过量DMSO显著降低低模板浓度PCR扩增的特异性
过量DMSO 显著降低低模板浓度PCR 扩增的特异性
肖志壮,曲音波,汪天虹,高培基,刘梦海
(山东大学微生物技术国家重点实验室,济南250100)
摘 要:DMSO 通常经验性地用于提高PCR 扩增的效率,但是过量的DMSO 可以显著降低特异序列的扩增效率,尤其是导致非特异性扩增的现象却被忽视。在6%的DMSO 存在时,开始出现非特异条带,同时特异扩增产物减少。本文首次报道DMSO 对PCR 产物特异性的影响并确定了克服上述现象产生的途径,即通过增加模板-引物的比例消除非特异条带。而通常提高复性温度只能部分减少非特异产物,不能避免非特异扩增。本文结果有助于提高常规PCR ,尤其是分子遗传学分析中经常使用的随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA ,
RAPD )检测的准确度。
关键词:DMSO ;PCR ;特异性和效率
中图分类号:Q75 文献标识码:A
文章编号:0253-9772(2001)04-0341-03
Excessive DMSO Dram atically R educing the Specif icity of
PCR Amplif ication at Low Concentrations of T emplate
XIAO Zhi 2zhuang ,QU Y in 2bo ,WAN G Tian 2hong ,G AO Pei 2ji ,L IU Meng 2hai
(S tate Key L aboratory of Microbial Technology ,S handong U niversity ,Ji nan 250100,Chi na )
Abstract :DMSO is the most often empirically used to increase efficiency of PCR.However ,it is ignored that DMSO can al 2so decrease the amplification of specific sequences and result in non -s pecific amplifications.Non -specific bands are de 2tected at 6%DMSO ,as specific amplification declines.This is the first report about the effects of DMSO on the specificity of PCR and establishment of the method for avoiding non -specific products ,which can be overcome by increasing tem 2plate -primer ratio rather than annealing temperature.Our data will be of much help for random amplified polymorphic DNA (RAPD )assays for molecular genetic analyses.K ey w ords :DMSO ;PCR ;specificity and efficiency
众所周知,一些因素例如DMSO 、模板和引物的浓度都可明显影响PCR 扩增[1～3],DMSO 被经验性地用于提高PCR 扩增的效率[4,5]。但是,DMSO 能显著降低PCR 扩增的特异性却被人忽视。Arnold [6]等曾用含10%DMSO 的PCR 反应体系产生千分之一的碱基错误进行蛋白质的定向改造,也称蛋白质定向进化。当我们试图使用这种方法对含有瑞氏木霉(T richoderm a reesei )内切葡聚糖酶III
(endoglucanase III ,EG III )基因全长1185kb 的DNA 片段引入随机突变时,发现在10%DMSO 存
在时1.85kb 的PCR 特异产物或者消失,或者急剧减少,同时出现非特异条带。为了研究DMSO 对PCR 的影响,优化PCR 扩增的效率和特异性,我们
进行了一系列20μl 反应体系的PCR ,观察DMSO 在不同模板和引物比例时对PCR 产物特异性的作
用。本文首次报道了DMSO 对PCR 产物特异性的
收稿日期:2000-07-17;修回日期:2000-11-24基金项目:国家自然科学基金(39970392)资助
Acknow ledgment This work was supported by the National Nature Science Foundation of China (39970392).
作者简介:肖志壮(1967-),男(汉),山东荣成人,现山东大学生命学院在读博士生,专业方向:微生物与分子生物学。电话:0531-*******,
E -mail :zzxiao @https://www.wendangku.net/doc/913254490.html,
遗 传HEREDITAS (Beijing )23(4):341～343,2001 研究报告
影响及消除非特异性产物的方法。
1 材料和方法
1.1 材料
Taq DNA聚合酶、DMSO、矿物油(上海生工),模板质粒pAJ401-eg3(本室保存)。
引物1:5′-G AA GTTCGG AA TTCGGCA-3′,
引物2:5′-TGTGG AA TTGTG A GCGG A-3′。1.2 方法
20μl PCR反应体系含有:2mmol/L MgCl2、8 mmol/L(N H4)2SO4、10mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl,p H9.0,0.05%NP240、200μmol/L dN TP,另加一定浓度的引物、模板和DMSO。这些条件的变化在各图中注明。反应混合液置于95℃加热5min,然后加入0.5单位Taq DNA聚合酶,于PCR合成仪Cetus Thermal Cycler480中进行35个循环,循环条件为:94℃1min,52℃1min,72℃2min。反应结束后,各取5μl PCR样品用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。用凝胶成像仪及分子分析软件(美国Bio-Rad公司)照相并分析特异产物的含量。
2 结果与讨论
2.1 引物-模板摩尔比对PCR扩增的影响
在无DMSO存在时,固定模板质粒pA J401-eg3的浓度1.6×10-14mol/L,引物浓度的降低,显著减少特异产物(1.85kb)的产量,引物浓度低于715×10-8 mol/L时检测不出PCR产物。当分别固定引物浓度为7.5×10-7mol/L和7.5×10-8mol/L时,模板浓度的改变导致特异条带亮度明显变化(图1A和B)。凝胶扫描分析可以看出,图1A和B中的模板浓度分别为1.6×10-11mol/L和1.6×10-12mol/L的第2泳道和第3泳道特异条带产量最高。图1显示引物-模板的摩尔比为104时,PCR扩增效率最高,模板浓度低于1.6×10-16mol/L时,检测不到PCR产物。实验数据表明,用于PCR检测的最低极限模板和引物浓度分别为:1.6×10-16mol/L、7.5×10-8mol/L
。
图1 引物-模板比例对PCR扩增的影响
Fig.1 The effect of the primer-to-template ratio on the PCR amplif ication in the absence of DMSO
The primer concentrations were7.5×10-7mol/L and7.5×10-8mol/L in reaction mixtures A and B,respectively,both
containing2mmol/L MgCl2,8mmol/L(NH4)2SO4,10mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,p H9.0,0.05%
NP-40,200μmol/L dN https://www.wendangku.net/doc/913254490.html,ne M:Lambda DNA digested by Hi n https://www.wendangku.net/doc/913254490.html,ne1～7:in the presence of1.6×10-10
mol/L,1.6×10-11mol/L,1.6×10-12mol/L,1.6×10-13mol/L,1.6×10-14mol/L,1.6×10-15mol/L,1.6×10-16
mol/L template pAJ401-eg3,respectively.
2.2 DMSO对PCR扩增的特异性和效率的影响
当DMSO浓度低于2%时,1.85kb特异产物的
亮度与不含DMSO的几乎处于同一水平(图2)。随
着DMSO浓度的提高,特异产物明显减少,DMSO
增加到6%时开始出现两条非特异带。当DMSO浓
度进一步提高到10%时,特异产物几乎消失,而非
特异产物占绝对优势。我们经常通过提高复性温度
消除非特异扩增,但是,由过量DMSO导致的非特
异条带通过提高复性温度只能部分减少而不能消除
(结果未显示)。然而,我们发现,这种由高浓度
DMSO引起的PCR扩增效率及特异性的降低可通
过提高模板浓度来克服。在10%DMSO的反应体
系中,引物浓度为7.5×10-7mol/L时,模板浓度提
高到1.6×10-10mol/L即可完全避免非特异扩增243 遗 传HEREDITAS(Beijing)2001 23卷
(图3)。值得注意的是,10%DMSO存在时,如果引物浓度降低至7.5×10-8mol/L,则看不到特异产物,也就是说,反应体系含DMSO时,需增加引物浓度,保证PCR特异扩增。当DMSO低于10%时,结果与图3相似,提高复性温度也不能消除非特异扩增。实验结果提示我们,只有提高模板-引物的摩尔比才能避免由过量DMSO引起的非特异扩增
。
图2 DMSO对PCR扩增特异性的影响
Fig.2 The effect of excessive DMSO on the
specif icity of PCR amplif ication
Reaction mixtures containing2mmol/L MgCl2,8mmol/L(NH4)2SO4,
10mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,p H9.0,0.05%NP-40,200
μmol/L dN TP,were added with1.6×10-11mol/L pAJ401-eg3,7.5
×10-7mol/L primers and appropriate https://www.wendangku.net/doc/913254490.html,ne M:Lambda DNA
digested by Hi n https://www.wendangku.net/doc/913254490.html,ne1:absence of https://www.wendangku.net/doc/913254490.html,ne2～8:presence of
1,2,4,5,6,8and10%DMSO
,respectively.
图3 引物-模板比对由DMSO造成的
非特异性PCR扩增的影响
Fig.3 E liminating the decrease in the specif icity
of the PCR amplif ication resulted from10%DMSO
by increasing template concentration.
Reaction mixtures containing2mmol/L MgCl2,8mmol/L(NH4)2SO4,
10mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,p H9.0,0.05%NP-40,200
μmol/L dN TP,10%DMSO,7.5×10-7mol/L primers were added
with appropriate template https://www.wendangku.net/doc/913254490.html,ne M:Lambda DNA digested by
Hi n https://www.wendangku.net/doc/913254490.html,ne1～6:in the presence of1.6×10-10mol/L,1.6×10-11
mol/L,1.6×10-12mol/L,1.6×10-13mol/L,1.6×10-14mol/L,1.6
×10-15mol/L pAJ401-eg3,respectively.
由于过量DMSO抑制Taq DNA聚合酶催化的
DNA合成,因此,高于2%DMSO使PCR扩增的效率
显著下降,这与文献报道[1]相符。显然,DMSO不仅
降低引物-模板摩尔比,而且,更重要的是大大降低
PCR扩增的特异性和效率。我们推测,DMSO能促进
DNA之间复性。其结果是,一方面少量DMSO有利
于提高PCR的效率;另一方面,可造成引物与模板的
非特异位点的杂交,从而降低了PCR扩增的特异性。
DMSO使极少量的引物与模板非特异结合,竞争性抑
制了PCR所需的特异杂交,阻止了PCR特异扩增。
这也可以说明DMSO提高了PCR检测所需引物的极
限浓度。DMSO广泛地用于PCR检测,对其使用浓
度进行优化才能保证PCR的特异性及效率。
总之,本文结果说明,DMSO用于PCR时一定要
注意平衡模板、引物及DMSO的浓度,确保PCR检测
的可靠性。我们的数据有利于提高常规PCR,尤其是
分子遗传学分析中常用的随机扩增多态性DNA检测
(random amplified polymorphic DNA,RAPD)的准确
性。
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