脲酶测定方法
这是测得的水稻土壤的几种酶的方法，应该说许多作物酶的方法应该大同小异，我就把几种酶的测定集中在一块了。若有雷同，也是不可避免的。
脲酶urease（水解酶）：
脲酶试验原理：
存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。
土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。
试剂：1）甲苯
2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液
标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500μg/g，另1份相应加入1.5ml
的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d （前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。
1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。
2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟
3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合
4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h
5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。
6) 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现（青定）酚的蓝色。
7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。
8) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照
9)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。
结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3－N的毫克数表示。
M＝（X样品－X无土－X无基质）*100*10
式中：M－土壤脲酶活性值
X样品――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数
X无土――无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数
X无基质――无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数
100 ――样品定容的体积与测定时吸取量的比值
10 ――酶活性单位的土重与样品土重之比值
注意事项：当脲酶活性为3-80微克NH3-N时，本法能获得可靠结果。当脲酶活性小于3微克NH3-N，培养时间需增至24小时（已经24h了）（计算时应考虑这一点）
计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示。
NH3-N（mg）＝a*2
A：从标准曲线查得NH3-N毫克数
2 ：换算成1k土的系数
土壤脲酶活性测定（NH4+释放量法）
脲酶是酰胺水解酶的一种，在自然界中分布广泛，植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。脲酶催化尿素的水解反应：
在反应过程中，氨基甲酸盐是中间产物。脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等化合物的水解。脲酶含有镍，分子量在151，000 Da～480，00 Da之
间。能够抑制脲酶活性的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50的重金属的盐、含氟化合物、醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。
1、试验原理
通过对新鲜土壤与尿素溶液在37℃培养2h后测定氨释放量，估计脲酶的活性(Tabatabai,1994)。
2、试验仪器
50mL容量瓶；培养箱或恒温水浴；蒸馏定氮仪。
3、试验试剂（所用试剂均为分析纯）
A、甲苯（C6H5CH3）;
B、缓冲液：三（羟甲基）氨基甲烷[c（C2H8O3N3）=0.05mol·L-1，pH9.0]：称取6.1g三（羟甲基）氨基甲烷溶入700mL蒸馏水中，用c（H2SO4）=0.2mol·L-1的硫酸溶液调pH至9.0，再用蒸馏水定容至1000mL;
尿素溶液{c[CO(NH2)2]=0.2 mol·L-1}：称取1.2g尿素溶入约80mL缓冲液中，后用该缓冲液定容至100mL。尿素溶液要当天配制，并在4℃下保存备用；
氯化钾硫酸银混合溶液[c（KCl）＝2.5mol·L-1]－[ρ（Ag2SO4）=100mg·L-1]：先将100mg Ag2SO4溶于700mL蒸馏水中，再加入188g的KCl （分析纯）使之溶解，在定容至1000mL；
氧化镁（MgO）：于高温电炉中，将氧化镁在600℃-700℃温度下灼烧2h，再放置于干燥器中冷却，贮于瓶中；
混合指示剂：溶解0.099g的溴甲酚绿和0.066g甲基红于100mL的乙醇（95％）中；
硼酸指示剂溶液[ρ（H3BO3）=20g·L-1]：溶解20g硼酸于950mL的热蒸馏水中，冷却，加入20mL的混合指示剂，充分混匀后，小心滴加氢氧化钠溶液[c(NaOH)=0.1mol·L-1],直至溶液呈红紫色（pH约4.5），稀释成1L；
硫酸标准溶液[c（1/2H2SO4）=0.005mol·L-1]。
4、试验步骤
将5.00g新鲜土样（<2mm）放置于50mL容量瓶中，加入0.2mL甲苯（试剂a）和9mL缓冲溶液（试剂b），轻摇混匀后加入1.0mL尿素溶液（试剂c），再次轻摇混匀并塞上瓶塞。在37℃下培养2h。然后加入约35mL的KCl-Ag2SO4溶液（试剂d），轻摇容量瓶几秒钟后，放置至室温（约5min），用KCl-Ag2SO4溶液定容，摇匀。同时要仪同样步骤做空白，只是培养2h后先加35mL的KCl-Ag2SO4溶液，然后加入1.0mL尿素溶液。
蒸馏法测氨：取土壤悬浮液20mL至蒸馏瓶中，加入0.2g的MgO，用硼酸指示溶液吸收，蒸馏液的体积约为30mL。用c（1/2H2SO4）＝0.005 mol·L-1的H2SO4标准溶液滴定。
5、结果计算
式中：ω（N）－单位时间内氨态氮的释放量，mg·kg-1h-1；
c－1/2H2SO4标准溶液的浓度，mol·L-1；
V－H2SO4标准溶液的体积，mL；
ts－分取系数，2.5；
14－氮的摩尔质量，mg·mmol-1；
2－培养时间，2h；
m－样品质量，g；
k－水分系数。
6,注意：
a,与其他缓冲液（如磷酸盐缓冲液）相比，三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液优点在于它能够有效地防止铵的固定。在配制该缓冲液时必须用硫酸而不是盐酸来调pH，因为后者能够促进脲酶的活性；
b,在配制KCl-Ag2SO4溶液时，应将KCl溶于溶解后的Ag2SO4溶液中，因为Ag2SO4在KCl溶液中不溶。加入KCl-Ag2SO4混合溶液后脲酶的活性停止，因此该悬浮液在测定氨之前可以放置2h。
方法来源：鲁如坤,土壤农业化学分析方法,北京,中国农业科技出版社,2000.
土壤酶活性测定方法
土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）
一、原理
脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。
土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
二、试剂
1）甲苯
2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml 丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B 液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。(NaClO分子量74.5,Cl原子量35.5,活性氯比例为47%,0.9%为质量百分比,所以: 假设配1000克溶液,则需要NaClO为x克,水1000-x克,0.47x=0.9,所以x=1.9克
即称取1.9g次氯酸钠，溶于1000ml水即可。)
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml 含有0.1mg氮的标准液。绘制标准曲线时，再将此溶液稀释10倍供用。三、操作步骤
标准曲线制作：分别吸取稀释后的标准液0、1、3、5、7、9、11、13ml，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm 波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。 15min后加10ml 10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取3ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml
次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm 波长处比色。
注意事项:
1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。
2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。
3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样
四、结果计算：
脲酶活性以24小时后5g土壤中NH3－N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。
NH3－N=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m
式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；
a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；
a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；
V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；
m表示烘干土重
土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比色法）
一、原理
测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。研究证明：磷酸酶有三种最适PH值：4~5、6~7、8~10。因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的PH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常用的PH缓冲体系有乙酸盐缓冲液（PH5.0~5.4）、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH7.0~8.5）、和硼酸缓冲液（PH9~10）。磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠等。现介绍磷酸苯二钠比色法。
二、试剂
1）缓冲液：
a. 醋酸盐缓冲液 PH 5.0
0.2mol/L 醋酸溶液: 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.
0.2mol/L 醋酸钠溶液: 16.4g C2H3O2Na或27g C2H3O2Na.3H2O溶至1L。或者
取14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液稀释至1L.
b. 柠檬酸盐缓冲液 PH 7.0
0.1mol/L 柠檬酸溶液： 19.2g C6H7O8溶至1L.
0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.
取6.4ml 0.1mol/L 柠檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至100ml.
c. 硼酸盐缓冲液 PH 9.6
0.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至1L.
0.2mol/L NaOH溶液 8g NaOH溶至1L.
取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀释至200ml.
2）0.5% 磷酸苯二钠（用缓冲液配制）
3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺，用10ml 95%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
4）甲苯
5）0.3%硫酸铝溶液
6）酚标准溶液
酚原液：取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，存于棕色瓶中。
酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液稀释至1L。
7）PH9.4硼酸缓冲液
0.2 mol/L硼酸：12.37g硼酸加水溶解稀释至1000ml
0.05 mol/L硼砂：19.07g硼砂加水溶解稀释至1000ml
取800ml硼砂溶液加200ml硼酸溶液混合即为PH9.4硼酸缓冲液。
三、操作步骤
标准曲线绘制：取0、1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml PH9.4硼酸缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度。30min后，在分光光度计上660nm处比色。以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
称2g土样置于200ml三角瓶中，加5滴甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，37℃下培养24h。然后在培养液加入40ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，于分光光度计上660nm 处比色。
注意事项:
1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。
2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。
3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样
四、结果计算
以24h后1g土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。
磷酸酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m
式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
V为显色液体积；
n为分取倍数；
m表示烘干土重
土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）
一、原理
蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量、微生物数量及土壤呼吸强度有关。一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
二、试剂
1）8%蔗糖溶液
2）PH5.5磷酸缓冲溶：1/15M磷酸氢二钠（11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L 蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml 即成。
3）甲苯
4）3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）
称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。
5）标准葡萄糖溶液：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取0.5g葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至100mL容量瓶中，定容，摇匀。即为5mg还原糖/mg的溶液。冰箱中4℃保存期约一星期，若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。
三、操作步骤
（1）标准曲线绘制
分别吸葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温。将溶液转移至100ml容量瓶中，定容。以空白管调零在波长508nm处比色，以吸光度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
（2）土壤蔗糖酶测定
称取2 g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5ml pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入小试管中，加3ml DNS试剂，在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将试管移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后将试管内液体转移至100ml容量瓶中，并用蒸馏水定容稀释至100ml。在分光光度计上于508nm处进行比色。
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。
四、结果计算：
蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。
蔗糖酶活性=（a样品－a无土－a无基质）*V*n/m
a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；
V为显色体积；
n为分取倍数；
m为土重。
过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）
一、原理
过氧化氢广泛存在于生物体和土壤中，是由生物呼吸过程和有机物的生物化学氧化反应的结果产生的，这些过氧化氢对生物和土壤具有毒害作用。与此同时，在生物体和土壤中存有过氧化氢酶，能促进过氧化氢分解为水和氧的反应（H2O2→H2O+O2），从而降低了过氧化氢的毒害作用。土壤中过氧化氢酶的测定便是根据土壤（含有过氧化氢酶）和过氧化氢作用析出的氧气体积或过氧化氢的消耗量，测定过氧化氢的分解速度，以此代表过氧化氢酶的活性。测定过氧化氢酶的具体方法比较多，如气量法：根据析出的氧气体积来计算过氧化氢酶的活性；比色法：根据过氧化氢与硫酸铜产生黄色或橙黄色络合物的量来表征过氧化氢酶的活性；滴定法：用高锰酸钾溶液滴定过氧化氢分解反应剩余过氧化氢的量，表示出过氧化氢酶的活性。本实验重点采用高锰酸钾滴定法。
二、试剂
1.5mol/L H2SO4溶液:量取42ml浓硫酸稀释至500ml；
0.3%的H2O2：将30%双氧水稀释100倍，其浓度用高锰酸钾滴定；
饱和明矾溶液：铝钾矾即明矾在20℃的溶解度为10.84g，30℃的溶解度为15.41g；
0.02mol/L高锰酸钾：称取3.16g高锰酸钾溶解定容至1L，其准确浓度用草酸钠标定；
三、操作步骤
分别取2g土壤样品于三角瓶中，加入40ml蒸馏水，加5ml0.3%的H2O2溶液，立即将三角瓶瓶口密封起来。震荡20分钟后加入1ml饱和铝钾矾，立即过滤于盛有5ml1.5mol硫酸的三角瓶中，滤干后，吸取滤液25ml，用0.02mol/L高锰酸钾滴定至紫红色，同时做无土对照。
四、结果计算（如下面处理）：
KMnO4标定：准确称取0.13-0.16g草酸钠置于250ml三角瓶中，加30ml谁和20ml1.5mol/L的H2SO4，加热至75℃左右，用KMnO4 滴定至紫红色。
刚开始滴定溶液就会变成紫红色，此时并不是滴定终点。等刚开始出现的紫红色褪色之后，再继续滴定至紫红色，直到30 S 紫红色不褪色为止。
H2O2标定：吸取5ml H2O2 加入10ml1.5mol/L的H2SO4 ，用KMnO4滴定至紫红色。
过氧化氢酶活性以20min内每克土壤分解的过氧化氢的毫克数表示
过氧化氢酶活性= (V-V S)C*51/V0*17/W
V：为滴定空白所用的KMnO4 体积；
V S ：为滴定样品所用的KMnO4 体积；
C：为KMnO4 浓度；
V0 ：为滴定体积25ml；
W：为土重；
过氧化物酶活性测定（比色法）
一、试剂
（1）1%邻苯三酚溶液
（2）0.5%H2O2 溶液
（3）乙醚
（4）0.5mol/L HCL
(5) PH4.5柠檬酸-磷酸缓冲溶液:
0.1mol/L 柠檬酸溶液：19.2g C6H7O8溶至1L. 取
0.2mol/L 磷酸氢二钠溶：53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O 溶至1L.
取10.65ml柠檬酸和9.35mlNa2HPO4混匀(用量较多可以乘以倍数配制),之后再用这两种溶液调节PH即可.
（6）重铬酸钾标准溶液以及标准曲线：0.75g重铬酸钾溶于1L0.5molHCL。此时的溶液相当于50ml醚中含有5mg紫色没食子素。
（7）标准曲线：取重铬酸钾标准溶液0、1、2、4、6、8ml，用0.5mol的HCL
稀释至50ml。定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。
二、操作步骤
取1g土壤置于150ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液和
2ml0.5%H2O2溶液。震荡后放置30℃恒温培养箱中培养2小时。取出后加
4mlPH4.5的柠檬酸-磷酸缓冲溶液，再加35ml乙醚，用力震荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相比色。比色波长为430nm。为了防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色槽一次。实验需设置空白实验以及无基质（不加邻苯三酚）作为对照。
过氧化氢酶活性，以2h后，1g土壤生成的紫色没食子素毫克数表示。
过氧化物酶活性=（a样品-a空白-a无基质）*V/m
a为标曲上相对应的浓度，V为显色体积，即为乙醚的体积35ml。
参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法
一、土壤蔗糖酶
3，5- 二硝基水杨酸比色法：
1、试剂的配制
①3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢
氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）
②pH5.5磷酸缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2HPO4.2H2O溶于
1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）
9.5ml即成。
③8%蔗糖溶液。
④甲苯。
⑤标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58℃条件下，真空干燥至恒重。
然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5ml还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。
标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。
2、操作步骤称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入15ml8%蔗糖
溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml 容量瓶中，加3ml3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。
溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。
无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
3、结果计算蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫克数表
示。
葡萄糖（毫克）=a×4
式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数
4——换算成1g土的系数
二、土壤淀粉酶
3，5- 二硝基水杨酸比色法:
1、试剂配制
①1%淀粉。
②甲苯。
③pH5.6磷酸盐缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2HPO4.2H2O溶
于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。
④3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢
氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）
⑤麦芽糖（C12H22O11.H2O）标准溶液：配制每毫升含0.02—2mg麦芽糖液
为标准液。
标准曲线绘制：分别取不同浓度麦芽糖标准液1ml，移于50ml容量瓶中，加2ml 3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却。定容后在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
2、操作步骤称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入10ml 1%淀粉
溶液，再加10ml pH5.6磷酸盐缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
培养结束后，将悬液迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线的显色方法进行比色测定。
为了消除土壤中原有的蔗糖、麦芽糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。
无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
3、结果计算蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫克数表
示。
葡萄糖（毫克）=a×4
式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数
4——换算成1g土的系数
三、土壤脲酶
靛酚比色法:
1、试剂配制：
①甲苯。
②10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
③柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾分别溶于
蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000ml。
④苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和
18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml
水中（B液）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将A、B溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
⑤次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
⑥氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，
得到1ml含有0.1mg氮的标准液。
标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
2、操作步骤
①称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。
②向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分
钟
③之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔
细混合。
④将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h。
⑤培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液
用致密滤纸过滤于三角瓶中。
⑥显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震
荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现（青定）酚的蓝色。
7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用
1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。
8) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，
整个实验设置一个对照
9)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每
个土样都设此对照。
3、结果计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示。
NH3-N（mg）＝a×2
式中 A——从标准曲线查得NH3-N毫克数
2 ——换算成1g土的系数。
四、蛋白酶活性
采用茚三酮比色法测定
1、试剂配制
1}1%的酪素溶液：用pH7.4的0.2M磷酸盐缓冲溶液配制。
pH7.4的0.2M磷酸盐缓冲溶液：0.2M磷酸氢二钠（27.8gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）19ml加0.2M磷酸二氢钾（53.65g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）81ml即成。2}0.1N硫酸。1个当量浓度（1N）的硫酸,即0.5mol／L的硫酸：
（0.5＊98／98％）／1.84＝27.17mL 量取27.17毫升98％的浓硫酸（密度1.84g ／mL），缓慢倒入约900毫升水中，搅拌，待冷却后转移至1L容量瓶中，加水至刻度，即得1N硫酸。
3}20%硫酸钠。100ml水中，20g硫酸钠
4}2%茚三酮液：2g茚三酮溶于100ml丙酮。
①甲苯。
②甘氨酸标准溶液：取0.1g甘氨酸溶液水中，定容1L，则得1ml含0.02mg氨
基氮的标准液。再稀释10倍做成标准液。
标准曲线的绘制：分别吸取工作液1,3,5,7,9,13ml移于50ml容量瓶中，加1ml 的茚三酮，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10min，将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。在风光光度计上于500nm处比色测定颜色深度。以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制曲线。
3）操作步骤称4g风干土，置于50ml三角瓶中，加20ml1%酪素溶液和1ml
甲苯，小心振荡后用木塞盖紧，在30℃恒温箱中培养24h。培养结束后，于混合物中加2ml0.1N硫酸和12ml 20%硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后
离心15min(6000转/min)。取上清液2ml，置于50ml容量瓶中，按绘制
标准曲线显色的方法进行比色测定。
为了消除土壤中原来含有的氨基氮引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。
无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
3、结果计算蛋白酶活性，以24小时后1g土壤中氨基氮的毫克数表示。
NH2-N(mg)=a×5
式中 a——从标准曲线查的氨基氮毫克数
5——换算成1g土的系数
五、过氧化氢酶的测定
容量法（高锰酸钾滴定法）
1、试剂配制
①0.3%过氧化氢溶液。
②3N硫酸。(N叫做当量浓度，通常用来表示酸碱溶液中的有效浓度，就拿硫酸来讲，1N就是指H+的浓度为1mol/L即硫酸浓度为0.5mol/L，这样酸碱之间的换算就不需要考虑其为几元酸了. N是当量单位，是老单位，一般来1N=1mol/L，但是对酸而言1N=1 mol/l 1、对于一元酸来说，1N=1 mol/L，如1N
HCl=1mol/L HCl，2、对于n元酸来说，1N=1/n mol/L，如1N H2SO4=1/2 mol/L H2SO4 1N H3PO4=1/3 mol/L H3PO4)
③0.1N高锰酸钾溶液。高锰酸钾克分子量的五分之一再乘0.1的重量溶于水，稀释至1升，摇匀，标定.【贮藏】置玻璃塞的棕色玻瓶中，密闭保存
2、操作步骤取2g风干土，置于100ml三角瓶中，并注入40ml蒸馏水和5ml0.3%过氧化氢溶液。将三角瓶放在往复式震荡机上，震荡20min。而后加入5ml 3N
硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中的悬液用慢速型滤纸过滤，然后吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾溶液滴定至淡粉红色终点。
3、结果计算用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25ml原始过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。（A-B）×T 即为过氧化氢酶活性。以20min后1g土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。式中T 为高锰酸钾滴定度的校正值。高锰酸钾的相对分子量是158，但作为氧化剂，它常被还原成二价锰离子(原来是+7价)，这样它的基本单元为1/5，这样，0.1n的质量就是0.1*(1/5)158=3.3g
六、磷酸酶
磷酸苯二钠比色法
1、试剂配制
①0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。
②pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液。
③氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g2.6-二溴对苯醌亚胺，用10ml96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色的溶液未变褐色之前均可以使用。
④酚的标准溶液：
酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。
酚工作液——取10ml酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。
⑤甲苯。
⑥0.3%硫酸铝溶液。
标准曲线绘制：取1,3,5,7,9,11,13酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制曲线。
2、操作步骤取5g风干土，置于200ml三角瓶中，加2.5ml甲苯，轻摇15min 后，加入200ml0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液、中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液、碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h。后于培养中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。
吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述的方法显色。用硼酸盐缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm处比色。
3、结果计算磷酸酶活性，以24小时后1g土壤中释放出的酚的毫克数表示。
酚（mg）=a×8
式中 a——从标准曲线查的酚毫克数 8——换算成1g土的系数
土壤纤维素酶测定方法
纤维素酶 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性（μg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量（μg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；
脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)
实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法） 一、实验原理 脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。反应式： (NH 2)2CO+ H 2 O 脲酶 2NH 3 + CO 2 氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。反应式： NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤 将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作： 取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1 H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。 三、结果计算 脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂 1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。 2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷
酸盐缓冲液适当稀释。 3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。 4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.2 5 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。 5 、1 mol·L -1 H 2SO 4 溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容 量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。 6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。此溶液含NH3为40μmol·mL-1。 7 、纳氏试剂：分别溶解3 . 5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。向此液中加70 mL30% KOH ，不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。混匀，静置过夜，倾出清液贮于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。 在有碘化汞情况下，可溶10 g HgI2和7 g KI于少量蒸馏水中，另溶16 gNaOH 于50mL 水中，待冷却后，将前者慢慢倒入其中，边加边搅拌，最后用水定容至100 mL 。过夜澄清后，倾出上清液存于棕色试剂瓶中。（配置方法之二）
土壤酶活性测定方法
土壤酸性磷酸酶活性的测定 1．试剂配制 (1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液 取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至 2 250ml.4摄氏度冰箱保存。 (2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀） 原液由以下成分组成: 三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g 溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯 (4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液： 36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤 置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。 培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色. 3．计算方法 土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示， W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t） 式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）； t —反应时间（h）；=1h m—样品土壤的重量（g） 无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。每个处理做1个。 标准曲线的制作： 1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。 2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O 溶液1ml，NaOH溶液4ml， ②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。 ③以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量n（mg）=a+b×A410.
脲酶活性的测定
大豆制品中脲酶活性的测定 定性法： 酚红法 一、原理： 酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。 二、仪器和试剂： 粉碎机：粉碎时不产生强烈发热； 分析天平； 25ml纳式比色管； 恒温水浴锅； 0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液； 结晶尿素； 三、方法： 将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。 空白试验：不加尿素，其他同上。 品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
?0-1min变红，活性非常强（＞1.0）； ?1-2min变红，活性大概0.5-1.0； ?2-5min变红，活性大概0.3-0.5。 四、注意事项： 1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定； 2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差； 3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法 一、原理： 酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。 二、仪器和试剂： 表面皿； 0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水； 1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水； 尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色） 三、方法： 将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。如果红斑面积多于20%，则认为该样品脲酶活性超标，为不合格产品。 四、注意事项： 1.对于样品较粗、具有大块状的样品，最好将其稍微粉碎，亦不
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h 内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品 实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯
实验五 固定化脲酶活力的测定
实验五固定化脲酶活力的测定 一、实验原理 固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。故可测定脲酶活力的大小。 二、仪器和试剂 1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器 2、实验四制备的固定化脲酶 3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏 水并定容至100 ml 4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml 5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶 解并定容至100 ml。此溶液含NH3为40 μM 6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中， 冷却后加水定容至1000 ml 7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。另 称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐 注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮 于棕色瓶中，密塞保存。 三、实验步骤 1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。取0.3-0.5 g，切碎。 2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100 mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水 浴中保温5 min。
土壤漆酶活性检测试剂盒说明书 微量法
土壤漆酶活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC1965 规格：100T/48S 产品内容： 试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×2瓶，4℃避光保存，临用前每瓶加7.5mL试剂一溶解。 试剂三：液体3mL×1瓶，常温保存。若有白色物质析出，放于37℃中溶解即可。 产品说明： 土壤漆酶（SL）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，广泛分布于真菌和高等植物中，具有较强的氧化还原能力，在纸浆生物漂白，环境污染物降解和木质纤维素降解以及生物检测方面有非常广泛的应用。 漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基，在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS，测定ABTS自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、震荡仪、30目筛（或更小）。操作步骤： 一、样本处理 新鲜土样风干，过30目筛。 二、测定操作 1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到420nm，蒸馏水调零。 2.加样表： 试剂名称测定管对照管 土样（g）0.030.03
试剂一（μL）135135 试剂二（μL）150- 37℃水浴反应10min。 试剂三（μL）1515 试剂二（μL）-150 4℃12000g离心15min，取200μL上清于420nm测定其吸光值，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。 三、土壤漆酶（SL）活性计算公式 （1）按微量比色皿计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol ABTS自由基所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 SL活性（U/g）=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T=0.833×△A÷W。 ε：ABTS自由基摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，3×10-4L；W，样本质量，g；T：反应时间，10min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 （2）按96孔板计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol ABTS自由基所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 SL活性（U/g）=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T= 1.39×△A÷W。 ε：ABTS自由基摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，0.6cm；V反总：反应总体积，3 ×10-4L；W，样本质量，g；T：反应时间，10min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 注意事项： 1.试剂一需临用前配制，并且尽快使用，4℃保存一周，若变色则不能使用。 2.测定之前进行预实验，若吸光值较高（A＞1.5），请减少土样质量再进行测定。若数值偏小可以延长反 应时间或增加土样质量进行测定。 3.离心后若上清仍然浑浊，可再次离心去除。
脲酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1、试剂配制： （1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7， 并用水稀释至2L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢 氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B 两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。 （4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。 （5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。 2、操作步骤 称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ; 往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立 即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态 氮量。
两种脲酶活性定性测定方法及比较
两种脲酶活性定性测定方法及比较 随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。脲酶活性没有负值，最低为0。在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。国内很多大企业一般均采用0.2。 实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。 一.液态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。 2.试剂 2.1尿素:GB696，分析纯。 2.2酚红指示剂 2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解； 2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 3.操作方法 3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。 3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。 3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。 颜色出现时间脲酶活性 1min 极强 1～5min 强 5～15min 稍有 15min 无
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。
土壤脲酶的测定方法
土壤脲酶的测定方法 脲酶试验原理：存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。 试剂： 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至
1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液 标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500μg/g，另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d（前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。 1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中 2)向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟 3)之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合 4)将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h 5)培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法 一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法 1. 试剂配制 （1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。 （2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超 过7天）。 （3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。 （4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。 （5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。 （7）甲苯。 （8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄 糖母液（10mg还原糖/ml）。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准 葡萄糖液（1mg/ml）； 2. 操作步骤 （1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取1.0mL上清液（新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL）于50mL比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。 为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。 3．结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖（mg）=(a-b)×c 式中 a---从标准曲线查得的样品（加了基质）对应的葡萄糖浓度，mg/mL； b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度，mg/mL； c---换算成1g土的系数。 二、脲酶: 靛酚比色法 1. 试剂配制 （1）pH6.7柠檬酸盐缓冲液1L：取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中，另取147.5g KOH溶于水，再将两种溶液合并，用1N NaOH将pH调至6.7，并用水稀至1L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，然后用乙醇稀释至100mL(A液)，保存在冰箱中。称取27g NaOH溶于100mL 水中（B液），保存在冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混合，并用蒸馏 水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液100mL：取10%的次氯酸钠溶液9mL，用水稀释定容于100mL 容量瓶中，即活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 （4）10%尿素溶液500mL：取50g尿素，用水稀释至500mL。 （5）甲苯。
脲酶活性
随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。脲酶活性没有负值，最低为0。在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。国内很多大企业一般均采用0.2。 实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。 一.液态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。 2.试剂 2.1尿素:GB696，分析纯。 2.2酚红指示剂 2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解； 2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 3.操作方法 3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。 3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。 3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于 15min。 颜色出现时间脲酶活性 1min 极强
土壤酶活性测定方法
土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法 （一）方法原理 本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。 （二）试剂 1）1%精胶 2）甲苯 3）铜-磷酸盐溶液：① 27.3g CuCl2·H2O溶于1 L水；②64.5g Na2HPO4·12H2O 溶于500mL 水，加入7.2g NaOH，稀释至1L；③57.21g Na2B4O7溶于1.5L 水，加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L，使用按照1：2：2的体积分数前将上述①、②、③混合。 4）甘氨酸标准溶液的配制：取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至1 L （1mL含50μg NH3-N）。 （三）操作步骤 （1）标准曲线绘制 取0、5、10、15、20 mL 甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL，然后加入20 mL 新配制的铜-磷酸盐溶液。显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线。 （2）土壤蛋白酶活性测定 称取5g土壤置于100mL 三角瓶中，加入甲苯2mL ，放置15 min，加入20mL 1%精胶溶液，于37℃恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照。 培养结束后，将悬液过滤，取10mL 滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL。显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量。 以每克土壤在37℃下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（μg）表示蛋白酶活性。
土壤蔗糖酶测定方法：3,5- 二硝基水杨酸比色法 分析意义：对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。 （一）方法原理 蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 （二）试剂 1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯 2）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（保存期不过7天） （三）测定步骤 （1）标准曲线绘制 分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2）土壤蔗糖酶测定 称取5 g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5mlpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3mlDNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。 溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。 为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 （3）结果计算
生化实验六脲酶测定参考
实验六脲酶测定 一、实验原理 有些生物化学反应中指示反应完成，经常使用直观的指示剂指示，如氧化还原指示剂和酸碱指示剂。氧化还原指示剂是氧化状态下和还原状态下各有不同颜色；酸碱指示剂是指示生物化学反应前后溶液的酸碱度变化，不同酸碱度各有不同颜色。 这里进行一次酶促反应试验，人的血液中和尿液中都含有尿素，尿素的含量变化是许多病变的重要指标。尿酶可作用于尿素，它的反应如下： (NH2)2C=O + H2O 尿酶2NH3 +CO2 尿酶可以定量测定尿素含量，尿酶通常可从大豆粉中提取，本试验用大豆粉和玉米粉提取尿酶，通过上述反应观察两种植物种子中尿酶的含量。在与底物尿素的作用反应中，分别加入三种指示剂A、B、C，但在制备指示剂的过程中忘记了瓶号，只知道三种是中性红、百里香酚兰和亚甲兰，其中有酸碱指示剂和氧化还原指示剂。 二、实验目的 1、确定两种植物种子中谁含大量的脲酶； 2、分出谁是氧化还原指示剂，谁是酸碱指示剂。 三、实验器材及试剂 1、仪器设备 电子天平，4只100ml三角瓶，14支试管，试管架，2个三角漏斗，50ml量筒，玻璃棒，移液器及吸头，脱脂棉 2、试剂 30%乙醇溶液，2%尿素溶液，指示剂A,B,C(中性红，亚甲蓝，百里香酚蓝） 3、材料 大豆粉，玉米粉 四、实验准备 仪器设备：电子天平（每五组一个，共5个/班），4只100ml三角瓶（共需要100个/班），14支试管（共需要350支/班），试管架（25个/班），2个三角漏斗（共需要50个/班），50ml量筒（25个/班），玻璃棒（25根/班），移液器及吸头（蓝，黄吸头各一盒，每种各25盒/班），脱脂棉（若干每组，尽量多一些） 试剂：30%乙醇溶液（80ml/组，共2L/班），2%尿素溶液（12ml/组，共300ml/班），指示剂A,B,C(中性红，亚甲蓝，百里香酚蓝）（各需2滴或3滴，适合即可）
土壤五种酶的测定方法
参考文献： 1、关松荫等，编著. 土壤酶及其研究法[M].农业出版社，1986. 2、周礼凯，编著. 土壤酶学[M].科学出版社 关松荫等，1986 蔗糖酶：比色法(1) P274-276 脲酶：比色法P294-297 蛋白酶：比色法9(1) P302-304 磷酸酶：磷酸苯二钠法(2) P312-313 过氧化氢酶：容量法P323 蔗糖酶 比色法 1、试剂 (1) 苯甲酸溶液0.25% (2) 3,5-二硝基水杨酸 (3) pH5.5磷酸缓冲液 (4) 8%蔗糖溶液 (5) 甲苯 2、操作步骤 5克风干土→50mL三角瓶→15mL 8%蔗糖溶液→5mL pH5.5磷酸缓冲液→5滴甲苯 →摇匀放入恒温箱→37℃培养24h →取出迅速过滤→吸取滤液1mL →流水冷却3min →蒸馏水稀释至50mL →508nm比色 3、结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡糖糖（毫克）= a×4 式中a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数 4——换算成1g土的系数 标准曲线：以光密度为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标。 Y=0.229×（－0.0209）R２=0.9961
注意： Y值为吸光度值，相当于表中的A平均 X值为根据上述公式计算的结果，相当于a值 葡萄糖含量为a* 4 （毫克） 蛋白酶 比色法（1） 1.试剂 （1）1%酪素溶液 （2）0.1N硫酸 （3）20%硫酸钠 （4）2%茚三酮液 （5）甲苯 （6）甘氨酸标准溶液 2.操作步骤 4g风干土→50ml三角瓶→20ml1%酪素液→1ml甲苯→30℃恒温箱24h → 2ml0.1N硫酸→12ml20%硫酸钠液→15min(6000转/min)离心→上清液2ml 50ml容量瓶→1ml茚三酮→沸水浴10min→蒸馏水稀释至刻度→500nm比色 3.结果计算 蛋白酶活性，以24h后1g土壤中氨基氮的毫克数表示。 NH2-N(mg)=a*5 式中 a——从标准曲线查得氨基氮毫克数 b——换算成1g土的系数 标准曲线：以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标。 Y=2.8236x+0.011R2=0.9968 X=（y - 0.011）/2.8236 过氧化氢酶
脲酶Km值测定
实验十脲酶Km值测定 一、目的 脲酶是氮素循环的一种关键性酶，它催化尿素与水作用生成碳酸铵，在促进土壤和植物体内尿素的利用上起有重要作用。对其进行多方面研究，早已引起人们重视。通过本实验，学习脲酶Km值的测定方法。 二、原理 脲酶催化下列反应： 在碱性条件下，碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵量成正比。故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产生的碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。 在保持恒定的最适条件下，用相同浓度的脲酶催化不同浓度的尿素发生水合反应。在一定限度内，酶促反应速度与脲浓度成正比。用双倒数作图法可求得脲酶的Km值。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）试管16 ×160mm 21支 （2）吸管0.5ml×15，lml×1，Zml×1，10ml×1 （3）漏斗5个 （4）721型分光光度计 （5）电热恒温水浴 （6）离心机 （7）康氏振荡机 2．试剂 （1）1／10 mol／L脲15.015g，水溶后定容至250ml。 （2）不同浓度脲液用1／10 mol／L 脲稀释成1／20、1／30、1／ 40、l／50 mol／L的脲液。 （3）1 ／15 mo／L pH7．0磷酸盐缓冲液Na2HPO4 5.969g，水溶后定容至250ml。NaH2PO4 2.268g，水溶后定容至250ml。取Na2HPO4溶液60ml，NaH2PO4溶液40ml混匀，即为1／15 mol／L pH7.0磷酸盐缓冲液。 （4）10％硫酸锌20g ZnSO4溶于200ml蒸馏水中。 （5）0.5 mol／L氢氧化钠5g NaOH，水溶后定容至250ml。 （6）10％酒石酸钾钠20g酒石酸钾钠溶于200ml蒸馏水中。
土壤酶的测定方法
参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法 一、土壤蔗糖酶 3，5- 二硝基水杨酸比色法： 1、试剂的配制 ①3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶 于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天） ②pH5.5磷酸缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠 （11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。 ③8%蔗糖溶液。 ④甲苯。 ⑤标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58℃条件下，真 空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5ml还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。 标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 2、操作步骤称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入 15ml8%蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混
合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。 从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。 溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。 无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。 3、结果计算蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫 克数表示。 葡萄糖（毫克）=a×4 式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数 4——换算成1g土的系数 二、土壤淀粉酶 3，5- 二硝基水杨酸比色法: 1、试剂配制 ①1%淀粉。 ②甲苯。