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利用间隔肽促进S_腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达_秦秀林

·研究报告·

生物技术通报

BIOTECHNOLOGY BULLETIN

2013年第6期

S -腺苷甲硫氨酸（S -adenosylmethionine，SAM）是所有生物体中都存在的一种重要分子［1］，由SAM

收稿日期：2013-03-11基金项目：广西大学科研基金资助项目（XBZ120010）作者简介：秦秀林，女，博士，讲师，研究方向：生物化学与分子生物学；E -mail ：xiulinqin@https://www.wendangku.net/doc/9e3635907.html, 通讯作者：钱江潮，女，博士，教授，研究方向：生物化学与分子生物学；E -mail ：jiangchaoqian@https://www.wendangku.net/doc/9e3635907.html,

利用间隔肽促进S-腺苷甲硫氨酸合成酶

在毕赤酵母中的分泌表达

秦秀林1?钱江潮2?储炬2

（1.广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004；2.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

摘要： S -腺苷甲硫氨酸（SAM）是所有生物体中都存在的一种重要分子，对维持生物体功能具有重要的作用，已经被广泛地用于治疗肝脏疾病、关节炎和忧郁症等多种疾病。利用巴斯德毕赤酵母KM71构建基因工程菌K/9KM，在AOX1启动子调控下分泌表达达观链霉菌（Streptomyces spectabilis ）来源SAM 合成酶（MAT）。为促进MAT 的分泌，在信号肽Kex2p 切割位点后引入间隔肽G -Spacer（NTTEEGEPK），构建重组菌K/GM，其重组蛋白（GM）表达量达到84.7 mg/L，分泌效率提高了92%，MAT 比酶活提高了58%。在重组蛋白GM 的C 端融合表达His -tag，构建重组蛋白GMH 表达重组菌K/GMH，GMH 的MAT 比酶活比GM 下降13%，但分泌效率无显著改变。因此，间隔肽G -Spacer 对MAT 的酶活及分泌有显著的促进作用，而His -tag 会降低MAT 的酶活力但不影响其分泌效率。所构建的MAT 分泌表达基因工程菌K/GMH，在目的蛋白C 端融合表达His -tag 可减少分离纯化步骤和产物损失，易于酶促转化法生产SAM。

关键词： S -腺苷甲硫氨酸合成酶　分泌表达　毕赤酵母　间隔肽　异源表达

The Influence of Spacer Peptide and C -Terminal His -tag on

Activity and Secretion of MAT from Pichia pastoris

Qin Xiulin 1 Qian Jiangchao 2 Chu Ju 2

（1. College of Life Science and Technology ，Guangxi University ，Nanning 530004；2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering ，East

China University of Science & Technology ，Shanghai 200237）

Abstract:?S -adenosylmethionine synthetase（MAT）catalyzes the synthesis of S -adenosylmethionine（SAM）from L -methionine and ATP in all living organisms. SAM is an important biochemical molecule participating in a variety of biochemical reactions, and has attracted much interest in clinical research because of its potential to cure many diseases , such as depression, liver disease, and osteoarthritis. Accordingly, to develop a simple and effective way to enzymatically synthesize and produce SAM, the MAT gene（sam 2）from Streptomyces spectabilis was expressed successfully under the control of the AOX1 promoter in the recombinant yeast Pichia pastoris KM71. Introduction of a spacer peptide（G -Spacer ：NTTEEGEPK）after the α-factor, creating a G -spacer of the N -terminal extension of the MAT（GM）, greatly increased the MAT spectivity activity of GM to 158% and concomitantly improved the secretion level of the GM by 92%. In contrast, the MAT activity of the recombinant GM with C -terminal His -tag（GMH）was decreased by 13% as compared to that with the GM. Conclusively, the G -Spacer seem to be of crucial importance in determining the secretion efficiency and activity of MAT in P. pastoris . The C -terminal region of the MAT might also be important to the active protein structure.

Key?words:?S -adenosylmethionine synthetase　Secretory expression　Pichia pastor is　Spacer peptide　Heterologous expression

合成酶（EC2.5.1.6，SAM synthetase，MAT）催化L -甲硫氨酸（L -methionine，L -Met）和ATP 反应合成。

网络出版时间：2013-06-27 16:05

网络出版地址：https://www.wendangku.net/doc/9e3635907.html,/kcms/detail/11.2396.Q.20130627.1605.023.html

2013年第6期141秦秀林等：利用间隔肽促进S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达

SAM参与3个重要生化途径，即转甲基作用［2］、转硫作用［3］和多胺合成作用［4］。鉴于SAM对维持生物体功具有重要的作用，已经被用于有效治疗肝脏疾病［5］、关节炎［6，7］和忧郁症［8］等多种疾病，也被开发为保健品。SAM的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法3种。化学合成SAM所用反应底物价格昂贵、环境污染严重［9］，且存在少量非对映体难以分离的缺点。而利用微生物发酵生产SAM存在着终产物积累量低，分离提纯步骤较复杂等缺点。较前面两种方法，酶促转化法具有终产物积累量高、分离提纯容易及反应周期短等优点，是较为有效的工业化生产方法。将SAM合成酶（MAT）进行固定化，不仅可以提高产量，还能降低成本减少工艺环节。His-tag标记的酶，可利用固定化金属离子亲合层析（Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）便于酶的纯化和固定［10］，为酶促转化法大规模生产SAM奠定基础。

目前，MAT的表达主要采用大肠杆菌和毕赤酵母表达系统，但前者表达的重组酶MAT蛋白量和酶活力均较低［11，12］，且大部分重组酶以包涵体形式存在［13］；而毕赤酵母只有少数内源蛋白分泌到胞外［14］，可获得较高的MAT表达量和利于表达产物的分离纯化，是较理想的MAT表达系统［15，16］。为了促进毕赤酵母目的蛋白的分泌表达，Kjeldsen等［17］在α-factor信号肽的Kex2p位点和目的蛋白间引入一段间隔肽（含3个Glu-Ala二肽和赖氨酸Lys的短肽EAEAEAK），显著提高了发酵上清中胰岛素前体的量。王晖等［18］在信号序列和目的蛋白N端间插入间隔短肽，提高了exendin-4类似物串联体EXA 在重组毕赤酵母中的分泌表达水平，与不含间隔肽序列的EXA表达对照菌相比，插入含有糖基化位点（NTTEEGEPK）和富含带电荷极性氨基酸（DDDDK）的间隔肽后，蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍。同样，在人工合成的前引导肽（pro-leader）和目的蛋白间增加一段间隔肽，重组酿酒酵母和毕赤酵母的目的蛋白（胰岛素前体）产量分别提高了2.6倍和2.1倍［19］，同时胞内残余的胰岛素前体浓度明显降低，说明在目的蛋白Ｎ端增加间隔肽能促进目的蛋白的分泌。

为了获得高效分泌表达MAT的重组菌，本研究首先利用巴基德毕赤酵母KM71构建分泌表达重组MAT（M）的基因工程菌K/9KM。其次，为促进MAT的分泌，在信号肽Kex2p切割位点后引入间隔肽G-Spacer（NTTEEGEPK），构建重组菌K/GM。然后，在重组蛋白GM的C端融合表达His-tag（即构建重组蛋白GMH表达重组菌K/GMH）以便MAT的分离纯化，并研究了间隔肽G-Spacer和His-tag对MAT重组酶分泌效率和酶活的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种质粒大肠杆菌DH5α购自TaKaRa宝生物工程有限公司。巴斯德毕赤酵母KM71、GS115和表达载体pPIC9K、pPICZ A购自Invitrogen公司。1.1.2 酶与试剂 Eco R I、Not I、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和去糖基化酶Endo H购自TaKaRa 宝生物工程有限公司；DNA胶回收试剂盒购上海生物工程公司。PCR引物均委托上海生物工程公司合成。SAM标准品购自Sigma公司。细胞裂解缓冲液：50 mmol/L pH7.4的磷酸钾缓冲液，5%甘油（V/V），5 mmol/L的巯基乙醇和1 mmol/L 的EDTA（加入1 mmol/L的苯甲咪和1 mmol/L的PMSF作为蛋白酶抑制剂）。

1.1.3　主要培养基大肠杆菌培养使用LB或LLB 培养基，毕赤酵母培养使用YPG培养基，筛选毕赤酵母重组菌用MD固体培养基，培养毕赤酵母重组菌用BMGY培养基，诱导毕赤酵母重组菌产酶用BMMY培养基，以上培养基均参照 Invitrogen 公司的毕赤酵母操作手册进行。

1.2　方法

1.2.1　MAT表达载体的构建　使用限制性内切酶Eco R I和Not I双酶切质粒pPIC3.5K/ST［20］以获得达观链霉菌（Streptomyces spectabilis）S-腺苷甲硫氨酸合成酶（MAT）基因sam2片段，该片段与经相同酶切后质粒pPIC9K连接，获得质粒p9KM。以质粒pPIC9K为模板，采用引物α-MF F分别和引物α-MF R、α-MF A1、α-MF A2（表1）进行3轮PCR 扩增，在α-MF的C端（即MAT的N端）引入肽链NTTEEGEPK（将其命名为间隔肽G-Spacer）［17］，将PCR扩增改造后的α-MF经Bam HⅠ和Eco RⅠ

生物技术通报Biotechnology Bulletin2013年第6期142

双酶切并与质粒pPIC9K连接，构建载体pG9K，并由上海生物工程公司测序鉴定。将Eco RⅠ和NotⅠ双酶切的sam基因片段插入质粒pG9K获得重组质粒pGM。以质粒pGM为模板，用引物SsM F和SsM RH（表1）扩增C端带有His-tag的sam基因片段，将PCR产物经Eco RⅠ和NotⅠ双酶切，替换载体pGM中的sam基因，测序鉴定，获得sam基因表达框序列正确的载体pGMH。

表1 引物及其序列

引物名称碱基序列（5'-3'）酶切位点

α-MF F GCGGATCCAAACGATGAGA Bam H I

α-MF R CTCAGTAGTGTTTACGTAAGCTTCAGC

α-MF A1GCTCACCCTCCTCAGTAGTGTTTA

α-MF A2GAATTCCTTTGGCTCACCCTCCTCA Eco R I

SsM F CCGGAATTCGTGTCCCGCCGTCTCTTC Eco R I

SsM RH AATGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTG-

GTGGTGGTGAACAAGCGGCAGGAG

Not I

5’AOX GACTGGTTCCAATTGACAAGC

3’AOX GCAAATGGCATTCTGACATCC

1.2.2 重组毕赤酵母构建及重组MAT的诱导表达

将重组质粒p9KM、pGM和pGMH用限制性酶Bpu1102 I酶切线性化后，分别电转毕赤酵母KM71、GS115，涂布MD平板，30℃倒置培养3-5 d，直到转化子长出。利用5’AOX/3’AOX引物菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆分别命名为K/9K、K/9KM、K/GM 和K/GMH；G/9K、G/9KM、G/GM和G/GMH。挑取经菌落PCR鉴定的阳性转化子于3 mL YPD培养基中，30℃过夜培养后，取1 mL菌液保存甘油菌，余下接种于25 mL BMGY培养基中，30℃培养至 OD600 ≈15，4 000 r/min离心5 min，收集的菌体重悬于25 mL诱导培养基BMMY中，30℃诱导表达96 h （KM71和GS115系列重组菌每隔12 h补加甲醇分别至终浓度0.5%和1%）。然后4℃，12 000 r/min离心10 min，分别收集培养基上清及菌体分别用于重组酶胞外和胞内MAT酶活测定。

1.2.3 玻璃珠法破碎菌体取摇瓶培养液离心，得到菌体沉淀，加入1 mL细胞裂解缓冲液（Breaking Buffer）重悬。加入等体积酸洗玻璃珠（直径0.5 mm），振荡30 s随后立刻冰浴中放置30 s，重复8 次。4℃，12 000 r/min，离心10 min，取上清，-20℃

保存待检测。

1.2.4　重组菌胞内和胞外MAT活力测定　胞内外MAT粗酶液的制备：取1 mL培养液经12 000 r/min，4℃，10 min离心，上清为胞外MAT粗酶液；培养液离心后收集菌体，并用细胞裂解缓冲液清洗一次，加入菌体等体积的酸洗玻璃珠（直径0.5 mm）和1 mL细胞裂解缓冲液，采用玻璃珠法破碎细胞，吸取细胞破碎液，并将粗抽提液经12 000 r/min，4℃，10 min离心，上清液即为胞内粗酶液。MAT酶活通过HPLC检测［21］。酶活的计算：1个酶活单位定义为37℃下，1 min内转化生成1 μmol的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）所对应的酶量。

1.2.5 蛋白浓度测定及SDS-PAGE分析发酵液于4℃，12 000 r/min 离心15 min，上清液经0. 45 μm 的微滤膜去除残余菌体，随后采用截留分子量为10 kD的超滤膜（Millipore公司，美国）进行浓缩（约5倍）。发酵上清的蛋白浓度测定采用Bradford蛋白定量试剂盒，按说明书操作。采用 Bio-Rad 蛋白电泳试剂盒操作，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%的SDS-PAGE分析发酵上清重组蛋白。

2 结果

2.1 MAT表达载体和重组菌的构建

将载体pPIC3.5K/ST中的S-腺苷甲硫氨酸合成酶（MAT）基因sam片段克隆至pPIC9K质粒，获得重组酶M（重组S-腺苷甲硫氨酸合成酶）表达的载体p9KM（图1-A）。在重组酶M的N端融合一段间隔肽G-Spacer，构建了重组酶GM表达的载体pGM （图1-B）。为了便于重组酶的分离纯化，构建了重组酶GM的C端带有His-tag的表达载体pGMH，重组酶GMH的表达框如图1-B所示。

将重组质粒pPIC9K、p9KM、pGM和pGMH用限制性酶Bpu1102 I酶切线性化后，分别电转毕赤酵母KM71、GS115，获得系列重组菌：K/9K、K/9KM、K/GM和K/GMH；G/9K、G/9KM、G/GM和G/GMH。

2.2 MAT分泌表达对重组菌生长的影响

各重组菌中的 MAT 基因sam2 均由 AOX1 启动子调控，需甲醇诱导表达。在整个发酵期间，重组菌G/9KM、G/GM和G/GMH的生长趋势与对照菌G/9K 相似（图2-A），MAT诱导表达后并未影响细胞生长。

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秦秀林等：利用间隔肽促进S -腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达

α MF

Bam H I

p9KM 10506 bp ATG sam

TAA Eco R I

Bam H I

P AOX

α MF

ATG G-Spacer

sam

6×His-tag

Eco R I

Bam H I

P AOX P

A O

X s a

H I

Kan

p B

R 3

A m p

图1 重组质粒及重组酶GM 、GMH 表达框（B ）

6040O D 600

? ? h

4872

? ? h

4872

G/9KM G/GM G/GMH G/9K

K/9KM K/GM K/GMH K/9K

重组菌K/9KM、K/GM 和K/GMH 也是同样（图2-B）。结果表明，MAT 的诱导分泌表达对菌体生长无显著影响。

2.3 MAT 在重组毕赤酵母中的分泌表达

将质粒pPIC9K、p9KM、pGM 和pGMH 用限制性酶Bpu 1102Ⅰ酶切线性化，分别电转化毕赤酵母KM71和GS115构建对应的系列重组基因工程菌K/9K（对照菌）、K/9KM、K/GM、K/GMH、G/9K（对照菌）、G/9KM、G/GM 和G/GMH。

对照菌K/9K 和G/9K 发酵上清未检测到MAT 活性，而重组菌发酵上清都检测到MAT 酶活（图3）。KM71系列重组菌（K/9KM、K/GM 和K/GMH）胞外MAT 酶活均比GS115系列重组菌高，其中K/9KM、K/GM 和K/GMH 的酶活分别达到了157.4、440.6和376.5 U/L，而G/9KM、G/GM 和G/GMH 的酶活分别只有38.2、85.5和82.3 U/L。这表明毕赤酵母KM71

A ：重组菌G/9K、G/9KM、G/GM 和G/GMH 无水甲醇（V/V）进行MAT 的胞外诱导表达；

B ：重组菌K/9K、K/9KM、K/GM 和K/GMH 无水甲醇（V/V）进行MAT 的胞外诱导表达

图2 重组蛋白的分泌表达对重组菌生长的影响

的分泌表达。因此，后续的研究主要针系列重组菌：K/9KM、K/GM 和K/GMH。

500400300200

100M A T ?? U /L

/9K

图3 重组菌胞外MAT 酶活

SDS -PAGE 分析重组菌分泌表达的重组MAT 分子量约为50 kD（图4），比理论分子量（45 kD）偏

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大，可能是MAT 分泌过程的过度糖基化修饰造成

显著影响，但降低了其酶活性。

酶活之比）的影响，检测了重组菌K/9KM、K/GM 和K/GMH 胞内外MAT 酶活。重组菌K/9KM、K/GM 和K/GMH 细胞内均检测到了MAT 酶活（表2），说明重组菌细胞内均有未分泌至胞外的MAT 蛋白。分析比较K/9KM、K/GM 和K/GMH 中MAT 分泌效率，较K/9KM 而言，重组菌K/GM 和K/GMH 重组MAT 分泌效率分别提高了92%和85%（表2），间隔肽G -Spacer 确实有效地提高了MAT 的分泌效率，并且重组蛋白GM 的C 端融合表达His -tag 对重组MAT （GMH）的分泌并没有显著影响。

3 讨论

SAM 合成酶（MAT）的大量获得，对于酶促法大规模合成SAM 至关重要。本研究所构建的毕赤

和376.5 U/L。说明重组菌分泌表达MAT 最适诱导时间为72 h。

2.5 间隔肽G -Spacer 和His -tag 对MAT 酶活、蛋白表

达量和分泌效率的影响

分析了重组菌K/9KM、K/GM 和K/GMH 胞外MAT 酶活及蛋白浓度（表2），以研究间隔肽G -Spacer 和C 端His -tag 对重组蛋白MAT 比酶活及蛋白表达量的影响。与重组菌K/9KM 相比，K/GM 胞外MAT 表达量、比酶活分别提高了80%和58%；而K/GMH 胞外的MAT 酶活较K/GM 减少了13%，但对MAT 的表达量无显著影响。以上结果表明：间隔肽G -Spacer 能显著提高重组酶MAT 的酶活及分泌表达量；而C 端His -tag 对重组蛋白MAT 表达量没有

243648? ? h

60728496

K/9KM K/GM K/GMH

0 h

36 h

48 h

60 h 72 h 84 h

96 h

66.2kD 43

0 h

36 h 48 h 60 h

72 h 84 h 96 h

66.2kD

0 h

36 h

48 h

60 h 72 h

84 h

96 h

66.2kD 43

箭头所示条带为重组MAT 蛋白；M ：蛋白Marker

导时间对重组菌MAT 活性（A ）和分泌表达（B ）的影响

2013年第6期145秦秀林等：利用间隔肽促进S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达

酵母基因工程菌K/9KM成功分泌表达了具有活性的MAT重组酶（M），在重组酶M的N端融合了间隔肽G-Spacer后（即构建重组酶GM和GMH）发酵上清液中的比酶活和分泌效率均有显著提高。在重组酶GM的C端融合了His-tag后（即构建重组酶GMH）比酶活略有下降，对分泌效率并无显著影响。这说明重组酶GM和GMH比酶活和分泌效率的提高主要是N端的G-Spacer所导致。最后，构建的重组酶GMH可利用IMAC实现GMH的一步纯化和固定，大幅减少了产物损失和后继工艺的操作时间，并且MAT经固定化后其酶稳定性也可大幅提升［15］。

利用大肠杆菌表达MAT，只能获得少量具有MAT酶活性的重组酶。Alvarez等［13］在大肠杆菌中表达老鼠肝脏来源MAT时发现，尽管重组酶的表达量达到了细胞总蛋白量的30%，但大部分MAT重组酶以包涵体形式存在，导致MAT酶活性较低。酿酒酵母sam2基因编码的MAT在大肠杆菌中表达也遇到同样的问题，MAT的表达量和酶活性都很低［12］。这主要是因为大肠杆菌是原核表达系统，无法实现真核蛋白质转录后修饰和蛋白质的正确折叠，因此不适于表达真核来源的MAT。而毕赤酵母作为真核表达系统，可实现蛋白质的糖基化、磷酸化修饰，二硫键的形成，蛋白质的正确折叠，更适于MAT 的表达［15，22］。由于本研究中所表达的达观链霉菌MAT蛋白中存在两个N-糖基化位点（165 NGTI和243 NPTG），在分泌表达过程中经糖基化修饰，导致MAT重组酶分子量比理论分子量偏大，这是毕赤酵母表达外源蛋白时存在的一普遍现象［23，24］，但并不影响其MAT酶活性。

在构建MAT表达的重组毕赤酵母重组菌时，我们发现一有趣现象：以KM71为宿主菌构建的MAT 表达重组菌其MAT表达量显著高于GS115重组菌。也有类似报道［15］表明，在分泌表达酿酒酵母来源的MAT时，基于KM71构建的重组菌MAT的表达

量最高可达到约200 mg/L，显著高于GS115重组菌的MAT表达量（约49 mg/L）。

4 结论

构建的毕赤酵母基因工程菌成功分泌表达了具有活性的重组酶MAT（M）。在重组酶M的N端融合G-Spacer，即构建重组蛋白GM，其分泌效率和MAT比酶活分别较M提高了92%和58%。为了便于蛋白纯化，在重组酶GM的C端融合了His-tag，即构建重组酶GMH，其比酶活略有下降（减少13%），对分泌效率并没有显著影响。

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表2 间隔肽G-Spacer和His-tag对MAT酶活、表达量和分泌效率的影响

菌株胞外MAT酶活（U/L）胞外蛋白浓度（mg/L）胞外MAT比酶活（U/mg）胞内MAT酶活（U/L）分泌效率（%）K/9KM157.4±13.447.2±4.4 3.3±0.3270.2±28.436.8±2.8

K/GM440.6±26.284.7±5.8 5.2±0.2184.8±22.870.5±4.4

K/GMH376.5±22.483.8±5.2 4.5±0.2177.5±24.768.0±5.6

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（责任编辑马鑫）