苹果酸降解相关基因在酿酒酵母中的表达
第２期张春晖等：苹果酸降解相关基因在酿酒酵母中的表达４３
ｃＯ，和Ｈ２０）。通过对＆．＿口０，柚ｅ苹果酸酶基因转录调节的分析表明，该酶的生理作用可能是在发酵条件下，有助于维持细胞的氧化还原电位【“。
２转基因酵母的构建
近年来．人们一直试图借助遗传工程手段构建ｓｍ，批ｉｗ，使之在酒精发酵的同时也能够对苹果酸进行分解。为了将ＭＬＦ途径导入ｓ．—ｗｉ池细胞中，ｗｉｌｌｉａⅡ坞等”１从￡删ｏ∞∞驸缸ｃＩｂ和Ｉｎｄｏｂ钟ｍ琳如１６ｎ瞎吐五分离克隆了苹果酸一乳酸酶基因（ｍ如ｓ），然后将Ⅳ如ｓ导｜人ｓ，∞毗池中并得到表达。在ｓ．ｃｅ胁ｉ卯细胞内，由ｒｒ如ｓ编码的苹果酸，乳酸酶能够将Ｌ一苹果酸转变为Ｌ＿乳酸和ｃＯ：。然而，由于ｓ—ｗｉｉ一缺乏苹果酸转运系统，致使础嘏重组酵母对苹果酸的降解效率很低”１。因此，通过基因重组手段提高ｓ．—ｗｂｆｍ对苹果酸的吸收能力，是构建葡萄酒降酸酵母的一个前提条件。ｖｏｌｓｃｈｅｎｋ等“…最近从＆．ｐｏｍ占ｅ中分离到苹果酸通透酶基因（Ｍ』）和苹果酸酶基因（，蒯），从三∞ｆｏｃｏｃｃ淞胁括中分离到Ⅳ如ｓ基因。将ｍ卯』和，一２基因转移至ｓ．ｃｅ觚协细胞中并使外源基因功能性表达，获得了苹果酸．酒精酵母；将Ｊ，１０ｅＪ基因和“ｅｓ导人ｓ．ｃｅ—ｂ沁中，得到了苹果酸．乳酸酵母。
２．１苹果酸．乳酸酵母的构建
苹果酸一乳酸酵母的构建就是要将Ｍ』和ｍ拈ｓ基因导人５．ｃｅ，ｗ☆沁中，并使外源基因功能性表达。ｍ钟，的基因表达产物（ｍｅｌｐ）负责苹果酸的吸收，ｒ也ｓ的基因表达产物（ＭＬＥ）负责苹果酸的降勰。为了确保导入的两个基因共表达，需要将一』和，ｒ脚基因整合在同一个表达盒上（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｌｆｅ），整合有ｍｅｊ和耐ｅｓ基因表达盒实际上是一种双表达盒（ｄｏｕｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃ鹕ｓｅｔｔｅ）。由于ｓ．ｃｅ砒ｉ船和＆．ｐｏｒ柚ｅ系统发生差异悬殊，不能对彼此的启动子和终止子序列进行识别“…。为此，Ｈｕｓｎｉｋ等将ｓ．ｃｅＭｉｉ∞３．磷酸甘油酸激酶（ＰＧ列）基因的启动子（ＰＧＫ，．）和终止子（ＰＧ肼。）连接在双表达盒上，并将双表达盒插入整合质粒ｐｕＢ３２的ｕＲＡ３位点中，构建了苹果酸一乳酸重组质粒，然后借助共转化的方法将双表达盒整合到酵母的基因组中（图１）““。实验证明，苹果酸一乳酸表达盒的导人，不影响ｓｍ—ｉ妇固有的酒精发酵性能。在含有０．０５６ｍｏｌ，Ｌ葡萄糖、０．０５６ｍｏｌ，Ｌ果糖和０．０６ｍｏｌ，Ｌ苹果酸的混合液中，构建的苹果酸－乳酸酵母能在７天内将苹果酸完全转变成乳酸。通过对构建的酵母的苹果酸消耗量、乳酸产量及微量代谢成分的ＨＰＬｃ和Ｇｃ．Ｍｓ分析表明，苹果酸一乳酸酵母对于高酸葡萄汁的生物降酸具有很好的应用前景。
图ｌ苹果酸．乳麓酵母的构ｔ
２．２苹果酸．酒精酵母的构建
２２．１，删，基因在ｓ．ｃｅ肿ｂｉ驰中功能性表达将ＡＤｍ。一”１８ｅｊ—ＡＤ圩』。（ＡＤ刖，乙醇脱氢酶）或
ＰＧＫｌｉｍｅｌ－ｐＧＫｉ。表达盒转化鹦ｓ．ｃｅ㈣ｉｍ中，受体细胞就能有效地吸收运输基质中的Ｌ苹果酸”“。这表明，外源ｍｍＪ基因能够在受体细胞中功能性表达。合成的ｍｅｌｐ经过转录后修饰，插入到受体细胞的质膜中，执行吸收运输苹果酸的功能。进一步的研究表明，ＰＧＫｆ。比ＡＤｍ。启动转录的能力强，因而重组有＿ＰｃＫＪ，．Ｍｅ，．Ｐ（ｘ，。表达盒的受体菌中?ｔｍｌｐ的表达量和酶括力都更强。如
果仅将ｍ“Ｊ基因导人ｓ．ｃｅｒ∞ｉ池中，借助受体细
苹果酸降解相关基因在酿酒酵母中的表达
作者：张春晖， 刘树文， 夏双梅
作者单位：张春晖,刘树文(西北农林科技大学葡萄酒学院,陕西杨凌,712100)， 夏双梅(信阳农业高等专科学校植科系,河南信阳,464000)
刊名：
中国生物工程杂志
英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY
年，卷(期)：2003,23(2)
被引用次数：3次
参考文献(13条)
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引证文献(3条)
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3.孙丙升.夏广丽.张谦搏.孙凤燕.张晓燕利用微生物进行葡萄酒降酸的研究进展[期刊论文]-中外葡萄与葡萄酒2010(11)
引用本文格式：张春晖.刘树文.夏双梅苹果酸降解相关基因在酿酒酵母中的表达[期刊论文]-中国生物工程杂志2003(2)