单细胞转录组测序及生物信息学分析项目 一、项目内容： 单细胞RNA

单细胞转录组测序及生物信息学分析项目

一、项目内容：

1.单细胞RNA提取及转录组扩增；

2.转录组测序文库制备；

3.转录组测序：每个样品产生不低于4Gb的clean data；

4.测序数据质控；

5.生物信息分析

1)对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理；

2)测序评估（数据比对统计，测序饱和度分析，测序随机性的统计分析，Reads

在参考基因上的分布分析）；

3)鉴定mRNA编码序列：根据已知的蛋白序列和比对的结果，估计出实验中

测到的基因的表达量；

4)差异表达基因GO功能显著性富集分析；

5)差异表达基因Pathway显著性富集分析；

6)蛋白互作网络分析；

7)鉴定已知的lncRNA，并估计表达量丰度；

8)预测新的lncRNA

9)lncRNA表达水平分析：根据不同组之间的表达情况，进行差异表达lncRNA

的分析；

10)lncRNA靶基因预测：

a)预测Cis作用靶基因

b)预测Trans作用靶基因

c)差异LncRNA与靶基因调控网络分析

二、样本数：12个人单细胞样本

生物信息学软件及使用概述

生物信息学软件及使 刘吉平 liujiping@https://www.wendangku.net/doc/9a5046984.html, 用概述 生 物秀-专心做生物！ w w w .b b i o o .c o m

生物信息学是一门新兴的交叉学生物信息学的概念： 科，它将数学和计算机知识应用于生物学，以获取、加工、存储、分类、检索与分析生物大分子的信息，从而理解这些信息的生物学意义。 生 物秀-专心做生物！ w w w .b b i o o .c o m

分析和处理实验数据和公共数据，生物信息学软件主要功能 1.2.提示、指导、替代实验操作，利用对实验数据的分析所得的结论设计下一阶段的实验 3.实验数据的自动化管理 4.寻找、预测新基因及其结构、功能 5.蛋白质高级结构及功能预测（三维建模，目前研究的焦点和难点） 生 物秀-专心做生物！ w w w .b b i o o .c o m

功能1. 分析和处理实验数据和公共数据，加快研究进度，缩短科研时间 ?核酸：序列同源性比较，分子进化树构建，结构信息分析，包括基元(Motif)、酶切点、重复片断、碱基组成和分布、开放阅读框（ORF ），蛋白编码区（CDS ）及外显子预测、RNA 二级结构预测、DNA 片段的拼接； ?蛋白：序列同源性比较，结构信息分析（包括Motif ，限制酶切点，内部重复序列的查找，氨基酸残基组成及其亲水性及疏水性分析)，等电点及二级结构预测等等； ?本地序列与公共序列的联接，成果扩大。 生 物秀-专心做生物！ w w w .b b i o o .c o m

Antheprot 5.0 Dot Plot 点阵图 Dot plot 点阵图能够揭示多个局部相似性的复杂关系 生 物秀-专心做生物！ w w w .b b i o o .c o m

单细胞测序技术

单细胞测序技术 单细胞测序技术是一种能够在单细胞水平上对基因组或转录组进行高通量测序和分析的新技术。与传统的高通量测序相比，单细胞测序不仅可以分析相同表型细胞的异质性，还可以获得难培养微生物和有价值的临床样本的遗传信息，具有广阔的应用前景。 细胞是生命的单位。目前，基因检测主要是从组织中提取DNA进行测序。实验结果通常是细胞群体中信号的平均表达，是细胞群体的整体表征，或仅代表在数量上占优势的细胞信息。单个细胞的独特细胞特征往往被忽略。 大量研究发现，在同一器官或组织中，同一类型的细胞也表现出明显的异质性，而且每个细胞都有自己独特的表达模式。例如，实体肿瘤样本中超过一半的RNA来自非癌细胞(成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等)，这使得癌细胞的信号被隐藏。因此，不可能使用单个单元来表示关键信息。 另一方面，传统高通量测序方法，难以应用在对自然界中难培养的微生物的研究、罕见循环肿瘤细胞的转录组分析、胚胎发生最早期的分化特征研究、肿瘤的非均质性和微进化研究等精确程度较高的研究领域[1]。随着细胞分选和测序技术进步，单细胞测序技术应运而生。 （一）单细胞测序技术颇受关注 《Nature Methods》杂志将单细胞研究方法列为未来几年最值得关注的技术领域之一。《Science》杂志将单细胞测序列

为年度最值得关注的六大领域榜首。 （二）单细胞测序技术流程 1. 单细胞分离 针对单个细胞研究时，首先将单个细胞进行分离，并确保其生物完整性不被破坏。目前常用的单细胞分离方法有连续稀释法、显微操作法、激光捕获显微切割术、拉曼镊子技术、荧光激活细胞分选术和微流控技术等。 2. 细胞溶解与基因组获取 对细胞进行溶解来获取基因组（DNA或RNA），这步骤非常关键，应尽量保证基因组的完整性。目前细胞溶解的方法可以分为3大类: 物理法、化学法和生物酶降解法。 3. 全基因组扩增 由于单个细胞中的基因含量无法达到测序仪的检测线，因此需要对基因组进行扩增，目前方法都是利用DNA 聚合酶和不同形式的引物来进行扩增的，包括特异性的、简并的或杂合的引物。 4.测序与数据分析 对单个细胞进行测序，并对所得的数据结果进行分析。 二 单细胞测序技术应用现状 单细胞测序技术能够快速确定成千上万个细胞的精确基因表

单细胞测序

单细胞测序-I 单细胞测序（single cell sequencing）被《自然-方法》（nature method）杂志评为了2013年度生物技术。2017年10月美国政府启动了以单细胞测序为基础的“人类细胞图谱计划”，这是可以与“人类基因组计划”相媲美的又一个伟大工程。 要了解单细胞测序，我们首先需要了解下何为测序？ “单细胞测序技术”是基于“第二代测序技术” 上世纪70年代末，Sanger发明了双脱氧链终止法也叫做Sanger测序法，Sanger测序法为基础的DNA测序技术我们把他称作“第一代测序技术”。“人类基因组计划”就是基于“第一代测序技术”完成的，共花费了30亿美元和耗时15年的时间。“第一代测序技术”成本高和低通量的问题，逐渐满足不了生命科学领域发展的需求。经过不断的技术开发和改进，以Illumina公司为代表的“第二代测序技术”大大降低了测序的成本并且大幅度提高了测序通量，所以也被称作“高通量测序技术”。 过去10几年“第二代测序技术”得到了快速发展，甚至突破“摩尔定律”的发展规律，如今完成一个人类的全基因组价格只需要1000美元和几个工作日。随着“第二代测序技术”的迅猛发展，使得对于每个细胞单独测序成为了可能。正是“第一代测序技术”的技术革命完成了“人类基因组计划”，同样的“第二代测序技术”掀起的技术革命正在推动着“人类细胞图谱计划”的进行。 当我们了解了“单细胞测序”就是以“二代测序技术”为基础的测序技术，那么下一步就需要了解下什么是细胞？为什么我们要进行单细胞测序？ 人体的每个细胞都是独一无二的 细胞是人体结构和功能的基本单位，每个人大约有40亿-60亿个独立的细胞。如果把一个人体全部细胞比作地球上的所有人类的话，那么我们的细胞就像地球上每个独立的个人，正如地球上的每个人都是独一无二的，人体的每个细胞也是独一无二的。人类生命最初只有一个受精卵细胞，从胚胎发育到个体成熟，人体内的细胞数量增加的同时，细胞与细胞间的差异也越来越大，即使来自同一个组织的细胞，最终有的分化成了神经元而有的细胞则变成了神经胶质细胞。单细胞测序技术就是通过测序技术获得不同细胞间的遗传信息，从基因遗传水平解开细胞与细胞间的遗传信息异质性问题。 根据上面的对介绍，我们可以对“单细胞测序技术”下一个定义：单细胞测序技术是通过“第二代测序技术”对每个单独的细胞进行测序，获取每个独立细胞的遗传信息。

转录组学主要技术与应用研究

转录组学主要技术及其应用研究 姓名：梁迪 专业：微生物学 年级：2013 学号：3130179 二零一四年六月十五日

转录学主要技术及其应用研究 摘要：转录组(transcriptome)是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合。转录组学研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。目前，转录组学研究技术主要包括两种：基于杂交技术的微阵列技术（microarray)和基于测序技术的转录组测序技术，包括表达序列标签技术（Expression Sequence Tags Technology，EST）、基因表达系列分析技术（Serial analysis of gene expression，SAGE）、大规模平行测序技术（Massively parallel signature sequencing，MPSS）、以及RNA 测序技术（RNA sequencing，RNA-seq）。文章主要介绍了以上转录组学主要研究技术的原理、技术特点及其应用，并就这些技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论，为其今后的研究与应用提供参考。 关键词：转录组学；微阵列技术；转录组测序技术；应用 Study on the main technologies of transcriptomics and their application Abstract: The transcriptome is the complete set of transcripts for certain type of cells or tissues in a specific developmental stage or physiological condition. Transcriptome analysis can provide a comprehensive understanding of molecularmechanisms involved in specific biological processes and diseases from the information on gene structure and function. Currently, transcriptomics technology mainly includes microarry -based on hybridization technology and transcriptome sequencing-based on sequencing technology, involving Expression sequence tags technology, Serial analysis of gene expression, Massively parallel signature sequencing and RNA sequencing. The detailed principles, technical characteristics and applications of the main transcriptomics technologies are reviewed here, and the challenges and application potentials of these technologies in the future are also discussed. This will present the useful information for other researchers. Keywords: transcriptomics ; microarray ; transcriptome sequencing; application 随着后基因组时代的到来，转录组学、蛋白质组学、代谢组学等各种组学技术相继出现，其中转 录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术[1]。

单细胞测序技术概览

单细胞测序技术概览 2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。 前言 2013年，单细胞测序技术（single-cell sequencing）荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中发生的突变及结构性变异，而这些突变和变异往往有着极高的突变率。有了这些信息，我们就可以描述肿瘤细胞的克隆结构，并追踪疾病的进展及扩散范围。本文将介绍2013年单细胞测序技术在人类早期发育、癌症以及神经科学研究等几个重点领域的最新应用成果。 1. 单细胞测序技术简介 本节将概述如何获得一个单细胞的基因组及转录组。 单细胞基因组及转录组测序所需要的测序样本量要比单细胞中本身所含有的基因组及转录组分子高出好多个数量级，所以这对核酸扩增技术（amplification technology）也是一大考验。面对如此微量的分子，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响。而且多重扩增又容易带来试验误差，比如基因组或转录组覆盖不均一、背景噪声以及定量不准确等问题。 最近所取得的技术进步有望部分解决上述问题，使单细胞测序技术能够走进更多的实验室，解决更多领域的科学问题。比较罕见的细胞、异质性的样本、与遗传嵌合或突变相关的表型、不能人工培养的微生物，这些都是单细胞测序技术能够一展所长的研究平台。使用单细胞测序技术能够发现克隆突变（clonal mutation）、隐藏的细胞类型，或者在大块组织样品研究工作中被―稀释‖或平均掉的转录特征。

1.1 选择恰当的细胞 说到分离单细胞，显微操作（micromanipulation）无疑是一项非常精确的技术，而且利用毛细管（microcapillary）可以直接吸取细胞内容物，但是这项操作也需要耗费大量人力。很多组织解离之后都能够制成单细胞悬液，这种单细胞悬液很容易操作，而且可以用细胞分选器（cellsorter），根据细胞表面表达的特异性分子标志物对细胞进行分类富集操作。这种策略也被用来分离非常微量的循环肿瘤细胞。 1.2 单细胞转录组策略 现在有很多单细胞RNA测序操作流程可供选择，不过不管采用何种策略，首先都需要通过逆转录反应，利用RNA合成出cDNA。然后才会有所区别，比如有一些方法是对整个转录子进行测序，有一些方法只针对转录子的5'和3'端进行测序。不论采用何种方法，目的都只有一个，那就是捕获原始的RNA分子，然后均一的、准确地对其进行扩增。核酸的捕获效率主要受到逆转录反应的影响，不过我们可以使用更小的反应体系，选择更好的逆转录酶来进行改善。另外，采用模板转换技术（template switching）也能够保证被捕获的绝大部分转录子都是全长片段。减少反应循环数也能够改善核酸扩增反应，还可以借助―抑制PCR （suppression PCR）‖技术减少引物扩增，或者将取自不同样品的cDNA（这些cDNA都是分别做好标记的）混合到一起，提高起始反应模板浓度，用体外转录技术进行线性扩增（linear amplification）。另外，还可以利用特有的分子识别序列（molecular identifier sequences）对每一个RNA分子进行标记，这样即便在经历了非均一的扩增之后，我们还是能够对原始的RNA分子数量进行绝对定量。 1.3 单细胞基因组策略 全基因组扩增（whol e-genome amplification）的起始反应产物更少，只有一个DNA分子。这样在扩增反应时就难免出现不均一的问题，即可能在基因组中某些位点会扩增多次，而另外一些位点则无法扩增。解决这个问题最常用的办法就是多重置换扩增技术（multiple displacement amplification, MDA），即使用随机引物，让这些引物与基因组广泛结合，同时使用一种特定的聚合酶，这种聚合酶能够置换与它自身附着在同一模板上的DNA链片段，形成一种反复分支结构（iterative branching structure），扩增出大段的DNA。早期循环对整个扩增反应的均一性起到了决定性作用。有一种扩增技术采用了一种独特的引物，这样能够生成闭合环状的扩增子（amplicon），而且这种扩增产物不会再进一步复制，等于是在进行PCR扩增反应之前先进行几轮线性扩增反应。将反应按比例扩大，同时对反应情况进行实时监控都有助于改善基因组扩增成功率低的问题，另外减少扩增次数，准备更少模板的测序文库也是一个比较值得发展的方向。

MALBAC单细胞全基因组测序详细解析

单细胞全基因组测序一直是生物学家梦想得到的结果。 但是其中必须解决的矛盾： 1. 线性扩增。如果用全基因组PCR扩增，因为PCR的扩增偏向性（bias），再加上PCR过程中较小的偏向性通过指数放大，其结果就会是严重的覆盖不均一，导致在许多地方只有很低的覆盖、甚至没有覆盖。所以，保证模板被线性地扩增，是首要问题。 2. 全基因组覆盖。常规的建库方法，因为补平、加A、接头连接效率的问题，起始DNA中有很大一部分会被浪费，没有形成有效文库分子（也就是两头都接好引物的DNA片段）。在单细胞测序中，这是不可接受的。 3. 高扩增效率。单细胞中的每个基因位置理论上都只有2个拷贝，而要从2个拷贝扩增到足够建立文库的DNA量，要经过许多次的扩增。这就需要很高的扩增效率。而一般的线性扩增很难有好的扩增效率 谢晓亮教授创新的MALBAC方法（multiple annealing andlooping-based amplification cycles），一举解决了上述3个问题，达到：1. 线性扩增，2. 近乎全覆盖，3. 高扩增效率（高产量），并且最终可以用于检测单细胞的CNV。 原理： 1. 第一步 A. 用5’端有27个统一序列，而3’端是8个随机序列的引物，作为扩增引物。用随机引物保证可以在模板链上的各处随机结合 B. 0℃淬火，再65℃等温扩增，得到第一轮的复制的产物 a. n个扩增产物（在图中标成蓝色），这些扩增产物都有在5’端有一个统一的引物 b. 1个原来的模板（在图中标成黑色） C. 用有前链移开功能的聚合酶（?29聚合酶）来进行扩增，这种酶的特点是会把酶前行方向上的前链从原来的模板链上进行解链、移开。利用这种特点，可以让模板上的每个点在第一轮反应中，都有机会得到n个拷贝 D.巧妙之处： a. 0℃淬火，在延伸开始之前，就把n个引物杂交到模板上 b. ?29聚合酶可以把前面的链给推开，结合前面的淬火步骤，一次复制出n个扩增子 2. 第2轮起的m轮扩增

转录组测序技术的应用及发展综述

转录组测序技术的应用及发展综述 摘要：转录组测序（RNA-Seq）作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。RNA-Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA 反转录而成cDNA文库进行测序，通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表达量，发现新的转录本；如果有基因组参考序列，可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息，已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。文章主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA-Seq的研究平台，着重介绍RNA-Seq的原理、用途、步骤和生物信息学分析，并就RNA-Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论及在相关领域的应用等内容，为今后该技术的研究与应用提供参考。 关键词: RNA-Seq；原理应用；方法；挑战；发展前景 Abstract：Transcriptome sequencing (RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome. RNA-Seq to use high-throughput sequencing of tissues or cells of all RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced, through statistical correlation read paragraph (reads) numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence, the transcripts mapped to genomic, determine the position of the transcription shear condition, more genetic information, has been widely used in biological research, medical research, clinical research and drug development. This paper compared several methods of platform transcriptome studies and several kinds of RNA-Seq in recent years, RNA-Seq focuses on the principle, purpose, steps and bioinformatics analysis, and discusses the RNA-Seq technology challenges and future development prospect and the application in related field and other content, provide the reference for the research and application of the technology future. Key word：RNA-Seq ;application; principle; method; challenge; development prospects

单细胞测序技术

单细胞测序技术： 单细胞测序技术自2009年问世，2013年被Nature Methods 评为年度技术以来，越来越多地被应用在科研领域。 2015年以来，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现，彻底降低了单细胞测序的成本门槛。 自此，单细胞测序技术被广泛应用于基础科研和临床研究。单细胞在许多领域都占有一席之地，对于癌症早期的诊断、追踪以及个体化治疗具有重要意义。 1 为什么要做单细胞测序？ 初次听说单细胞测序技术，单细胞测序又是什么噱头？如果单细胞测序就能测一个细胞或几个细胞的话，这有什么意义？特别是对异质性高的肿瘤组织来讲，测一个细胞能代表什么？ 无论是蠕虫，蓝鲸，还是人类，自然界所有的多细胞生命都是从单个细胞发育而来开始。 这样一个单细胞，鬼斧神工地构建出有机生命体所需的各种组织、器官、系统。每个新细胞在正确的时间，在正确的地方分裂、分化，并与相邻细胞协调精准发挥功能。 多细胞生命的发育过程，是自然界中最引人注目的壮举之一。尽管经过数十年的研究，生物学家仍然无法完全理解这一过程。 2018年4月26日，Science杂志发表三篇超重磅研究，来自哈佛医学院和哈佛大学的研究人员使用多种技术组合，包括对发育中

斑马鱼和青蛙胚胎数千个单细胞的基因测序，以精确的方式跟踪和描绘了组织和整个机体从单细胞发育的完整历程。 哈佛大学分子和细胞生物学教授Alexander Schier表示，“这几乎就像通过几颗星星看到了整个宇宙。” 使用单细胞测序技术，研究团队在胚胎发育的最初24小时内追踪单个细胞的命运，揭示出单个细胞基因开启或关闭的综合景观，以及胚胎细胞何时何地转变为新的细胞状态和类型。 这些发现就好比是勾勒出胚胎发育过程中产生不同细胞类型的遗传“配方”目录，为发育生物学的深入研究和疾病的认识，提供了前所未有的资源。 图|斑马鱼受精卵在4、6、8、10......小时（hpf）时的发育过程中不同器官细胞形成，最中心的深蓝色为受精卵，以时间为单位向外辐射。 “通过单细胞测序，我们可以在一天的时间里概括数十年来对细胞在生命早期阶段分化的艰苦研究。”哈佛医学院系统生物学助理教授Allon Klein表示，“通过我们开发的方法，我们正在绘制我们认为发育生物学的未来，发育生物学将会转变为定量的、大数据驱动的科学。” Alexander Schier表示，除了对生命早期阶段有所了解之外，这项工作还可以为大量疾病的新认识打开大门。“我们预见，任何复杂的生物学过程，只要是细胞随时间改变了基因表达，都可以使用这种方法重建，不仅仅是发育中的胚胎，还有癌症发生或大脑退化。”

华大转录组测序内部培训资料

（内部资料，请勿外传） 动植物转录组 （Transcriptome ） 产品说明书 科技服务体系 动植物研究方向

版本信息： 2011年07月08日

目录 1产品概述 (1) 1.1 什么是转录组测序 (1) 1.2 转录组测序的产品功能 (1) 1.3 转录组测序产品优势 (1) 1.4 转录组测序产品发展史 (1) 1.5 项目执行时间 (3) 1.6 产品交付结果 (3) 2转录组测序研究方法 (4) 2.1 产品策略 (4) 2.2 样品准备 (5) 2.2.1 RNA样品要求 (5) 2.2.2 RNA样品送样标准 (6) 2.2.3 RNA提取的组织用量建议 (6) 2.3 样品运输要求 (7) 2.3.1 样品包装 (7) 2.3.2 样品标识 (8) 2.3.3 样品运输条件 (8) 2.4 文库的构建及测序 (9) 2.4.1 实验流程 (9) 2.4.2 测序及数据处理 (10) 2.5 转录组生物信息学分析 (10) 2.5.1 没有参考序列的转录组De novo (10) 2.5.2 有参考序列的转录组Re-sequencing (18) 2.5.3 参考文献 (24) 3成功案例 (25)

3.1 华大成功案例 (25) 3.2 相关文献解读 (26)

1产品概述 1.1什么是转录组测序？ 转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。转录组测序是指用新一代高通量测序技术对物种或者组织的转录本进行测序并得到相关的转录本信息。 1.2转录组测序的产品功能 1.获得物种或者组织的转录本信息； 2.得到转录本上基因的相关信息，如：基因结构，功能等； 3.发现新的基因； 4.基因结构优化； 5.发现可变剪切； 6.发现基因融合； 7.基因表达差异分析。 1.3转录组测序产品优势 覆盖度高：检测信号是数字信号，几乎覆盖所有转录本； 检测精度高：几十到数十万个拷贝精确计数； 分辨率高：可以检测到单碱基差异，基因家族中相似基因及可变剪切造成的不同转录本的表达； 完成速度快：整个项目周期只需要50个工作日时间； 成本低：基本上每个实验室可以承担相关研究经费。 1.4转录组测序产品发展史 转录组的研究手段大体包括：EST序列构建及研究，芯片研究，运用第二代测序技术研究等。EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次sanger测序获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在

20170301CTC单细胞mRNA测序技术路线

CTC单细胞mRNA测序技术路线 从这里之后的数据分析部分都没有哦~ 单细胞转录组mRNA测序 一、技术简介 单细胞转录组是指某个细胞在某一生理功能状态下所有转录的mRNA产物的集合，是基因组遗传信息传递和表达的重要步骤和过程。 单细胞转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一单个细胞在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。 转录组测序针对的是有参考基因组的物种。与参考基因组比较，可以得到基因表达差异、可变剪接、融合基因等遗传调控信息。 二、MALBAC技术 1.运用Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC多重退火环状循环 扩增技术，精确反转录某一单个细胞在某一状态下的几乎所有转录本序列信息mRNA并进行扩增。 解决了扩增对微量初始模板过大的扩增偏移，使得单细胞中90%的基因组能够被测序，样品起始量可低至0.5pg； 2.无物种的限定；要求mRNA有Poly A尾结构，GC％为35％-65％。 3.分辨率高：单碱基分辨率； 4.覆盖度高：能覆盖到几乎所有转录本片段序列；

5.检测范围广：从几个到数十万个拷贝精确计数，可同时鉴定及定量正常和稀有转录本； 三、技术参数 1.样品要求 样品类型：已分离的单细胞样本或去蛋白并进行DNase处理后的完整Total RNA； 样品需求量（单次）：使用MALBAC进行微量扩增，样品建议为单细胞或总量≥10pg，最低起始量≥0.5pg； 2.测序策略 PE151。 推荐数据量 6G clean data以上。 3.项目执行周期 每个样品数据量6G以下，样品量小于10个，标准流程的执行周期约为50 个工作日； 样品数量多于10个时，项目的执行周期需根据项目的规模而定。 4.项目合格指标 产生不低于合同规定的clean data。 四、主要技术流程 单细胞裂解-MALBAC扩增-文库构建-高通量测序-数据处理-生物信息分析 五、信息分析 标准信息分析： 1.对原始数据去除接头序列、污染序列及低质量reads； 2.测序数据统计； 3.对于有参考基因组的转录组分析，须明确具体物种，因为即使有参考，很多物种SNP或Indel等注 释信息也不像人的那么全、那么规范。生物信息部需确定特定物种的某些分析是否可做。 单细胞转录组建库其实是：单细胞转录组扩增+基因组建库（扩增后产物是DNA）。单细胞不能做链特异性转录组测序。

单细胞测序

第一章单细胞测序技术概览 摘要: 2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。前言2013年，单细胞测序技术（single-cell sequencing） 荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中... 2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。 前言 2013年，单细胞测序技术（single-cell sequencing）荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中发生的突变及结构性变异，而这些突变和变异往往有着极高的突变率。有了这些信息，我们就可以描述肿瘤细胞的克隆结构，并追踪疾病的进展及扩散范围。本文将介绍2013年单细胞测序技术在人类早期发育、癌症以及神经科学研究等几个重点领域的最新应用成果。 1. 单细胞测序技术简介 本节将概述如何获得一个单细胞的基因组及转录组。 单细胞基因组及转录组测序所需要的测序样本量要比单细胞中本身所含有的基因组及转录组分子高出好多个数量级，所以这对核酸扩增技术（amplification technology）也是一大考验。面对如此微量的分子，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响。而且多重扩增又容易带来试验误差，比如基因组或转录组覆盖不均一、背景噪声以及定量不准确等问题。 最近所取得的技术进步有望部分解决上述问题，使单细胞测序技术能够走进更多的实验室，解决更多领域的科学问题。比较罕见的细胞、异质性的样本、与遗传嵌合或突变相关的表型、不能人工培养的微生物，这些都是单细胞测序技术能够一展所长的研究平台。使用单细胞测序技术能够发现克隆突变（clonal mutation）、隐藏的细胞类型，或者在大块组织样品研究工作中被―稀释‖或平均掉的转录特征。 1.1 选择恰当的细胞 说到分离单细胞，显微操作（micromanipulation）无疑是一项非常精确的技术，而且利用

单细胞测序技术大比拼

单细胞测序技术大PK 随着“人类细胞图谱”计划的开展，单细胞测序技术已经进入2.0时代，尤其，基于微液滴或者微流控芯片技术的高通量单细胞分选平台的出现，引领生命科学研究进入单细胞生物学时代。 目前，国内外以及各种文献报道的单细胞测序技术让人眼花缭乱，不知该如何选择。其实，国内外大规模单细胞技术的平台主要有C1?单细胞全自动制备系统、ICELL8 Single-Cell System、Illumina?Bio-Rad?Single-Cell Sequencing Solution、BD Rhapsody? S ingle-Cell Analysis System和10X Chromium Single Cell Gene Expression Solution这五种，接下来小编就带你一一了解下： 10X GENOMICS技术简介 ChromiumTM Single Cell 3′Solution是基于10 X Genomics平台，能够一次性分离、并标记500–10000个单细胞，并能在单细胞水平进行检测的技术，其通过微流控系统，将单细胞或长片段DNA分子快速分配到油包水的微反应体系中，每个微反应体系中的单DNA 分子会获得唯一的特异性分子标签，制备生成的测序文库可以在illumina平台进行测序，并由10x Genomics提供数据分析及可视化软件，测序实验及分析流程可以和illumina系统无缝衔接。 10×genomics技术一次可以同时得到大量大细胞数据，但只能得到mRNA信息，LncRNA 大部分信息丢失，UMI技术能很好去除认为分析引入duplication及PCR引入SNP位点。同样对RNA质量要求高，降解同样会引起5’端信息丢失。 10X GENOMICS单细胞转录组测序优缺点 10x Genomics单细胞转录组测序优点 1、简单便捷：集单细胞分选、扩增、建库于一体；

单细胞全基因组测序

单细胞全基因组测序 单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。 从方法学角度来看，获得高覆盖率高保真性的全基因组扩增产物是准确全面的测序结果的保障。多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)利用随机引物和等温扩增可以获得高保真的DNA大片段，但该方法的主要缺陷在于非平衡的基因组覆盖率、扩增偏倚、嵌合序列及非特异扩增等[1]。尽管各种改进的策略正在逐步减少这些缺陷，高覆盖率、高保真性及高特异性的扩增仍然是亟待解决的问题。另外，还有科研人员利用DOP-PCR进行全基因组扩增(whole-genome amplification，WGA)及DNA测序对单个乳腺癌细胞进行了拷贝数变异的分析，进而推断出细胞的群体结构和肿瘤的进化过程。但是由于该方法的基因覆盖率较低，而且不能在单个核苷酸的分辨率上评价单个肿瘤细胞的遗传学特征，故并不能检测在肿瘤发展过程中发挥重要作用的单个核苷酸的改变。2012年，哈佛大学谢晓亮院士在《Science》发表了单细胞全基因组扩增新技术MALBAC（Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles，简称MALBAC），即多次退火环状循环扩增技术[2][3]。不同于以往的非线性或指数型扩增方法，MALBAC技术利用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而很大程度上防止了DNA的指数性扩增，从而解决了基因组扩增对微量初始模板过大的扩增偏倚，并使基因组测序的模板需求量从μg级降至单细胞水平。MALBAC技术原理如下： 图1：MALBAC技术原理

生物信息学分析方法

核酸和蛋白质序列分析 蛋白质, 核酸, 序列 关键词：核酸序列蛋白质序列分析软 件 在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信息，从而指导进一步的实验研究。通过染色体定位分析、内含子／外显子分析、ORF分析、表达谱分析等，能够阐明基因的基本信息。通过启动子预测、CpG岛分析和转录因子分析等，识别调控区的顺式作用元件，可以为基因的调控研究提供基础。通过蛋白质基本性质分析，疏水性分析，跨膜区预测，信号肽预测，亚细胞定位预测，抗原性位点预测，可以对基因编码蛋白的性质作出初步判断和预测。尤其通过疏水性分析和跨膜区预测可以预测基因是否为膜蛋白，这对确定实验研究方向有重要的参考意义。此外，通过相似性搜索、功能位点分析、结构分析、查询基因表达谱聚簇数据库、基因敲除数据库、基因组上下游邻居等，尽量挖掘网络数据库中的信息，可以对基因功能作出推论。上述技术路线可为其它类似分子的生物信息学分析提供借鉴。本路线图及推荐网址已建立超级链接，放在北京大学人类疾病基因研究中心网站（https://www.wendangku.net/doc/9a5046984.html,/science/bioinfomatics.htm）,可以直接点击进入检索网站。 下面介绍其中一些基本分析。值得注意的是，在对序列进行分析时，首先应当明确序列的性质,是mRNA序列还是基因组序列？是计算机拼接得到还是经过PCR扩增测序得到？是原核生物还是真核生物？这些决定了分析方法的选择和分析结果的解释。 （一）核酸序列分析 1、双序列比对（pairwise alignment） 双序列比对是指比较两条序列的相似性和寻找相似碱基及氨基酸的对应位置，它是用计算机进行序列分析的强大工具，分为全局比对和局部比对两类，各以Needleman-Wunsch 算法和Smith-Waterman算法为代表。由于这些算法都是启发式（heuristic）的算法，因此并没有最优值。根据比对的需要，选用适当的比对工具，在比对时适当调整空格罚分（gap penalty）和空格延伸罚分（gap extension penalty），以获得更优的比对。 除了利用BLAST、FASTA等局部比对工具进行序列对数据库的搜索外，我们还推荐使用EMBOSS软件包中的Needle软件（http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/），和Pairwise BLAST （https://www.wendangku.net/doc/9a5046984.html,/BLAST/）。以上介绍的这些双序列比对工具的使用都比较简单，一般输入所比较的序列即可。 （1）BLAST和FASTA FASTA（https://www.wendangku.net/doc/9a5046984.html,/fasta33/）和BLAST （https://www.wendangku.net/doc/9a5046984.html,/BLAST/）是目前运用较为广泛的相似性搜索工具。这两

单细胞测序技术大比拼

单细胞测序技术大ＰＫ随着“人类细胞图谱”计划得开展，单细胞测序技术已经进入2、0时代，尤其,基于微液滴或者微流控芯片技术得高通量单细胞分选平台得出现，引领生命科学研究进入单细胞生物学时代。 目前,国内外以及各种文献报道得单细胞测序技术让人眼花缭乱,不知该如何选择。其实，国内外大规模单细胞技术得平台主要有C１?单细胞全自动制备系统、ICＥLL8 Singｌe—CelｌSysｔem、Ｉｌlumｉｎａ?Bio-Rａd?Sｉｎgｌｅ-Ceｌl Ｓeｑuencing Ｓｏluｔiｏｎ、ＢD Rhapｓody? S ingle—Cell AｎalysiｓSysｔem与10X Chrｏmiｕm Sｉngle Ceｌl Ｇｅｎe Ｅｘpｒession Soｌuｔioｎ这五种，接下来小编就带您一一了解下: 10X GENOMＩCS技术简介 CｈrｏmiumTM Singｌe Cｅll ３′Ｓolution就是基于10 X Genｏmicｓ平台,能够一次性分离、并标记50０–１0000个单细胞,并能在单细胞水平进行检测得技术,其通过微流控系统,将单细胞或长片段DNA分子快速分配到油包水得微反应体系中，每个微反应体系中得单DNA分子会获得唯一得特异性分子标签,制备生成得测序文库可以在illumina平台进行测序，并由10x Genomｉｃs提供数据分析及可视化软件,测序实验及分析流程可以与illuｍina系统无缝衔接。 1０×gｅnomｉcs技术一次可以同时得到大量大细胞数据，但只能得到ｍRＮＡ信息，LncRNA大部分信息丢失,UMI技术能很好去除认为分析引入duplicａtioｎ及PCR引入ＳＮP 位点。同样对RＮA质量要求高,降解同样会引起５'端信息丢失. 10X GEＮOＭＩCS单细胞转录组测序优缺点 10ｘGenｏｍｉcｓ单细胞转录组测序优点 1、简单便捷:集单细胞分选、扩增、建库于一体; 2、细胞通量高:每个样本细胞数可达5０0—10000个;

单细胞测序技术

单细胞测序技术 全自动实验室样品处理工作平台Biomek? 4000真正实现了操作管理的智能化、流程设计的模块化、台面布局的灵活性和操作界面的图形化；其功能强大，简单高效，实验结果精确可靠，使科研人员脱离了繁杂的实验操作；标准化的实验流程的建立减少了人为误差，不断升级的实验操作和应用使得现在和将来的多种实验应用成为可能。Biomek? 4000基于模块化设计，您可以根据不断变化的实验需求变换台面布局；可更换的台面布局、不断升级的实验操作和应用使得现在和将来的多种实验应用成为可能。其Biomek软件的操作界面直观、简单，无论您是自动化的初次使用者，还是经验丰富的专家，建立、编辑或者运行自动化程序都毫不费力。 Biomek? 4000自动化液体处理工作站真正实现了操作管理的智能化、流程设计的模块化、台面布局的灵活性和操作界面的图形化，功能强大，简单高效，实验结果精确可靠，使科研人员脱离了繁杂的实验操作，建立标准化的实验流程，将更多的精力投入到实验方案的设计：Biomek? 4000基于模块化设计，您可以根据不断变化的实验需求变换台面布局；可更换的台面布局、不断升级的实验操作和应用使得现在和将来的多种实验应用成为可能。其Biomek软件的操作界面直观、简单，无论您是自动化的初次使用者，还是经验丰富的专家，建立、编辑或者运行自动化程序都毫不费力。

Biomek? 4000实验室自动化工作站可轻松精准地完成移液、梯度稀释、分液以及合并液体等液体处理工作，满足客户不断变化的需求，被广泛应用于生物工程、DNA质粒纯化、药物筛选、ELISA反应、PCR前处理、DNA测序处理、临床检验样品处理及血站系统高通量样品分析工作。其自动化的操作过程可有效减少人为操作的误差，提高实验的重复性，降低液体处理等工作中的样品处理成本，满足广大客户目前和将来科研的广泛需求。

转录组测序RNA-seq技术转录组是某个物种或者特定细胞类型产生

转录组测序（RNA-seq）技术 转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。 技术优势： 数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。 高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。 任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。 更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。 应用领域：转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。 图1 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异