大鼠脂联素(ADP)ELISA试剂盒说明书

大鼠脂联素（ADP)酶联免疫分析

试剂盒使用说明书

厦门慧嘉生物科技有限公司

本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中脂联素（ADP)的含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠脂联素（ADP)水平。用纯化的大鼠脂联素（ADP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂联素（ADP)，再与HRP标记的脂联素（ADP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂联素（ADP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠脂联素（ADP)浓度。

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上

清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心

20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程

中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/

分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备

用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上

进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标

准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为90 μg/L，60 μg/L ，30 μg/L，15 μg/L，7.5 μg/L）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样

品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此

重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止

液后15分钟以内进行。

注意事项：

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，

在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD

值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释

倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标

准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值

代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释

倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。

2.批内与批见应分别小于9%和11%

检测范围：

0.156 ng/ml-10 ng/ml

灵敏度：

0.039 ng/ml

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保存条件及有效期：

1.试剂盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6个月

elisa试剂盒

elisa试剂盒 Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM 抗体ELISA检测。 目录 1elisa试剂盒简介 2优点 3回收率 4发展 5使用方法 6制备方法 7影响 8检测原理 9操作步骤 10试剂器材 elisa试剂盒简介 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。 2优点 一、高效、灵敏、特异的抗体； 二、稳定的重复性和可靠性； 三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体； 四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型； 五、节省实验经费。

大鼠皮质醇(Cortisol)ELISA试剂盒说明书

大鼠皮质醇(Cortisol)酶联免疫分析试剂盒 使用说明书 厦门慧嘉生物科技有限公司 本试剂盒仅供体外研究使用! 预期应用 ELISA法定量测定大鼠血清、血浆或其它相关生物液体中皮质醇(Cortisol)含量。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗皮质醇(Cortisol)抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗皮质醇(Cortisol)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的皮质醇(Cortisol)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。ELISA法 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板：一块（96孔） 2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上， 然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为180 ng/ml，做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成180 ng/ml，90 ng/ml，45 ng/ml，22.5 ng/ml，11.25 ng/ml， 5.63 ng/ml，2.82 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。 如配制90 ng/ml标准品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 180 ng/ml的上述标准品加入含有 0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3. 样品稀释液：1×20ml。 4. 检测稀释液A：1×10ml。 5. 检测稀释液B：1×10ml。 6. 检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算 好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 7. 检测溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶 液A。 8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 11. 覆膜：5张 12. 使用说明书：1份 自备物品 1. 酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热） 2. 微量加液器及吸头，EP管 3. 蒸馏水或去离子水，全新滤纸

【CN110007091A】一种脂联素检测试剂盒及其制备方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910261668.4 (22)申请日 2019.04.02 (71)申请人 杭州博谱医药科技有限公司 地址 311121 浙江省杭州市余杭区仓前街 道龙潭路8号1幢105室 (72)发明人 朱永良　陈佳明　周沛沛　郑毓婕　 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 尉伟敏 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/74(2006.01) (54)发明名称一种脂联素检测试剂盒及其制备方法(57)摘要本发明属于医学检验领域，具体涉及一种人体内脂联素含量的检测试剂盒，其包括试剂R1以及试剂R2；试剂R1为包被脂联素单抗1的胶乳颗粒；试剂R2为包被脂联素单抗2的胶乳颗粒。本发明克服了现有的胶乳免疫比浊法脂联素检测试剂盒中试剂R1以及试剂R2在使用过程中会出现混合不均的现象，导致试剂空白以及反应幅度波动，同时试剂R2中的多抗会与Ⅷ型胶原、补体C1q 和Ⅷ因子有交叉反应，影响测试结果准确性，本发明中的试剂R1以及R2均为胶乳试剂，提升两者的混合均匀性，避免出现试剂空白以及反应幅度大幅波动的现象；通过将脂联素单抗替换传统试剂中使用的脂联素多抗，避免了额外的交叉反应， 提升了试剂的检测精确性以及稳定性。权利要求书1页 说明书9页 附图1页CN 110007091 A 2019.07.12 C N 110007091 A

1.一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括试剂R1以及试剂R2； 所述的试剂R1为包被脂联素单抗1(Adiponectin Monoclonal Antibody)的胶乳颗粒； 所述的试剂R2为包被脂联素单抗2(Mouse Anti-Human Adiponectin)的胶乳颗粒。 2.根据权利要求1所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1制备方法如下：将胶乳颗粒在活化准备液的作用下形成活性酯，再将所述活性酯与含有脂联素单抗1 (Adiponectin Monoclonal Antibody)的抗体溶液1反应，然后再加入封闭剂完成偶联，得到包被脂联素单抗1(Adiponectin Monoclonal Antibody)的胶乳颗粒R1。 3.根据权利要求2所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的抗体溶液1中脂联素单抗1(Adiponectin Monoclonal Antibody)的浓度为2mg/mL。 4.根据权利要求1所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂R2制备方法如下：将胶乳颗粒在活化准备液的作用下形成活性酯，再将所述活性酯与含有脂联素单抗2 (Mouse Anti-Human Adiponectin)的抗体溶液2反应，然后再加入封闭剂完成偶联，得到包被脂联素单抗2(Mouse Anti-Human Adiponectin)的胶乳颗粒R2。 5.根据权利要求4所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的抗体溶液2中脂联素单抗2(Mouse Anti-Human Adiponectin)的浓度为2mg/mL。 6.根据权利要求2或4所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的活化准备液为活化准备液1以及活化准备液2的组合物，其中所述的活化准备液1为N-羟基琥珀酰亚胺纯化水溶液，所述的活化准备液2为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐纯化水溶液。 7.根据权利要求6所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的活化准备液1的配制方法如下：准确称量50mg N-羟基琥珀酰亚胺，用2mL纯化水溶解，摇晃均匀得到活化准备液1；所述的活化准备液2的配制方法如下：准确称量30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用4mL纯化水溶解，摇晃均匀得到活化准备液2。 8.根据权利要求2或4所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的封闭剂为BSA 溶液或者吐温20溶液中的一种或两种的组合物。 9.根据权利要求8所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的BSA溶液为2%BSA 溶液，溶剂为纯化水；所述的吐温20溶液为5%吐温20溶液，溶剂为纯化水。 10.一种制备如权利要求1 ~9所述的脂联素检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括： （1）试剂R1的制备：制备包被脂联素单抗1(Adiponectin Monoclonal Antibody)的胶乳颗粒R1；（2）试剂R2的制备：制备包被脂联素单抗2(Mouse Anti-Human Adiponectin)的胶乳颗粒R2；（3）将试剂R1以及试剂R2单独分装，密封保存即得。 权　利　要　求　书1/1页 2 CN 110007091 A

人(Human)瘦素(LEP)ELISA试剂盒说明书

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断人（Human）瘦素（LEP）ELISA检测试剂盒 使用说明书 检测原理 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被瘦素（LEP）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的瘦素（LEP）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 样品收集、处理及保存方法 1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。 3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。 5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品 1.酶标仪（450nm） 2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3.37℃恒温箱 操作注意事项 1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。 2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。 3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。 4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。 5.所有液体组分使用前充分摇匀。

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

里！型！！塑型！！垫！婴！型塑坠！ 人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测。 刘德敏杨莉丽丁玉静孙颖于德民 摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编 码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆人ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２质粒，构建 融合表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２，ａｔｔＢ—ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３），以异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ＩＹｒＧ）诱 导表达脂联索融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴ ＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶转录水平的影响。结果：成功构建了表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ— ａｄｉｇｎｎｅｃｔｉｎ，ＤＮＡ序列测定结果与预期一致。ＩＰｒＧ诱导表达的融合蛋白经纯化后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定具有人脂联素抗 原性，并可使培养的肝细胞中葡萄糖－６一磷酸酶转录水平下降。结论：获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一 步研究脂联素的生理机制奠定了基础。 关键词脂联索克隆，分子基因表达肝细胞重组蛋白质类葡糖一６—磷酸酶大肠杆菌 ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｃｔＭｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＧｅｎｅ Ｌ１ＵＤｅｎｔｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｆｔ，ＤＩＮＧＹ删抽ｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＹＵＤｅｍｉｎ ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｗｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｐｉｔｕｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，Ｃｈｉｎａ ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｌｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｒｅｓｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏ咖ａｌａｅｆｉｖｉＶｉｎＥｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅⅧａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲＧａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｆｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄ ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２ｐｌａｓｍｉｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｓｉｔｅｒＢＰｒｅａｃｆｉｃｍａｎｄＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｎＢ—ａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎＷａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｅｏｌｉＢ１２｜ａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗⅡｅ ｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｌｎ，ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＷ８８ｐｕｎｆｉｅｄｂｙＮｉ?ＮＴＡａⅡｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｍａｔａｎｔ ａｄｉｐｏｎｅｅｆｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈ０８ｐｈａｔｏｎｅｗ∞ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ出啦ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥｓＴ４２ｆ戬啦＿ａｄｉｐ叫ｅｃ血ｗ啦ｅｍａｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ｐｕｒｉｆｉｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｓｈｏｗｅｄａｎｄｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｓｋｏ”６一ｐｈ０８ｐｈａｔａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｗｅｈａｖｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈａｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｖ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓｇｌｕｅｏｓｅ一６一 ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｅｓｃｈｅｆｉｃｈｉａｃｏｌｉ 人脂联素（ａｄｉｐ（、ｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含予。该基因编码的脂联素蛋白在血浆中分子质量为２８ｋｕ。脂联素在血循环中含量较高，其血浆浓度约占总血浆蛋白的Ｏ０１％ｒ”。目前，脂联素在调节血糖稳态、抗动脉粥样硬化及抗炎等方面的作用已有较为肯定的认识［２１。脂联素在治疗领域的尝试也已开始，为了能够更好地了解脂联素的结构及作用机制，本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达系统快速构建了人脂联素原核表达载体，表达并纯化了重组脂联素蛋白。 １材料与方法 １．１材料大肠杆菌ＤＨＳａ及Ｂ１２１（ＤＥ３）均为本实验室保存，质粒ｐＭＤｌ８一Ｔ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品。质粒ｐＤＯＮＲ２０１，ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２以及Ｇａｔｅｗａｙ表达体系均为［ｎｖｉｔｒａｇｅｎ公司产品（澳大利亚新南威尔士大学齐建成教授馈赠）。Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶为ｐｍｍｅｇｎ产品。兔抗人脂联素多克隆抗体购自Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ｌｇＧ为北京中杉公司产品。蛋白纯化试剂盒以及１６４０培养基为Ｎｏｖｏｇｅｎ公司产品。蛋白复性用ＮＤＳＢ２０１由美国Ｓａｎｔａｃ［ｕｚ公司ＴｏｍｍｉｅＬｅｅＳｔａｄｉｎｇ先生馈赠。异丙基硫代一８一Ｄ一半乳糖苷（Ｉ丌Ｇ），二硫苏糖醇（ＤＷｒ）等均为进口或国产分析纯试剂。 １，２方法 １．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ的提取和脂联素基因的克隆新鲜皮下脂肪组织标本取自一行子宫痛切除术且无代谢性疾病者。提取总ＩＬＮＡ。将１ｔｒｇ总ＲＮＡ．７２℃变性２ｍｉｎ后迅速冰浴降温，加入１５此逆转录酶混合液（２ＵＲｎａｓｅ抑制剂， ?天津市教委基金资助项目（项目编号：２００３０２５）；天津市自然科学基金资助项目（项目编号：０４３６０９２１１） 作者单位：３（ｍ０７０天津医科大学代谢病医虢 　万方数据

人CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)ELISA检测试剂盒说明书

人CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）ELISA检测试剂 盒说明书 本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆 樊克生物专业供应： 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）含量。 试验原理： CX3CR1试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知CX3CR1浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板 内进行检测。先将CX3CR1和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合 的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中CX3CR1的浓度呈比例关系。 试剂盒内容及其配制 试剂盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制 96/48人份酶标板1块板（96T）半块板（48T）即用型 塑料膜板盖1块半块即用型 标准品：80ng/ml 1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按说明书进行稀 稀 空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型 标准品稀释缓冲液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型 生物素标记的抗CX3CR1抗体1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型 亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型 洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按说明书进行稀 释 底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型 底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型 终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型 标本稀释液1瓶（12ml）1瓶（6.0ml）即用型 自备材料 1．蒸馏水。 2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。 3．振荡器及磁力搅拌器等。 安全性 1．避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

人脂联素(ADPN)

人脂联素（ADPN)酶联免疫检测 试剂盒使用说明书 使用前仔细阅读本说明书。本酶联免疫试剂盒是基于双抗体夹心技术原理，来检测人脂联素（ADPN)，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。 用途：用于人血清、血浆及相关液体样本中脂联素（ADPN)的测定。 工作原理 本试剂盒采用的是双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中人脂联素（ADPN)的水平。向预先包被了人脂联素（ADPN)单克隆抗体的酶标孔中加入脂联素（ADPN)，温育；洗涤后，加入HRP标记过的脂联素（ADPN)抗体。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中人脂联素（ADPN)的浓度呈正相关。 试剂盒组成 需要而未提供的试剂和器材 1．37℃恒温箱。 2．标准规格酶标仪。 3．精密移液器及一次性吸头 4．蒸馏水， 5．一次性试管 6．吸水纸 注意事项 1．从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。 3．建议所有标准品、样本都做双份检测。如标本中待测物质含量过高，请先用样品稀释

液稀释一定倍数（n倍）后再按说明书操作进行测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 4．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。 5．为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。 6．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 7．底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。 洗板方法 手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 标本要求 1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 操作程序 1．标准品的稀释：（本试剂盒提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比 2 测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。 轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。 3．弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。 如此重复5次，拍干。 4．每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。 5．弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。 如此重复5次，拍干。 6．每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。 7．取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 8．测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。 9．根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD 值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了的，其实际浓度应该乘以总稀释倍数。 操作程序总结：

脂联素的检测意义

脂联素的检测意义 检测方法： LC-MS/MS 送检要求： 样本采集：早晨7:30-10:30用EDTA抗凝管（紫帽管）空腹采血，成人4ml，儿童2ml。采血时根据医嘱要求坐位或卧位采集相应血液样本。 样本保存：样本采集后应及时分离血浆（离心条件:×1000g，5-10分钟），装入冻存管并冷冻避光保存待检。48h内全程冷冻避光运输至实验室。 注意事项： ①采血前患者准备：抽血前1天应以清淡饮食为主，避免抽烟，禁止喝酒，避免熬夜。应提前半小时到采血地点静坐或站立等待采血，避免剧烈运动及情绪激动后采样。当日采血前停用激素治疗药物。 ②拒收样本：非EDTA抗凝血浆。

激素在人体内含量低，结构相似物多，甚至有同分异构体存在。传统的免疫学技术因检测方法的局限性，易受多因素干扰，其灵敏度和特异性较低。质谱技术可以准确识别化合物小分子，检测浓度可达ng 级、pg级甚至fg级，大大提高了检测的灵敏度和特异性。2013年美国内分泌学会在临床内分泌与代谢杂志（Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism）发表声明，宣布自2015年开始只接受质谱方法检测激素的研究结果，这无疑肯定了质谱方法在内分泌激素检测中的重要性。 金域采用Waters UPLC I-Class-TQ-S建立的液相色谱质谱方法特异性高，可实现11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质酮的色谱分离和17-羟孕酮、11-脱氧皮质酮的色谱分离；检测范围宽和灵敏度高，如雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮、双氢睾酮检测下限可至50pg/ml，检测上限可至20000pg/ml。检测下限可同时实现男性中雌激素和女性中雄激素的检测，检测上限也能满足男性中雄激素和女性特殊时期中雌激素的检测。建立的方法不仅满足了很好的灵敏度，而且实现了优良的特异性，充分发挥了液相色谱串联质谱在激素检测中的优势。

人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书,5羟基吲哚乙酸ELISA检测试剂盒

人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书，5羟基吲哚乙酸ELISA检测试 剂盒 人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书，5羟基吲哚乙酸ELISA检测试剂盒 产品规格：96T/48T。 供应商：上海乔羽生物有限公司 上海乔羽有限公司，有elisa试剂盒，抗体，培养基 人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书，5羟基吲哚乙酸ELISA检测试剂盒其主要特点如下 专一性强：抗原与抗体的免疫反应是专一反应，而免疫酶技术以免疫反应为基础，所检测的对象是抗原（或抗体），使用的抗体除标记了酶以外，与普通抗体的免疫反应特性并无多大差别。 灵敏度高：由于抗体联结上了酶，因此，借助于酶与底物的显色反应，显示抗原与抗体的结合，大大提高了检测的灵敏性，使检测水平接近放射免疫测定法。 人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书，5羟基吲哚乙酸ELISA检测试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。 1.标准品复溶：试剂盒提供6管标准品，每管已标定浓度，并且冻干。实验前在每个标准品管中加入0.5mL 样本稀释液，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动助其溶解，使其恢复为每个标准品管身标注的浓度。 2.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。 人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书，5羟基吲哚乙酸ELISA检测试剂盒试剂的准备： 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 ELISA试剂盒的优势： 全面——混合8 种不同的常见抗原，对自身免疫性疾病进行全面筛查。

人脂联素(ADP)ELISA试剂盒说明书

人脂联素ADP)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 厦门慧嘉生物科技有限公司 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中脂联素（ADP)的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人脂联素（ADP)水平。用纯化的抗-脂联素（ADP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂联素（ADP)，再与HRP 标记的脂联素（ADP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂联素（ADP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人脂联素（ADP)浓度。 试剂盒组成： 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程

中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为900μg/ L,600μg/ L ,300μg/ L, 150μg/ L, 75μg/ L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

脂联素的检测意义

脂联素水平测定的临床意义 肥胖（肥胖儿童，肥胖成人，内脏肥胖） 评估肥胖的程度和类型，监测肥胖的发生和发展，预测II型糖尿病和动脉粥样硬化的发生和发展以及判断肥胖的预后是早期干预的目标，也是减肥效果的指标，并可以用于监测药物引起的肥胖症（抗精神病药）。 葡萄糖代谢异常，脂质代谢异常，胰岛素抵抗 脂联素的变化在预测心血管疾病风险方面比葡萄糖代谢紊乱和脂质代谢紊乱更早，这是胰岛素敏感性的评价指标之一，也是胰岛素抵抗发生和发展的重要标志。 代谢综合征 作为特征标记之一，它可用于预测疾病的发生和发展，并观察疾病的动态。它是干预治疗的目标。 II型糖尿病

它是儿童II型糖尿病的预测，早期诊断，鉴别诊断，预后和治疗的重要标志。它用于监测II型糖尿病及其并发症的发生和发展，并作为II型糖尿病及其并发症的治疗靶标。第一代糖尿病患者中II型糖尿病的早期指标。 冠状动脉心脏疾病 冠心病的发生，发展和严重程度的监测指标可用于预测冠心病的状况，诊断冠心病和评估治疗效果。 高血压 严重程度判断的新指标是糖代谢异常的原发性高血压的特征指标。它也可用于判断原发性高血压患者的左心室舒张功能和左心室肥大。它是高血压肥胖症治疗的目标。 心血管疾病 它是预测心血管事件发生的重要指标。急性心肌梗塞的发生和发展，动态观察指标；急性脑梗塞的发生预测，病情变化和预后判断，脑梗塞的治疗目标；预测不稳定型心绞痛的发生和治疗目标，对心绞痛患者的动脉粥样硬化疾病发展进行预测；慢性心力衰竭

的治疗目标；动脉粥样硬化的替代指标（脂联素和动脉僵硬度），内膜中层厚度或狭窄程度。 多囊卵巢综合征 疾病发展的长期指标之一。 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征 疾病监测和治疗的目标。 肝病 脂肪肝，非酒精性脂肪肝的治疗目标，肝纤维化的可能目标。 肾脏疾病 它是预防和干预多种肾脏疾病中心血管疾病的指标。 妊娠 预测早产，监测妊娠高血压的发生和发展，预测妊娠先兆子痫，预测和评估妊娠糖尿病。

小鼠Ⅰ型胶原 (Col I)-ELISA试剂盒说明书

小鼠Ⅰ型胶原 (Col I)酶联免疫吸附测定试剂盒 使用说明书 产品编号：E-EL-M0314 （本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!） 声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。本产品选用世界著名生产厂家的原料，采用专业ELISA kit生产技术制造。适用于体外定量检测小鼠血清、血浆、组织匀浆或细胞培养上清液中天然和重组Col I浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分！如有疑问，请及时联系伊莱瑞特生物科技有限公司。 *: [96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整）

检测原理: 本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗小鼠Col I抗体包被于酶标板上，实验时标本或标准品中的Col I会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠Col I抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗小鼠Col I抗体与结合在包被抗体上的小鼠Col I结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下现蓝色，加终止液后变黄。用酶标仪在450nm波长处测OD值，Col I浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线求出标本中Col I的浓度。 标本收集: 1.血清：全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集 血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。 2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA.Na2，标本采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可 检测。避免使用溶血，高血脂标本。 3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，以去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞 会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g 离心5~10分钟，取上清检测。 4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。 5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测 （具体处理方法可参考：https://www.wendangku.net/doc/923931735.html,/news2.asp?tid=477 ） 6.标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。 7.标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃/-80℃冰箱内，避免反复冻融， 1-6月内检测,4℃保存的应在1周内进行检测。 8.如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议先做 预实验，以确定稀释倍数)。 试验所需自备物品: 1.酶标仪(450nm波长滤光片) 2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 3.37℃恒温箱, 双蒸水或去离子水 4.吸水纸

大鼠脂联素(ADP)ELISA试剂盒说明书

大鼠脂联素（ADP)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 厦门慧嘉生物科技有限公司 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中脂联素（ADP)的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠脂联素（ADP)水平。用纯化的大鼠脂联素（ADP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂联素（ADP)，再与HRP标记的脂联素（ADP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂联素（ADP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠脂联素（ADP)浓度。 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程

中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为90 μg/L，60 μg/L ，30 μg/L，15 μg/L，7.5 μg/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

Notch信号介导全反式维甲酸抑制大鼠后肢芽基质细胞软骨发育形成的作用

目录 目录...........................................................I 缩略语........................................................II 中文摘要.....................................................III 英文摘要.....................................................IV 第1章前言. (1) 第2章材料与方法 (5) 第3章结果 (19) 第4章讨论 (30) 第5章结论 (36) 部分实验试剂配制 (37) 参考文献 (38) 致谢 (41) 个人情况简介 (42) 附文 (44)

第1章前言 先天性马蹄内翻足(CCF，congenial clubfoot)是严重危害儿童身心健康的常见先天畸形之一，发病率约为1‰[1]，我国每年有高达3万余名CCF患儿出生[2]。该病畸形顽固，容易复发，年龄及畸形的严重程度是选择治疗方法的最主要根据，早期一般采用软组织松解术，晚期或骨骼接近发育成熟时多采用骨性手术。手术使瘢痕组织增生，解剖结构遭到破坏，影响足的发育和活动度。目前CCF的发病机制尚不明确。因此，阐明CCF畸形形成的机制，对于CCF的产前诊断及防治具有重要的意义。 流行病学的调查研究表明，遗传因素在CCF的发病中起到了重要作用，目前公认CCF 的致病因素是遗传因素和环境因素共同作用的结果。CCF的遗传模式被称为复合性遗传，其特点包括：①多因素遗传；②非遗传因子如环境毒物、病毒等作用；③有一个因素性的基因，但是受到其他因素如基因、环境的调控和影响；④虽然发生畸形的原因各不相同，但是表型相似[3]。 近期的研究表明：先天性马蹄内翻足畸形程度与骨骼发育密切相关，CCF患者晚期骨骼病理改变明显:①跗骨排列异常，舟骨、跟骨向距骨的内侧和跖面移位；②距骨头、颈向跖面内侧旋转；③足部骨骼生长发育障碍，发生小足畸形。因此，多数学者认为CCF 原发病因主要是骨骼的发育异常。 Fritsch[4]通过对马蹄内翻足距骨骨化的不同发育阶段进行比较，发现本病的骨改变主要发生在距骨。在CCF的距骨中，骨化沟发育紊乱，软骨通道相对骨化中心来说数量较多，导致距骨骨化中心相对较小且偏位。距骨变形且比正常小，颈向内、跖面旋转，颈体角减小15o～4Oo距骨的舟面转向内、跖面。距舟关节呈半脱位，距骨滑车前部脱离踝穴，形成踝距下关节后方及跟腱挛缩纤维化继而产生马蹄畸形。跟距关节渐向内倾斜，跟骨内翻，骰骨转向内侧并且肥大，跟骰关节面亦向内、跖面旋转。这些导致了足的内翻畸形及足的内侧软组织挛缩[5]。Song等应用三维MRI重建结合标本切片技术，重构三维成像，清晰地显示了距、跟骨相对于双踝轴线角向中线旋转[6]。Miyagi等应用影像学方法，发现CCF中跗骨的骨化较正常的晚。认为距骨的改变是主导的，距骨颈的骨骺异常，比正常小且偏位，位于颈的前下方，而前上方血管少，过度早熟，有血管突破中断了软骨细胞增殖区，妨碍了软骨向软骨内成骨的连续发展过程[7]。 脊椎动物的骨骼发育主要有两种形式：膜内成骨和软骨内成骨[8]。软骨内成骨是脊椎