[1]。同时,随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学以及现代医学的发展,细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力。至目前为止,已成功获得了小鼠卵丘细胞[2,3]、牛耳皮肤成纤维细胞[4]、猪卵丘/颗粒细胞[5]、猪皮肤成纤维细胞[6]、绵羊乳腺上皮细胞[7]等的克隆后代。由于猪器官的组织结构和生理生化特性与人类相近,因而利用克隆转基因技术生产经遗传修饰的克隆猪,提供大量廉价的器官以进行异体器官移植及建立人类疾病模型,已成为当今动物生物技术研究的新热点。而如何简便、高效地获得供体细胞则是此类技术关键的上游步骤之一。动物的耳皮肤是理想的供核体细胞源,它不但可以提供供体个体完整的遗传物质,且在取材后对动物的健康没有影响。而来自于长寿之乡——

—广西巴马的香猪,以其特色体型的矮、小、短、圆及特有的纯合基因而成为遗传育种及生物医学研究的理想实验动物模型。但目前巴马香猪血缘混杂情况日趋严重,特有的遗传信息丧失,“标准”的巴马香猪日趋减少,而通过保种场进行保种,费用巨大。故本研究以广西巴马香猪耳部皮肤为材料,进行成纤维细胞的体外培养试验,旨在建立一种简单、高效的巴马香猪皮肤成纤维细胞的培养方法,为核移植、转基因等技术提供充足的供体来源,为广西特有巴马香猪的保种开辟一条新途径。

1材料与方法

1.1材料和处理

广西巴马香猪(4月龄)耳皮组织。本研究所用试剂除DMEM((Dulbecco’s Modified Eagle Medi-um)购自Gibco公司外,其他所用无机盐、胰蛋白酶、丙酮酸钠、抗菌素等大部分试剂及药品均购自Sigma公司。新生牛血清(NCS)自制。挑选巴马香猪耳部血管较细少的部位,无菌取一小块猪耳组织,先在生理盐水中清洗2次,然后放入75%酒精中浸泡30~60s,再在含有抗菌素的PBS液中依次漂洗3次。接着置于含有少量PBS的无菌皿中,用无菌眼科剪、刀片刮去毛茬和表皮组织,并去除软骨,保留真皮层,再次用酒精浸泡30~60s,而后再移入PBS 液中漂洗4次,待用。

1.2原代培养

1.2.1组织块法取上述处理的部分组织,在含有10%NCS+DMEM液的无菌平皿中,用眼科剪剪成1~3mm3左右的小块,移入预先涂布明胶孵育的培养皿中,均匀地平铺于培养皿底部,组织碎块间间距以0.5cm为宜。将培养皿倒置放入37℃、5%的CO2饱和湿度的培养箱中培养4~6h,后加入少量培养液,正置培养20h后补加培养液,以漫过组织块为宜,在培养箱中每隔3~4d换液1次。

1.2.2胰蛋白酶热消化法取上述备用组织,在无菌青霉素瓶中将组织剪碎。加入沉淀量4倍体积的0.25%trypsin消化液吹打混匀,置37℃恒温箱中消化处理40~60min。消化期间每隔10min用粗口吸管反复轻轻吹打松散组织,当大部分组织块消化完全、能顺利通过吸管口时,立即加入10%NCS+DMEM培养液终止消化,滤网过滤,离心(1200 r·min-1,3min)2次,弃上清,收集细胞,用DMEM培养液制备细胞悬浮液,以1×106个·mL-1左右的密度接种于培养瓶,置于CO2培养箱中培养,每隔3~4d 换液1次。

1.2.3冷热结合胰蛋白酶消化法取上述剪碎的备用组织加入沉淀量4倍体积的0.25%trypsin消化液吹打混匀,置4℃冰箱中冷消化过夜,后置于37℃恒温箱中消化处理40~60min。当大部分组织块消化完全、能顺利通过吸管口时,立即加入10%FCS+DMEM培养液终止消化,滤网过滤,离心(1200r·min-1,3min)2次,弃上清,收集细胞,用DMEM培养液制备细胞悬浮液,以1×106个·mL-1左右的密度接种于培养瓶,置于CO2培养箱中培养,每隔3~4d换液1次。

1.2.4胶原酶联合胰蛋白酶消化法取上述备用组织,在无菌青霉素瓶中将组织剪碎。①先胶后胰法,加入2mL胶原酶吹打混匀后,置37℃恒温箱中消化处理20~30min,后离心,去上清,加入0.25%胰蛋白酶消化液37℃恒温箱中消化处理40~60min。用吸管吹打,至大部分组织块消化完全,立即加入10%NCS+DMEM培养液终止消化,滤网过滤,离心(1200r·min-1,3min)2次,弃上清,收集细胞,用DMEM培养液制备细胞悬浮液,以1×106个·mL-1左右的密度接种于培养瓶,置于CO2培养箱中培养,每隔3~4d换液1次。②先胰后胶法,先用0.25%胰蛋白酶消化液37℃恒温箱中消化处理30min,后离心去上清,加入胶原酶置37℃恒温箱中继续消化处理30~40min,滤网过滤,离心(1200r·min-1,3min)2次,弃上清,收集细胞,用DMEM培养液制备细胞悬浮液,以1×106个·mL-1左右的密度接种于培养瓶,置于CO2培养箱中培养,每隔3~4d换液1次。1.3传代培养

待原代细胞生长至90%汇合时,吸出培养液,

548

第3期

用无钙、镁离子的PBS漂洗1~2遍,加入1~2mL已预热的0.25%胰蛋白酶溶液消化处理2~5min,倒置显微镜下观察,待细胞大部分变圆时,立即加入2 mL左右的10%NCS+DMEM培养液终止消化。离心、弃上清,用含10%NCS的DMEM制备细胞悬液并按1∶2的比例进行接种培养。

1.4香猪耳皮成纤维细胞生长曲线的测定

将传至第三代的巴马香猪耳皮成纤维细胞用胰蛋白酶消化,调整细胞浓度为4.0×104个·mL-1,接种于24孔细胞培养板中,每孔0.4mL。每隔24h消化2个孔,收集细胞,混匀,用细胞计数板计数,计2次,求其平均值。pH值下降时,72h内对细胞进行换液。对不同培养时期的细胞进行计数,绘制生长曲线。细胞计数步骤:将血球计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板上,将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间。静置3min。镜下观察,计算计数板四大方格内细胞总数,压线细胞只计左侧和上方。然后按下式计算:细胞数/mL=4大方格细胞总数/4×104。镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,按单个细胞计算。1.5试验设计

试验①本试验的目的是确定合适的取材处理方法。故采用方法为不去表皮、直接去表皮和0.25%胰蛋白酶消化液4℃冷处理过夜后去表皮3种方法,结果以组织块贴壁率进行评定。

试验②本试验的目的是确定合适的组织块大小。组织块分1~3mm3、3~5mm3和5~7mm3,结果以组织块贴壁率进行评定。

试验③本试验的目的是确定合适的原代培养方法。方法为组织块法、胰蛋白酶热消化法、胰蛋白酶冷热消化结合法和联合胶原酶法,结果以观察游离的细胞数、贴壁的细胞数以及细胞生长周期等指标进行综合评价。同时将分离的成纤维细胞进行体外培养,对不同培养时期的细胞进行计数,并绘制生长曲线。

各试验所得数据均采用F检验法分析,确定差异显著性。

2结果与分析

2.1不同取材处理方法对组织块贴壁培养效果的影响

取材处理方法对组织块贴壁培养效果的影响结果如表1所示。3种处理方法随着培养天数的增加(1~5d),贴壁率均呈现下降趋势。当组织块直接去表皮培养或经胰蛋白酶消化液4℃冷处理过夜后再去表皮时,其贴壁率(2~5d)与未去表皮组的相比,差异显著(P<0.05),但组织块直接去表皮培养和胰蛋白酶消化液4℃冷处理过夜后再去表皮培养二者之间差异不显著(P>0.05)。试验表明,无论是新鲜的组织块去除表皮层、或是经胰蛋白酶消化液4℃冷处理过夜后再去除表皮层的方法,均有利于组织块的贴壁。

2.2组织块大小对贴壁效果的影响

组织块大小对贴壁效果的影响结果如表2所示。随着组织块体积的减小,贴壁率呈现增加趋势。各组织块在第1天、第2天的贴壁率没有明显差异,但在随后第4天和第5天,组织块1~3mm3的贴壁率显著高于组织块3~5mm3和5~7mm3组(第4天为48.33%±7.64%、23.00%±9.17%、10.33%±4.04%;第5天为41.67%±7.64%、19.00%±6.00%、5.33%±4.62%;P<0.05)。结果表明,组织块大小范围在1~3mm3内,贴壁效果较好。

2.3不同原代培养方法的培养效果

2.3.1组织块培养法培养皿中耳部皮组织块约2/3能紧密贴附于培养瓶壁,倒置显微镜下观察组织块透光性较差,呈现为暗黑色遮光区域。组织块法培养第1天即可贴壁,5d后部分组织块周围游离出成纤维细胞,少量的成纤维细胞已经贴壁生长。7天后大部分组织块周围游离出成纤维细胞贴壁生长(图1)。9d后组织块周围有大量的成纤维细胞包绕,成纤维细胞生长旺盛,但组织块间仍有间隙,大约13~15d组织块间间隙消失,细胞将汇合成表1不同取材处理方法对组织块贴壁率的影响

培养

天数

d

1

2

4

5

组织块未

去表皮的

贴壁率/%

100.00±0.00

88.33±2.89a

10.00±5.00a

6.67±2.89a

组织块直接

去表皮的贴

壁率/%

100.00±0.00

96.67±2.89b

46.67±10.40b

43.33±7.64b

组织块经0.25%胰蛋白

酶消化液4℃冷处理过

夜后去表皮的贴壁率/%

100.00±0.00

98.33±2.89b

50.00±5.00b

48.33±5.78b

处理方法

注:同行内不同英文小写字母表示差异显著(P<0.05)。

表2组织块大小对贴壁效果的影响

组织块

大小

mm3

5~7

3~5

1~3

组织块

总数

13

16

20

1d

100.00

100.00

100.00

2d

87.33±4.04

90.00±3.46

95.00±5.00

4d

10.33±4.04a

23.00±9.17a

48.33±7.64b

5d

5.33±4.62a

19.00±6.00b

41.67±7.64c

组织块贴壁率/%

注:同列中不同英文小写字母表示差异显著(P<0.05)。

杨素芳等:广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离与培养549

湖北农业科学2009年

单层,可消化传代(图2)。倒置显微镜观察细胞呈梭状或不规则的三角形等典型的成纤维细胞形态,胞质近中央处有椭圆形胞核。传代的细胞生长均匀,细胞生长汇合并铺满瓶底时,细胞结构清晰,图案明显,形态规则并呈有序排列,成群细胞呈现放射状、漩涡状等走势(图3)。

2.3.2酶消化法胰蛋白酶热消化法,消化30 min,组织块略微减少,液体黏稠,50min后组织块大部分消化完全,剩余组织块连着纤维丝构成一团纤维团,消化液清亮,镜检不见细胞。胰蛋白酶冷热消化结合法,冷消化过夜后热消化40min,组织块略微减少,50min部分消化完全,之后不见组织块减少,液体内含一大团纤维团,消化液清亮,镜检不见细胞。联合胶原酶消化法,胶原酶消化20min后胰蛋白酶继续消化30min,组织块部分减少,消化50min后,组织块大量消失,液体有点黏稠,纤维团较小,但仍旧有较多纤维丝。镜检细胞量极少。而先用胰蛋白酶消化30min,后用胶原酶消化30~40 min,则只剩下少量未消化完的组织块,纤维丝与纤维团均消化不见,消化效果较好,镜检发现细胞量少;过滤离心后培养,细胞贴壁生长,呈典型的成纤维细胞形态(图4)。

2.4巴马香猪成纤维细胞生长曲线

成纤维细胞接种后1d细胞计数略微下降,2~4 d为缓慢生长期,5~6d细胞开始加速生长,6~8d细胞成倍增长,为细胞快速增长期,8d以后细胞又转为缓慢增长,为细胞增长平台期(图5)。

3小结与讨论

3.1取材处理方法

细胞取材的过程要尽量做到无菌,由于动物皮肤直接和自然环境接触,不可避免会带有许多的细菌等微生物,所以,取材时必须先去毛,否则很容易造成污染。其次要用75%酒精浸泡消毒。最好浸泡时间在30~60s内,不可超过60s,否则会对细胞造成损伤,影响细胞贴壁生长。此外,用含青霉素和链霉素的PBS反复漂洗也至关重要。作者采用每次75%酒精消毒后漂洗4遍,每遍更换培养皿。耳部组织块含有表皮层、真皮层、软骨,取材时尽量去除表皮和软骨。如果软骨不去除会增加组织块的厚度,影响组织块的贴壁,不易于日后细胞的游出。如有表皮未去除,一则由于表皮过硬,不易剪碎,

2009---广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离与培养

2009---广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离与培养

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在贴壁550

第3期

时容易造成组织块干燥脱水,细胞不易获取营养,从而引起细胞破坏死亡,组织块脱落。二则可能造成表皮细胞污染,虽说在今后的传代培养中可通过细胞纯化方法适当去除,但这种混合生长状态会对后续试验产生影响。本研究表明,去除表皮组贴壁率与未去除组间差异显著(P﹤0.05)。因此去除表皮有利于组织块贴壁。但是由于组织块很小,直接去表皮操作比较困难,且延长了取材时间,也容易造成污染。所以本研究采用0.25%胰蛋白酶消化液4℃冷处理过夜后,组织块疏松,有点黏糊,直接用镊子和眼科剪可以轻轻剪下表皮,不仅操作简便,且贴壁率与直接去表皮组无显著差异(P﹥0.05)。本试验结果与吴国选等[8]的研究相似。

此外,在剪切组织块时要注意始终保持组织块的湿润,这点要特别注意,且十分重要。徐皓[9]即采用滴加几滴培养液保持组织块湿润,取得了较好的效果。本研究采用滴加少许PBS亦取得较好的效果。剪切时,也要掌握好时间,尽量在短时间内完成。据Miguel等[10]的研究,在4℃或室温中保存一定时间的绵羊、山羊和牛的耳皮肤,经原代培养或玻璃化冷冻解冻后再经原代培养,可获得贴壁和汇合的成纤维细胞。因此取回的材料可以在4℃中保存一定时间,少于72h均可获得贴壁、汇合的细胞,但保存时间越短组织块游离出细胞及汇合的时间越短[11,12]。本研究中材料运回实验室,保存在4℃冰箱中2~8h不等,但经原代培养后均获得了贴壁和汇合的成纤维细胞,与上述结论一致。这样就有充足的时间进行细胞培养前的准备工作,以保证试验的无菌操作和顺利进行。

3.2原代培养方法

组织块在培养初不易贴壁或是贴壁后又脱落下来,这是导致组织块培养失败的原因之一。为此,我们采用了明胶固定法和干燥法促进其贴壁,取得了较好的效果。明胶固定时,培养皿最好用明胶热孵育1h左右,干燥法干燥时间最好在4~6h,时间过短不利于其贴壁,过长不利于细胞存活。此外,在培养初加液体不宜过多,且要减少移动培养皿的次数,避免过多晃动而造成组织块脱壁,亦可采用半换液法促进其贴壁。导致组织块培养失败的原因之二是组织块培养易被污染,本研究在利用组织块培养过程中,多次在培养第4天遭受污染而失败。分析原因主要是在换液过程中引起。因此补加液体时必须十分小心,且液体一定要浸没组织块。由于组织块培养法培养周期长,因此换液次数多,也增加了污染的机率。此外,若有组织块产生漂浮,一定要及早将漂浮组织块取出,否则很容易导致污染。

另外,对于组织块法培养猪耳成纤维细胞,本研究周期为13~15天,丁生财等[13]研究的周期为15天左右,吴国选等[8]研究的周期为7~9天,这可能与组织来自于不同年龄猪有关。刘伟等[14]研究发现,1周龄猪耳部组织分化程度低较容易培养,组织块法培养8~9天即可铺满整个瓶底,而成年猪耳部组织分化程度高,需要2周左右才能长满,这与本试验研究结果一致。组织块大小与细胞周期也有关。本研究对比了1~3mm3、3~5mm3、5~7mm3大小组织块的培养效果,结果发现,1~3mm3大小的组织块容易贴壁和逸出细胞,且差异显著(P﹤0.05),这与李扬等[15]的试验结果一致。由于污染率较高,尽管有部分数据不是来自于同一次材料,存在一定的误差。但总体来说,组织块在2mm3左右,有利于其贴壁。

本研究中采用胰蛋白酶热消化30min、40 min、50min;胰蛋白酶冷过夜处理后热消化40 min、50min、60min;胶原酶消化20min后胰酶继续消化30min、40min、50min等处理,均未能成功分离巴马香猪耳皮成纤维细胞,究其原因有以下几种。首先是消化出的细胞被束缚在纤维团中,不能游离于消化液中,故无法将细胞单独分离出来。作者通过加大消化液与沉淀量的比例以及吹打等措施以期减少纤维团,利于细胞游离,但效果不佳,尤其采用吸管吹,不仅不能将其吹散反倒促进成团,相对来说振荡效果较好。而丁生财等[13]、于珠玲等[16]采用酶消化法均成功分离并获得了足量的猪皮肤成纤维细胞。这可能与动物品种、年龄以及组织分化程度等不同有密切关系。于珠玲等[16]研究表明,同样的培养物,来自幼年个体比老年个体易于培养;来自同一个体的组织,分化低的组织细胞比分化高的容易培养。本研究中所取材料为4月龄的屠宰猪耳部皮肤,相对于于珠玲等[16]的1~6周龄幼猪耳部皮肤及丁生财等[13]的30日龄香猪腹部皮肤来说,成年猪耳组织分化程度高,细胞外含有较多结缔组织,妨碍了细胞从组织中释放出来。而胶原酶能够特异地作用于结缔组织的胶原,因此联合胶原酶法中,纤维团减少了许多。尽管先胶后胰法没能成功分离出细胞,但在后来的试验中,胰蛋白酶先消化30min后再用胶原酶消化30~40min,结果纤维团与纤维丝消失,成功分离出了成纤维细胞,这方法和陆凤花等[17]的研究相似。陆凤花等即采用胶原酶联合法中先胰后胶法成功分离出了成年水牛耳皮成纤维细胞。因此,本研究中胶原酶与胰酶作用时间的先后对分离产生了很大的影响,究其原因可能与两种酶的消化特性有关。其次是消化液的问题,新鲜配制的胶原酶消化效果相对要好一些。

杨素芳等:广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离与培养551

湖北农业科学2009年

(责任编辑王珞)

3.3培养基

细胞在体外生长的过程中受外界多种因素的

影响,如培养液、pH 值、温度等。其中血清是培养液中一个相当重要的成分,其主要作用是促进离体细胞的生长;此外,还能保护细胞免受机械损伤,促进细胞在基质上的附着和展开,终止胰酶的水解作用等。但血清成分复杂,不同来源或不同批次的血清质量不稳定,且有资料认为,血清对细胞有一定的毒害作用。因此,血清的质量、浓度与细胞生长增殖密切相关。徐静娟

[18]

的试验表明,小鼠成纤维细胞

在含有15%的小牛血清培养液中就能生长,但速度较慢;在含有20%小牛血清的培养液中能较好地生长、分裂。不同细胞类型及同一类型不同来源的细胞对血清质量和浓度的要求均不相同。吴国选等[8]的试验表明,猪皮肤成纤维细胞对血清质量要求较高,原代培养采用含10%小牛血清的DMEM 细胞生长缓慢,改用含10%胎牛血清的DMEM 则生长较快,融合成片。而丁生财等[13]、于珠龄等[16]采用含

20%的胎牛血清培养猪皮肤成纤维细胞均获得了较好的效果。本研究采用含10%的自制新生牛血清进

行原代培养。试验结果的不理想可能与采用的血清浓度及质量有紧密的关系。

3.4生长曲线

从本研究中绘制的广西巴马香猪耳皮成纤维

细胞生长曲线可以看出,用DMEM 培养的广西巴马香猪耳皮成纤维细胞,传代后滞留期较长,约需2d 时间。存活细胞逐渐贴壁伸展,在2~4d 细胞缓慢增殖,此后,细胞进入对数期,延续4d 左右,数量增加了8倍多;第8天,细胞发生接触抑制,进入平台期,可维持3天;第11天后细胞逐渐脱落死亡,细胞数也有所下降。试验表明,广西巴马香猪皮肤成纤维细胞要经历滞留期、对数期和平台期,分别为

0~2d 、2~8d 和8~12d 。与刘春霞等[19]和寇全安等[20]

得到的马和兔皮肤成纤维细胞的生长曲线基本一致,但与刘健明等[21]得到的大熊猫皮肤成纤维细胞生长曲线相差较大,各期时间分别为0~2d 、3~5d 和5~9d 。究其原因,可能与不同组织来源的成纤维细胞的生物学行为存在一定的差异有关。

参考文献:

[1]薛庆善.体外培养的原理与技术[M ].北京:科技出版社,2001.

[2]

WAKAYMA T ,PERRY A C ,ZUCCOTTI M ,et al.Full -term development of mice from nucleared oocyte injected with

cumulus cell nuclei [J ].Nature ,1998,394:369-374.[3]

KATO Y ,YABUUCHI A ,MOTOSUGI N ,et al.Develop-mental potential of mouse follicular epithelial cells and cu-mulus cells after nuclear transfer [J ].Bio Reprod ,1999,

61:1110-1114.[4]

ZAKHARTCHENKO V ,AIBERIO R ,STOJKOVIC M ,et al.Adult cloning in cattle :potential of nuclei from permanent cell line and from primary cultures [J ].Mol Reprod Dev ,

1999,54:264-272.

[5]POLEJAEVA I A ,CHEN S H ,VAUGHT T D ,et al.Cloned pigs produced by nuclear transfer adult somatic cells [J ].Nature ,2000,407:86-90.

[6]

HARRISON S ,BOQUEST A ,GRUPEN C ,et al.An effi-cient method for producing alpha (1,3)-2galactosyl trans-

ferase gene knockout pigs [J ].Cloning Stem Cells ,2004,6(4):327-331.

[7]

WILMUT I ,SCHNIEKE A E ,MCWHIR J ,et al.Viable off-spring derived from fetal and adult mammalian cells [J ].Na-ture ,1997,385:810-813.

[8]吴国选,伍津津,朱堂友,等.贵州小型香猪皮肤成纤维细胞库的构建[J ].中国临床康复,2004,29(8):6386-6388.[9]徐

皓,程随涛,张衍国.人皮肤成纤维细胞原代培养中组织块法及其注意事项[J ].第四军医大学学报,2005(26):74-75.

[10]

MIGUEL A S ,JUAN P S ,EENESTO A G.Vitrification of goat ,sheep ,and cattle skin samples from whole ear extir-pated after death and maintained at different storage times and temperatures [J ].Crybiology ,2004,49:221-229.

[11]王春生,张丽新,梁洋,等.4℃保存的绵羊皮肤成纤维细胞

的培养及冷冻[J ].四川动物,2007,26(4):804-806.

[12]王红梅,黄俊成,刘明军,等.利用动物耳皮肤组织培养成纤维细胞的研究[J ].草食家畜,2001(增):111-115.[13]丁生财,陈意生,魏泓,等.猪皮肤成纤维细胞的培养与鉴

定[J ].第三军医大学学报,2004,26(13):1171-1174.

[14]刘伟,吴华莉,张德福.猪耳成纤维细胞体外培养及EGFP 基因的转染[J ].上海农业学报,2007,23(4):10-13.[15]李

扬,郭继彤,吴凯峰,等.牛胎儿成纤维细胞的分离与培养

[J ].细胞生物学杂志,2002,24(4):254-256.[16]于珠玲,刘

娣,孙兴参,等.猪耳皮肤成纤维细胞的培养[J ].

细胞生物学杂志,2003,25(4):258-260.

[17]陆凤花,石德顺,牛向丽,等.水牛皮肤成纤维细胞的分离与体外培养[J ].细胞生物学杂志,2005(27):451-455.

[18]徐静娟.离体细胞的培养条件[J ].江南大学学报(自然科学版),2001,1(1):94-96.

[19]刘春霞,余凤玲,周欢敏,等.马皮肤成纤维细胞的分离与体外培养[J ].黑龙江畜牧兽医,2007(6):11-13.[20]寇全安,张涌,李裕强,等.兔成纤维细胞的分离与体外培养[J ].西北农业大学学报,1999,27(3):16-20.[21]

刘健明,陶

勇,韩

伟,等.小熊猫耳部成纤维细胞的培养和

冷冻保存[J ].安徽农业大学学报,2007,34(1):70-73.

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