清除自由基
清除自由基
摘要：自由基这种强氧化性物质，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应，而清除这些自由基则能有益作用于我们的身体。众多权威研究表明，负离子能够消减自由基，减缓人体衰老，增强人体免疫力。
关键词：自由基医学
在生命质量越来越受重视的今天，预防治疗各种隐患和疾病已是迫切需要，随着自由基医学、生物学等的出现，人们对自由基的认识也越来越深刻，清除自由基方面的研究也更加全面具体。现在已经研究出了各式各样的自由基清除剂，应用这些自由基清除剂清除体内多余的自由基，防止机体受损而导致疾病的产生。
一、对自由基的认识
自由基又称游离基，是具有非偶电子的基团或原子，它有两个主要特性：一是化学反应活性高；二是具有磁矩。一般情况下，生命是离不开自由基活动的。我们的身体每时每刻都从里到外的运动，每一瞬间都在燃烧着能量，而负责传递能量的搬运工就是自由基。当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时，它们对生命是无害的。但如果自由基的活动失去控制，超过一定的量，生命的正常秩序就会被破坏，疾病可能就会随之而来。所以说自由基是一把双刃剑。认识自由基，了解自由基对人体的作用，对健康十分必要。自由基是无处不在的，自由基对人体攻击的途径是多方面的，既有来自体内的，也有来自外界的。当人体中的自由基超过一定的量，并失去控制时，这些自由基就会乱跑乱窜，去攻击细胞膜，去与血清抗蛋白酶发生反应，甚至去跟基因抢电子，对我们的身体造成各种各样的伤害，产生各种各样的疑难杂症。
二、自由基清除剂
自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。
其中 ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。
三、自由基清除实验
3.1 DPPH 自由基清除实验
取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度Ab。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。
自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。
3.2 ABTS 自由基清除实验
20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸
光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。
ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100
式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。
3.3 超氧阴离子清除实验
采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm 下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。
抑制率(%)=(△A0-△A)/△A0×100 式中：△A0 为邻苯三酚的自氧化速率；△A 为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率。
四、清除自由基能力判断
4.1.DPPH·法测试机理
DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。
4.2. 羟基自由基（·OH）
1）邻二氮菲法
实验原理：邻二氮菲可与 Fe2+形成络合物，此络合物在 510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过 Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其 510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则 Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以 A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。
2）水杨酸法
实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的 2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在 510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。
3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系
测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH
甲基紫在酸性溶液中呈现紫色,在 578nm 处有强吸收。反应产生的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在 578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。
4.3.超氧阴离子自由基（O2-·）
邻苯三酚法：
超氧自由基难于用一般方法产生和检测,但是在弱碱性条件下, 邻苯三酚能
发生自氧化反应,生成 O2-·和有色中间产物, 该中间产物在λ=320 nm处有一特征吸收峰。在初始阶段, 中间产物的量与时间成线性关系。当加入O2-·清除剂时, 它能迅速与 O2-·反应, 从而阻止中间产物的积累, 致使溶液在λ =320 nm处吸收减弱。故可以通过测定 A320 值来评价清除剂对 O2-·的清除作用。
在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，从天然植物中寻找体内自由基消除剂也将是现代医药和保健行业的发展趋势。国内外已陆续发现许多有价值的天然抗氧化剂。在这方面的研究中，中国的科学家们已经走在世界的前列。他们已经发现并证明了，中国一些特有的食用和药用植物中，含有大量的酚类物质，这些物质的特点是，有着很容易被自由基夺走的电子，而它们在失去电子后就会成为一种对人没有伤害的稳定物质。人类要想从根本上避免多余自由基的侵害，还要从增强环保意识，切实改善我们的生存环境做起。
1.对·DPPH自由基的清除试验[8]-[10]
精密称取12.5mg·DPPH标准品，用无水乙醇溶解并定容至250ml。精密量取
不同体积的样品溶液，加去氧水补足1.00ml，分别加入5.00mL·DPPH溶液（如
下表6），充分混合，静置30 min，于517 nm处测吸光度值A s，5.00mL·DPPH
溶液与1.0mL无水乙醇混合后测得的吸光度A0，5.00mL无水乙醇与1.00mL样
品溶液混合后测得的吸光度A b。每个样品平行测定3次，按下式计算清除率。
清除率(%)=[A0－(A s－A b)]/A0×100%
表6.
试剂（ml）
编号
1 2 3 4 5 6
样品溶液0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
去氧水 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0
·DPPH溶液 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 2.对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除试验
采用邻苯三酚自氧化法。具体操作如表7：取4.50mL0.1mol/L的Tris-HCl
缓冲液（PH8.2）于具塞试管中，于25℃恒温20min，加入不同体积的样品溶液，
去氧水补足，再加入0.40mL50.0mmol/L邻苯三酚，混匀后于25℃恒温反应4min，
立即加入0.10mL8.0mol/LHCl终止反应。以蒸馏水做参比，在320nm处测定吸
光度值。每个样品平均测定3次，按下式计算清除率。
清除率（%）=[1-（A
样品-A
样品空白
）/A
空白
]×100%
式中：A
空白——加邻苯三酚但不加样品的吸光度；A
样品
——加邻苯三酚和样
品的吸光度；A
样品空白
——不加邻苯三酚只加样品的吸光度。
编号
试剂（ml）
1 2 3 4 5 6
Tris-HCl缓冲液 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 样品溶液0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
去氧水 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0
邻苯三酚0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
8.0mol/LHCl 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
3.对羟基自由基(·OH)的清除试验
利用H2O2与Fe2＋反应产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收。具体操作如表8：在250mL具塞锥形瓶中依次移入25.00mL7.5mmol/L FeS04溶液和25.00mL4%H2O2溶液，混合均匀后加入25.00mL6mmol/L水杨酸溶液，于36～37℃恒温水浴中反应15min后于510nm 处测其吸光度，此值记为A0。将A0值的测定体系分成6份，放入25mL具塞管中，每份5.00mL，依次加入不同体积的样品溶液，去氧水补足，于36～37℃恒温水浴中反应15min，于510nm处测其吸光度，此值记为Ax。每个样品平行测定3次，计算清除率。
清除率(%)=(A0－Ax)/A0×100%
编号
试剂（ml）
1 2 3 4 5 6
混合后试液 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
样品溶液0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
去氧水 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0
4.3结果与分析
4.3.1草莓提取物对·DPPH的清除作用
·DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基。若受试物能将其清除，则表明受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链式反应的作用。在·DPPH的反应体系中，样品YSYZ、样品DKSZ及VC 对·DPPH的清除能力如图1所示。可以看出，样品YSYZ、样品DKSZ及Vc在
试验浓度范围对·DPPH的清除能力呈良好的量效关系，随着质量浓度增加，清除率也逐渐增强，并且草莓样品DKSZ对·DPPH的清除能力明显高于VC。
图1.样品YSYZ、样品DKSZ和Vc对·DPPH自由基清除作用结果
4.3.2草莓提取物对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除作用
O2·-自由基是机体内寿命最长的自由基，通常作为自由基链式反应的引发剂，产生活性更强的自由基。O2·-自由基可从其生成位置扩散到较远距离，达到靶位置，具有较大的危害性。因此，对O2·-自由基的清除，可以有效地减少氧自由基的生成量。样品YSYZ、样品DKSZ及Vc对O2·-的清除作用如图2所示。可以看出，样品YSYZ、样品DKSZ及Vc均具有一定的清除超氧阴离子自由基O2·-活性，且随着样品浓度的增加，对O2·-的清除率呈上升趋势。当样品浓度高于100μg/ml时，样品DKSZ的清除能力明显高于VC。
图2. 样品YSYZ、样品DKSZ及Vc对O2·-自由基清除作用结果
4.3.3草莓提取物对羟自由基·OH的清除作用
·OH是活性氧中最活泼的氧自由基，它几乎能与活细胞中任何分子发生反应，可介导机体组织脂质过氧化，蛋白质解聚、聚合，核酸断裂和多糖裂解等生化过程，引发组织细胞病变，导致各种疾病发生和加速机体衰老。减少此类自由基，可预防衰老、心血管疾病，并具有防癌、抗癌的作用。样品YSYZ、样品DKSZ及Vc对羟自由基·OH的清除结果见图3，样品YSYZ、样品DKSZ及Vc 均具有清除羟自由基·OH的能力，且在试验浓度范围，样品YSYZ、样品DKSZ 及Vc清除羟自由基·OH的作用都呈量效关系。
图3. 样品YSYZ、样品DKSZ及Vc对羟自由基·OH清除作用结果
4.4结论
体外试验结果表明，草莓提取物样品YSYZ、样品DKSZ具有较强的还原力，可作为氢供体，具有清除·DPPH自由基、超氧阴离子自由基（O2·-）和羟自由基（·OH）能力。
长期食用含有人工合成抗氧化剂的食品可以影响人体健康，因此植物来源的食品添加剂越来越受到青睐。植物来源的食品添加剂，特别是天然酚类还具有一定的抗氧化等保健功能。将具有抗氧化性质的草莓酚类物质应用于功能性食品和医药等领域前景看好。
羟基自由基清除注意事项
一般而言，对于Fenton试剂与有机化合物氧化能力的影响因素大致上可分为： A.亚铁离子浓度。 B.过氧化氢浓度。 C.溶液于反应时的反应温度。 D.溶液中的pH值。 以下将对此四项变因做详细的探讨： A.亚铁离子浓度的影响 在Fenton试剂的反应中，亚铁离子主要是扮演着催化过氧化氢的角色。因此，若溶液中没有亚铁离子当触媒，则其溶液可能就没有氢氧自由基的生成。所以，大致上分解反应会随亚铁离子的浓度增加而加快，亚铁添加量会影响脱色效率，亚铁剂量愈高效果愈佳，此原因为增加亚铁剂量将使氧化反应更加完全并且可产生混凝机制而进行脱色(26)。但亚铁离子本身会与有机物形成竞争，亚铁离子浓度过高会增加氢氧自由基的消耗，反而造成处理效果的下降，反应式如下： Fe2+ + ·OH Fe3+ + OH- 故当浓度到达某一定值时，则其分解速率便不会在随着亚铁离子浓度的增加而持续加快，且亚铁离子浓度和生成物的比值也将可能会影响生成物的分布。一般而言，亚铁离子浓度皆维持在亚铁离子与其反应物之浓度比值为1：10-50(wt/wt)。 此外，亚铁在Fenton程序中除了扮演催化过氧化氢的角色外，亦具有混凝的功能，因此过量的铁离子加入将会造成过度的混凝，降低Fenton程序处理的效果，其可能的反应如下所示: B.过氧化氢浓度的影响 反应过程中，过氧化氢的浓度会直接影响氧化有机物的效果。一般而言，随着过氧化氢添加量的增加，有机物的氧化效果亦将随之提升，并且过氧化氢的添加浓度不同，则分解反应生成的产物将会有所差异。大致而言，在过氧化氢浓度越高的情况下，则其氧化反应产物，将会更趋近于最终产物。但是，当溶液中的过氧化氢浓度过高时，反而会使过氧化氢与有机物竞争氢氧自由基，而造成反应速率的结果可能不如预期一般增加。此外，当Fenton试剂系统中过氧化氢浓度远高于亚铁离子浓度时，Fenton法所产生的氢氧自由基会与过氧化氢反应产生perhydroxyl radical (HO2．)及一系列反应，且三价铁离子会与HO2．进行氧化还原反应生成superoxide radical anion (O2．)，造成过氧化氢消耗量的增加，过量的过氧化氢加药量并不必然增加氢氧自由基的浓度，氢氧自由基达到稳定浓度所需反应时间随加药量增加而增加(27)。因此，若以连续之方式加入低浓度之过氧化氢，减少因为过氧化氢初始浓度过高所导致的抑制效应，亦可得到较好的氧化效果。 C.温度的影响 根据Arrhennius' Law：k=k0exp(-Ea/RT)可得知温度的改变会影响活化能及反应速率常数，进而影响反应速率。 对于Fenton试剂反应而言，一般若选用的反应温度条件是在小于20℃以下时，其对有机物的氧化速率将会随温度升高而加快。但是，倘若将其反应的温度升高至40-50℃时，其Fenton反应将会可能因为温度过高，进而使过氧化氢自行分解成水与氧(2H2O2 → 2H2O + O2 )，造成Fenton试剂对氧化有机物之反应速率减慢。 因此，当过氧化氢浓度超过10-20 g/L时，在其经济与安全的考量下，应谨慎选择适当的温度。在一般商业应用上，通常皆将其反应的温度设定在20-40℃之间。 D. pH值的影响 于Fenton试剂反应中，其反应溶液之pH值对Fenton法之影响，关系到铁离子错合效应、铁
超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
DPPH自由基清除法
DPPH自由基清除法 李熙灿/Xican Li （广州中医药大学） [文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140. [原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。 N 2 2 当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。 1.3 预试 取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。 【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。 1.4测量 A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95乙醇（或无水乙醇）1mL，充分混合，测A值（519nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。 A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL （x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95乙醇（或无水乙醇），混合，静置30分钟后，测A值（519nm）。如：某样品的用量梯度为40、80、120 、160、200μL，则加样表如下： 表1 加样表 1.5 正式测量
自由基清除剂
自由基清除剂 以下几种食物是很好的自由基清除剂，你不妨试一试： 一、茶：茶中的有效成分茶多酚是一种抗氧化剂物质，凡经常饮茶的地区，其居民患癌症的几率较低。由此可见，茶多酚能消除自由基防止癌症的发生。 二、葡萄：葡萄中含有大量多酚类物质，其中最重要的是原花青素(0PC)——此物质具有抗自由基、保护心脑血管、调节血脂、预防高血压、抗肿瘤等多种作用。原花青素主要存在于葡萄籽和皮中，吃葡萄时，可以将籽与肉嚼碎同食。 三、苹果：苹果在所有的水果中是口碑最好的，而且适合不同年龄、不同体格的人。研究发现，常喝苹果汁会降低心脏病的患病率。这是因为苹果汁中的抗氧化剂有利于心脏的健康运转。 四、番茄：番茄含有番茄红素，一种抗氧化剂物质。食物的生熟很重要。如果食用的番茄是生的，它们的总抗氧化剂潜能大约为80。如果将番茄煮熟或装入罐中，它们的总抗氧化剂潜能就会增长5-6倍。五、菠菜：其含有大量β-胡萝卜素和铁，还有大量的α-硫辛酸，能提供给人体丰富的营养。菠菜中的大量抗氧化剂，既能激活大脑功能，又可增强青春活力，有助于防大脑的老化和老年痴呆。 六、山楂：所含有的黄酮类物质和维生素C、胡萝卜素等能阻断并减少自由基的生成，增强机体的免疫力，还有防衰老、抗癌的作用。 七、胡萝卜：胡萝卜不仅能够增强人体免疫力，有抗癌作用，它更含有丰富的胡萝卜素，胡萝卜素可以清除致人衰老的单线态氧和自由
基，减缓人体衰老的过程，防止皮肤老化。 八、黄豆：含有异黄酮和黄豆皂甙，是一种天然抗氧化剂，同时具有弱雌性激素作用。常喝豆浆可以明显减弱妇女更年期症状，而且还有防癌和预防老年痴呆症的作用。对女性有很好的美容养颜的功效。 九、大蒜：大蒜中的大蒜素有较强的抗自由基能力。大蒜切开在空气中被氧化需要15分钟以上。
自由基清除剂
第五章自由基清除剂 本章要点 1.自由基理论的产生机理及来源 2.自由基对机体活动的影响 3.自由基清除剂的基本概念 随着生命科学的飞速发展，英国人Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的观点被越来越多的实验所证明。 自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除，它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。 近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。 第一节自由基理论 一、自由基的产生机理及来源 自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。 人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。氧自由基包括超氧阴离子（O2－·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2－·）、烷过氧基（ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO－）、氢过氧化物（ROOH）和单线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。 （一）自由基的产生 人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。 人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。 自由基反应包含3个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自
如何清除体内自由基
如何清除体内自由基 消除体内自由基，应该要了解自由基的来源，从外界到身体内部的代谢一起中和性的描叙不要单方面的讲叙体内各种酶与自由基之间的关系 人体内的自由基有两个来源：其一是来自环境，如环境污染、食品污染、过度的紫外线照射和各种辐射、杀虫剂、室内外废气、吸烟、二手烟、酗酒、工作压力、生活不规律等等，都会直接导致人体内产生过多的自由基（活性氧）；食品添加剂、食用脂肪和熏炸烤肉、某些抗癌药物、安眠药、抗生素、有机物腐烂物、塑料用品制造过程、油漆干燥挥发、石棉粉尘、空气污染、化学致癌物、大气中的臭氧等也都能诱发人体内产生自由基。 其二是来自体内，人体内组织细胞的新陈代谢也会产生自由基，这是人体代谢过程的正常产物，十分活跃又极不稳定，它们会附着于健康细胞之上，再慢慢瓦解健康细胞，而被破坏的细胞则又再转而侵害更多健康的细胞，如此恶性循环从而导致人体的衰老和疾病的发生。另外，组织器官损伤后的缺血一段时间后又突然恢复供血(即重灌流)，如心肌梗塞、脑血栓、外伤、外科手术后，自由基会大量生成。正常人体有一套清除自由基的系统，但这个系统的力量会因人的年龄增长及体质改变而减弱，致使自由基的负面效应大大增强，引起多种疾病发病率的提高。活性氧自由基对人体的损害实际上是一种氧化过程。因此，要降低自由基的损害，就要从抗氧化做起。 听说过抗氧化剂吗？它对人体的健康可是有着密切的关系。既然自由基不仅存在于人体内，也来自于人体外，那么，降低自由基危害的途径也有两条：一是，利用内源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二是发掘外源性抗氧化剂——自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。 大量研究已经证实，人体内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等一些酶和维生素C、维生素E、还原型谷胱甘肽、β-胡萝卜素和硒等一些抗氧化剂。酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对肌体的攻击力。酶的防御作用仅限于细胞内，而抗氧化剂有些作用于细胞膜，有些则是在细胞外就可起到防御作用。这些物质就深藏于我们体内，只要保持它们的量和活力它们就会发挥清除多余自由基的能力，使我们体内的自由基保持平衡。 要降低自由基对人体的危害，除了依靠体内自由基清除系统外，还要寻找和发掘外源性自由基清除剂，利用这些物质作为替身，让它们在自由基进入人体之前就先与自由基结合，以阻断外界是自由基的攻击，使人体免受伤害。在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，种类极多。目前，国内外已陆续发现许多有价值的天然抗氧化剂。如β－胡萝卜素（维生素A）、维生素C、维生素E、番茄红素、辅酶q10、等等。此外，我国很多中草药植物中的有效成分都是天然抗氧化剂，例如，银杏黄酮、甘草黄酮等，另外还有巴西菇、灰树花、茯苓、黄芪、丹参、银杏、枸杞、灵芝、人参......。 吃什么可以减少体内自由基 在正常的生命过程中，自由基为维持生命所必需。体内自由基不断产生，也不断地被清除，两者 处于动态平衡之中，使之维持在一个正常的生理水平上。自由基在生物体内具有参与吞噬病原体，参 与前列腺素和凝血酶原的合成、解毒，参与体内部分生化反应和胶原蛋白的合成，调节细胞增殖与分化，参与机体免疫和环核苷酸的生物合成，以及生殖和胚胎发育等重要的生理功能。但是当自由基过 量时，自由基在机体内损伤蛋白质、核酸和生物膜，导致细胞凋亡，并参与许多疾病的发病过程。 由基清除剂即抗氧化剂清除机体自由基，保护机体免受氧化损害中起重要作用。因此，近年来对 自由基清除剂的研究备受关注。多吃点抗氧化剂食物有利于减少体内多余自由基。 方法/步骤 1.全面复方自由基清除剂：葡茶多酚胶囊。适当吃葡茶多酚可以全面清除体内多余自由
ABTS自由基清除法SOP
主要目的： ——为了测定样品清除ABTS自由基的能力。主要原理： ——用 K 2S 2 O 8 与 ABTS 直接生成稳定的阳离子自由基 ABTS+，抗氧化物质与 ABTS+发生反应而使反应体系褪色。 实验室签章
一、试剂 ——K 2S 2 O 8 水溶液 ——ABTA溶液 ——乙醇（分析纯）——PBS 溶液 二、仪器设备 ——96孔酶标板 ——UV-Vis可见多功能酶标仪——移液枪 ——200 μL量程枪头
三、实验方法 ◆前期准备 ABTS储备液（7.4 mmol/L）取ABTS 96 mg，加蒸馏水25 mL。 K 2S 2 O 8 储备液（2.6 mmol/L）取K 2 S 2 O 8 378.4 mg，加蒸馏水10 mL。 将5 ml 7.4 mmol/L ABTS储备液与88 μL 2.6 mmoL/L K 2S 2 O 8 混匀，静置12-16 小时，配制成ABTS工作液。 ◆ABTS自由基清除法 0.4 mL ABTS工作液，用 PBS 溶液稀释，要求在常温下734nm 处吸光值为0.7±0.02。0.2 mL ABTS+·工作液与 10uL 不同浓度受试物混合，常温避光静置 6min，在 734 nm 波长处测吸光度，平行3次。 ABTS自由基清除能力由下式计算： 清除率（%）=[A 0-A i /A ]×100% 式中： A 0为不加样品，加入 ABTS 的吸光度；A i 为加入样品和 ABTS 的吸光度 （注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）
清除自由基研究方法汇总
电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法 自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 原理部分： 1.DPPH·法测试机理 DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。 2. 羟基自由基（·OH） 1）邻二氮菲法[70]
实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。 2）水杨酸法[71] 实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。 3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系 测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下： Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH 甲基紫在酸性溶液中呈现紫色[9],在578nm 处有强吸收。反应产生的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。
A清除自由基实验方法
1、DPPH 自由基清除实验 取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL 乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度A b。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。 2、ABTS 自由基清除实验 20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。 ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100 式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。 3、超氧阴离子清除实验 采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。 抑制率(%)=(△A0-△A)/△A0×100 式中：△A0 为邻苯三酚的自氧化速率；△A 为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率。
dpph自由基清除测定
dpph自由基清除测定 DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性 抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。 目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。 DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH?，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH?的效果，来计算抗氧化能力。 [1]实验研究表明，黄芩黄酮中清除DPPH自由基活性的主要成分是黄芩苷，黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下: ONON22 +H+NNONNONNH22 NONO22 DPPH与抗氧化剂反应原理 材料:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼);无水乙醇; 仪器:分光光度计 1.DPPH贮备液的制备
准确称取DPPH试剂3(5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol,L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。 2.试液的制备(只作参考) 准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物(32.75%),用无水乙醇溶解，并定量转入 50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mmol,L试液。 3.DPPH?清除率的测定 在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。按下式计算自由基清除率(K): K(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]*100% 试验重复三次，取其平均值作为最后结果。 [1].刘玉萍,Purusotam Basnet,小松かっ子,曹晖.黄芩清除自由基活性与黄芩苷含量的相关性研究[J].中国中药杂志,2002,27(8):575-579 药品:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼); 推荐厂家:上海如吉生物科技发展有限公司; 北京诺博莱德科技有限公司; 报价:380元/瓶;500元/瓶; 规格:1g/瓶; 含量:99%; 产地:日本进口 DPPH稳定性不好，要用时,新鲜配制 DPPH浓度要根据样品的活性来定，一般在20-100μg/mL
自由基清除剂
自由基清除剂 随着生命科学的飞速发展，英国人Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的观点被越来越多的实验所证明。 自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除，它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。 近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。 第一节自由基理论 一、自由基的产生机理及来源 自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。 人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。氧自由基包括超氧阴离子（O2－·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2－·）、烷过氧基（ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO－）、氢过氧化物（ROOH）和单线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。 （一）自由基的产生 人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。 人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。 自由基反应包含3个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自由基在扩展阶段没有消失或增加，那么反应中就有几条链。随着反应的进行，体系中的反应物浓度越来越低，自由基相互碰头的机会越来越多，反应速度就越来越慢，自由基越来越少，最后反应停止。由此可见，自由基反应动力学有别于普通的分子反应，自由基可以连续传递而出现连锁反应。 过氧化物作为引发剂可以使反应在较低温度下进行，如果反应体系中有自由基清除剂存在，它就能很快地捕捉自由基使扩散不能形成。活性强的自由基清除剂能阻止连锁反应的开始。因为氧分子与许多有机物反应时产生自由基，而自由基清除剂能捕捉过氧自由基而中断连锁反应，阻止有机物的氧化，所以自由基清除剂又称为抗氧化剂。 （二）自由基的来源 人体内特定的自由基有不同的来源。 超氧阴离子自由基（O2－·）在其中扮演着非常重要的角色，因为在反应顺序上其他许多活性中间产物的形成都始于与O2－·起作用。它是从黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶通过酶的一电子还原作用释放的氧
过氧自由基清除能力测定法-操作图解
过氧自由基(?O2-)的清除能力（连苯三酚自氧化法）（适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式 清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0 *100
清除自由基
清除自由基 摘要：自由基这种强氧化性物质，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应，而清除这些自由基则能有益作用于我们的身体。众多权威研究表明，负离子能够消减自由基，减缓人体衰老，增强人体免疫力。 关键词：自由基医学 在生命质量越来越受重视的今天，预防治疗各种隐患和疾病已是迫切需要，随着自由基医学、生物学等的出现，人们对自由基的认识也越来越深刻，清除自由基方面的研究也更加全面具体。现在已经研究出了各式各样的自由基清除剂，应用这些自由基清除剂清除体内多余的自由基，防止机体受损而导致疾病的产生。 一、对自由基的认识 自由基又称游离基，是具有非偶电子的基团或原子，它有两个主要特性：一是化学反应活性高；二是具有磁矩。一般情况下，生命是离不开自由基活动的。我们的身体每时每刻都从里到外的运动，每一瞬间都在燃烧着能量，而负责传递能量的搬运工就是自由基。当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时，它们对生命是无害的。但如果自由基的活动失去控制，超过一定的量，生命的正常秩序就会被破坏，疾病可能就会随之而来。所以说自由基是一把双刃剑。认识自由基，了解自由基对人体的作用，对健康十分必要。自由基是无处不在的，自由基对人体攻击的途径是多方面的，既有来自体内的，也有来自外界的。当人体中的自由基超过一定的量，并失去控制时，这些自由基就会乱跑乱窜，去攻击细胞膜，去与血清抗蛋白酶发生反应，甚至去跟基因抢电子，对我们的身体造成各种各样的伤害，产生各种各样的疑难杂症。 二、自由基清除剂 自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中 ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 三、自由基清除实验 3.1 DPPH 自由基清除实验 取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度Ab。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。 自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。 3.2 ABTS 自由基清除实验 20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸
羟自由基清除率测定
抗氧化活性的测定(参考)——测定活性物质对羟自由基的清除率 （羟自由基清除试验） 采用Fenton 试剂：过氧化氢/亚铁盐。 原理：H 2O 2与亚铁离子反应生成·OH,·OH 自由基一般存活时间比较短，具有较高的反应活性。当在反应体系中添加水杨酸，便能快速的捕捉·OH 而产生紫色化合物（2,3-二羟基苯甲酸），该有色化合物在510nm 处有较大吸收峰，测其吸光度可表示羟自由基（?OH ）的多少，吸光度与羟自由基（?OH ）的量成正比。反应体系中若加入羟自由基（?OH ）清除剂后，被氧化的水杨酸减少，则体系颜色变浅甚至消失，吸光度变小。 操作： 样品处理：蔬菜水果切分，榨汁（切分后可放在2%的盐酸或草酸溶液中护色）。将蔬菜汁或果汁放入50ml 离心管中（如有颜色加适量活性炭或白陶 土），在3000~ 4000rpm 下离心10min~ 20min 后（若样品蛋白含量较高，需加适量乙酸锌，亚铁氰化钾）快速过滤，滤液备用。 取25ml 比色管2支（样品管、空白管），分别加入5ml 1mmol/L 硫酸亚铁溶液、5ml 3mmol/L H2O2溶液，样品管中加入1ml 样品溶液，空白管中加入1ml 蒸馏水，混合均匀后用3mmol/L 水杨酸溶液定容至刻度，在37℃(0.1±℃)的恒温水中反应15min 后，用分光光度计在510nm 的波长下测定各管的吸光度。以3mmol/L 水杨酸溶液调零。 其对?OH 自由基的清除率SA （%），可根据下式进行计算：式中： A0—不加样品的吸光度； A1—加入样品的吸光度 100A0A1-A0= SA(%)?清除率 ###【以往经验，不一定全适用】：若样品不进行脱色处理，则操作如下：在3支25ml 的比色管中（样品管、空白管、样品本底管）依次加入5ml1mmol/L 硫酸亚铁溶液，空白管和样品管中各加入5ml3mmol/L H 2O 2溶液，本底管中H 2O 2溶液用蒸馏水代替。
竹叶提取物清除DPPH自由基的测定方法
收稿日期:2003-11-06 修回日期:2004-12-05 基金项目:福建省林业厅基金资助项目(闽林[2000]08). 作者简介:郑德勇(1966-),男,副教授.研究方向:树木提取物、林产化工工艺与设备. 竹叶提取物清除DPPH 自由基的测定方法 郑德勇1,安鑫南 2 (1.福建农林大学材料工程学院,福建福州350002;2.南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037)摘要:确定了以光度计比色法测定天然抗氧化剂清除二苯基苦基苯肼(DPPH )自由基能力的条件.通过测定抗坏血酸、槲皮素、硫脲和芦丁的DPPH 自由基清除率曲线,提出以IC 50值作为评价试样清除DPPH 自由基能力的指标,并将此应用于21种丛生竹竹叶提取物清除DPPH 自由基能力的测定. 关键词:竹叶提取物;光度计比色法;清除能力;二苯基苦基苯肼 中图分类号:Q946文献标识码:A 文章编号:100627817(2005)0120059204D eterm i n i n g m ethod of D PPH free rad i ca l scaveng i n g acti v ity of bam boo leaf extracti ves ZHENG De 2yong 1,AN Xin 2nan 2 (1.College of Materials Engineering,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China;2.College of Che m ical Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing,J iangshu 210037,China ) Abstract:A s pectr ophot ometric method f or deter m ining 1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl (DPPH )free radical scavenging activity of natural anti oxidants was put f or ward .The evaluating criteri on of DPPH free radical scavenging activity was regarded as “I C 50”by deter m ining the scavenging rate curves of ascorbic acid,quercetin,thi ocarba m ide and rutin .The DPPH free radical scavenging ac 2tivity of extractives fr om 21s pecies of cluster 2ba mboo ′s leaf were deter m ined by this method . Key words:leaf extractive of cluster 2ba mboo;s pectr ophot ometry;scavenging activity;1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl 植物抗氧化剂广泛应用于食品、医药、保健品和化妆品等行业 [1-4].竹叶抽提物含有黄酮、苷类、活性多糖及特种氨基酸等[5,6],具有显著的抗氧活性、防腐性能和抑菌作用 [7-9].竹叶提取物中的抗氧化有效成分主要是水溶、醇溶性物质,可通过测定二苯基苦基苯肼(DPPH )自由基的清除能力进行抗氧化活性研究.清除自由基的检测方法有许多种[10,11],体内试验比较灵敏、繁琐,周期较长,费用高,不适于大量样品 的测定.大量样品的抗氧化活性筛选需采用体外实验法[12-15],其中电子自旋共振波谱法(ESR )是测定自 由基的最直接而有效的体外试验技术,但需要昂贵的仪器和复杂的自由基捕集技术.DPPH 检测法 [16,17]是通过DPPH 分子中1个稳定的自由基与抗氧化剂提供的1个电子配对结合,使DPPH 的特征紫色消失,因 此可用于抗氧化剂清除自由基能力的评价.1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 HP1100高效液相色谱仪(DAD 检测器)为美国安捷伦公司产品;UV2000型紫外分光光度计为上海光 谱仪器厂产品.DPPH 的质量分数≥95%(Sig ma 产品).配制6.5×10-4mol ?L -1乙醇贮备液,置于冰箱, 临用前用体积分数为50%的乙醇稀释.槲皮素、芦丁的质量分数≥95%.其他试剂均为分析纯. 1.2 试样的制备 竹叶采集于福建农林大学南平校区校园和南平市城郊林场丛生竹种源地.取约500g 竹叶,用清水洗净晾干,用微波炉加热30s 杀青,取出风干,破碎,并过20-80目筛,备用.取2份各5.0g 竹叶试样,分别经20mL 石油醚脱脂处理后,加入100mL 体积分数为60%的乙醇50℃提取10h (2次),倒出提取液,抽福建农林大学学报(自然科学版) 第34卷第1期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Editi on )2005年3月
清除DPPH自由基能力检测方法
DPPH自由基清除法 [文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140. [原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。 N 2 2 当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。 1.3 预试 取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。 【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。 1.4测量 A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95乙醇（或无水乙醇）1mL，充分混合，测A值（519nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。 A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL （x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95乙醇（或无水乙醇），混合，静置30分钟后，测A值（519nm）。如：某样品的用量梯度为40、80、120 、160、200μL，则加样表如下： 表1 加样表 1.5 正式测量 方法大致与1.4相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行数据后，都要重测一次A0.