果蝇的保种技巧

２００５年８月第４期

果蝇的保种技巧

赵素然

（南开大学生命科学学院天津３０００７１）

摘要：果蝇属于昆虫纲双翅目果蝇，常称黑腹果蝇。果蝇具有生长快繁殖力强和饲养简便等特点。因而是遗传实验的良好材料。但如何饲养好果蝇确实是实验中经常遇到的一个问题。

本文介绍了果蝇常年保种过程中容易出现的几个问题和相关的处理方法。

关键词：果蝇；保种；遗传

最早对果蝇作出书面描述的是亚里士多德，他曾提到有一种从黏液中产生的小昆虫。最常用的黑腹果蝇（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇｓｔｅｒ）最早起源于东南亚，在１８７１年前后，附着在一串香蕉上来到了美国。昆虫学家伍德沃斯（ｃ。ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ）首先在实验室饲养了果蝇，卡斯尔（Ｃａｓｎｅ）教授认识到这种果蝇的优点之后，便把它介绍给了摩尔根（Ｔ．Ｍｍｏｒｇａｎ）。摩尔根既不是第一个发现果蝇的人，也不是第一个在实验室饲养果蝇的人，但他却非常有效地研究了这种生物，取得了辉煌的成就，所以有人说：“果蝇是上帝为摩尔根创造的。”

以果蝇为实验材料，摩尔根首先证明了基因在染色体上，证明了染色体是基因的物质载体。后来，摩尔根等人又发现有几个基因位于ｘ染色体上。由此，摩尔根揭示了遗传学的又一基本规律——连锁规律。这为此后研究基因的结构和功能奠定了理论基础，是遗传学历史上的一个里程碑。摩尔根也因此获得了１９３３年的诺贝尔奖。

遗传学基础实验课多年来一直以果蝇为实验材料开设果蝇杂交实验和果蝇唾腺巨大染色体实验。所以如何保种是一个很重要的事情。

１．果蝇作为实验材料的优点

遗传学是一门实验性科学，随着遗传学的发展，遗传学所采用的实验材料也是不断发展的，从孟德尔所采用的豌豆，到摩尔根时期的果蝇，到分子遗传学中普遍采用的微生物。这在一定程度上体现了学科的发展和进步。为什麽有许多人对小小的果蝇如此钟情呢？让我们看一看果蝇作为实验材料有那些优点：

①取材方便。在水果上，果园里经常可以看到。但是有一点值得注意：果蝇的英文名叫ｆｍｉｔ—ｎｙ，但它并不是以水果为食的，而是以生长在腐败水果上的酵母菌为主要食物。

②饲养简便。凡是在实验室能发酵的基质，都可以作为培养果蝇的培养基。我们的实验采用的“玉米培养基”不过是很普通的材料。另一方面，培养果蝇所需的场地和设备也很简单，不过是几个试管和一个培养箱罢了。

③生活周期短，繁殖快。在最适宜条件下，果蝇只需１０天就可以完成整个生活史。

④繁殖率高。雌性果蝇的生殖器官有受精囊，可保留交配所得的大量精子，能产生大量的受精卵，故繁殖力很强。

⑤染色体数目少，只有四对。而且双翅目昆虫幼虫的唾腺染色体具有多线化的特点，是细胞遗传学的好材料。

⑥在群体中突变性状很多。

２．果蝇的保种技巧

果蝇生活周期的长短与气温的关系密切。低温会造成生活周期延长和生活力降低。３０℃以上的高温将造成果蝇的不孕和死亡。果蝇的最适培养温度为２０—２５℃之间。果蝇的保种培养是进行各种实验的基础，虽然果蝇有易于饲养管理的优点，但由于其生物个体较小，所以略有疏忽就有可能造成实验失败，甚至导致绝种，由此不难看出果蝇的常年保种确有一定的难度。

２．１．果蝇保种的常规技术

①果蝇的饲料：常用的培养基有：玉米培养基；香蕉培养基和米粉培养基。不同材料不尽相同，经多年实验经验，摸索出一个能使果蝇生长良好，材料易得易于配制的培养基配方为：玉米粉８．４５９、蔗糖６．２９、琼脂Ｏ．６２９、丙酸Ｏ．５ｍ１、酵母粉

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Ｏ．７９、蒸馏水１００ｍ１。

②配制方法：１／２水调和玉米粉，１／２水煮溶琼脂。待琼脂全溶后加入蔗糖煮沸；加入玉米粉溶液煮沸；加入丙酸立即从火上取下并搅拌；待温度降至４０—５０℃时加入酵母粉搅拌均匀。选用８０ｍｊ广口培养瓶，装入３０ｍｌ煮制好的培养基，接种５～１０对果蝇，然后进行保种培养，待培养基消耗８０％左右时，按上述方法重新转接新的培养瓶，继续培养，常年不断。

③培养瓶的消毒：常用的培养瓶有大中型试管．在分装配制好的培养基之前需先经过７５％乙醇消毒，然后倒人培养基，待培养基冷却凝结后，用酒精棉球擦拭培养瓶壁，目的是除去沾污在瓶壁上的培养基及水珠。

２．２．保种培养中的几个关键环节

保种培养过程中有几个关键陛的环节，如若掌握不好，将不能使果蝇正常生长，甚至导致部分或全部死亡，因此应特别注意。

①染菌处理：实验用具及操作过程应尽量作到无菌，以防止杂菌污染。实际操作中主要体现在以下几个方面：ａ．培养瓶灭菌，方法是高压锅ｌ磅２０’或１２０℃干热２ｈ；ｂ．抑菌，培养基中加入适量丙酸能起到抑菌作用；ｃ．无菌操作，接种时，最好在超净工作台上进行，如条件不具备，可将工作的台面、地面等擦拭干净并保持湿润，可最大限度地避免杂菌感染。因此，防止染菌是十分重要的，在新的种瓶中幼虫未孵化出之前不能将原种瓶废除。

②培养温度：果蝇的培养温度要以实验性质而定，在杂交实验及快速培养时应在２３—２５℃的适温下培养，而保种则应在１８～２０℃下培养，以免培养基消耗过快而减少转接次数。

③加酵母粉的时机：酵母粉为活性物质，遇高温将失去活性，所以应待培养基冷却至４５—５０℃时加入并搅匀。温度过低时加入，虽然不影响活性，但又可能搅拌不匀。也可以于转接果蝇前将适量的酵母粉均匀撒入配制好的培养瓶中。

④经常观察并及时转接新瓶：培养过程中可能会出现一些问题（诸如培养基过干、过湿、杂菌污染等）所以应经常观察及时发现并做相应的补救处理。由于培养箱失控造成温度过高或过低的情况也时有发生，据此也应经常观察。即便能正常生长的也应适时转接新瓶，以免营养缺乏。在１８—２０℃时一般２０一３０天转接一次新瓶。

⑤在做新的原种培养时，应首先检查一下果蝇有无混杂，以防止原种丢失之危险。而且每一种培．一７０一

养至少要有二套。在瓶壁上贴上标签注明原种的突变性状和转移日期。

３．常见问题的处理

果蝇生长过程出现的问题主要有以下几种：

①培养基过干：此种情况下成蝇不能产卵，亦无法获取应有的营养。可以用无菌水溶解适量的酵母粉，用无菌长针头或细长滴管加入培养瓶中，使干培养基湿透为度。

②培养基过湿：由于受果蝇代谢废物的影响，有的培养基时间稍长便会呈稀糊状，倾斜可倒出。遇此种情况可插入无菌的吸水纸片加以解决，并同时给三龄幼虫提供化蛹场所。

③培养基出现断层：当酵母粉用量过大时，会使培养基发酵过快，产气过多，当下层气体不能溢出时，便将培养基从中间顶开，严重时可使培养基上升至棉塞而将果蝇挤死。原因是由于不同厂家出售酵母粉的活性不同，解决方法是用不同浓度酵母粉配制培养基，以找出酵母粉的最佳用量。

④棉塞感染霉菌：当长时间在培养箱中培养而不能正常通风时，由于成蝇和幼虫的攀爬棉塞变的潮湿，容易滋生霉菌，应经常打开培养箱观察，同时起到通风作用。若棉塞已感染上霉菌，在有备用种瓶时可淘汰掉，如无备用的可迅速将瓶内果蝇转入新瓶，转接前将原瓶瓶口用酒精棉球消毒。

⑤假如培养基已发霉，在早期可采用挑除菌落的办法，如果到了不可挽救的地步，那麽只好将果蝇移出。但不可将果蝇直接放入新的培养瓶中，应先将果蝇引入盛有１％丙酸水的指管中淋浴，然后再迁入新的培养瓶中。

４．小结

我们常年在基础实验课的摸索中总结出上述果蝇的保种技巧。为实验课的顺利进行奠定了良好的基础，也为其他院校提供了原种和保种的技巧。看起来很简单的一件事，但作为一名实验技术人员必须要有科学的认真的态度，也能在平凡的岗位上为科学实验作出一定的贡献。

（收稿日期：２００５，０ｌ，１３）

参考文献：

［１］刘祖洞、江绍慧．遗传学实验．高等教育出版社，１９８８．

［２］刘植义、刘彭昌、周希澄等．遗传学．高等教育出版社，１９８８［３］郝水．细胞生物学教程．高等教育出版社，１９８４．

作者简介：赵素然，女，南开大学生命科学学院细胞与遗传学实验室工程师。

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果蝇的保种技巧

作者：赵素然， ZHAO Su-ran

作者单位：南开大学生命科学学院,天津,300071

刊名：

实验室科学

英文刊名：LABORATORY SCIENCE

年，卷(期)：2005，""(4)

被引用次数：0次

参考文献(3条)

1.刘祖洞.江绍慧遗传学实验 1988

2.刘植义.刘彭昌.周希澄遗传学 1988

3.郝水细胞生物学教程 1984

相似文献(5条)

1.期刊论文王转斌果蝇的保种技巧及唾液腺染色体的制备-实验技术与管理2002,19(3)

介绍了果蝇常年保种过程中容易出现的几个问题和相关的处理方法以及制备清晰的果蝇唾液腺染色体的几个关键性步骤.

2.期刊论文王转斌.WANG Zhuanbin果蝇复壮初探与保种技巧-济宁学院学报2009,30(6)

探讨了跨地域引进野生型黑腹果蝇复壮原保种果蝇的方法与保种技巧.果蝇保种过程中.常年多代近亲繁殖品质已退化明显,通过跨地域引种与原种杂交,结合后代选优,以期改良原种品质.实验结果表明所选后代较原保种果蝇世代周期缩短、繁殖力明显提高.同时就果蝇的保种技巧做了进一步探讨. 3.期刊论文王彩丽实验用果蝇饲养及保种注意事项-生物学通报2009,44(11)

果蝇(Drosophila melanogaste,2n=8)为完全变态的双翅目昆虫,具有生活史短、突变型多、染色体数目少、繁殖率高等突出特点,是遗传学教学中不可缺少的实验材料,也是遗传学研究中经典的模式生物材料.因此,饲养好果蝇对遗传学教学和科学研究有着重要的意义.现将本实验室饲养果蝇和保种方法总结如下.

4.期刊论文龚慧明果蝇培养基长霉的处理措施-生物学教学2007,32(4)

果蝇是常用的遗传学实验材料.在果蝇的培养和保种过程中,常会出现培养基长霉现象,培养基一旦长霉后,不仅影响果蝇生长,而且将身上沾满了霉菌孢子的果蝇接种到新的培养基中,会污染新的培养基.

5.学位论文赵敏家蚕性别决定相关基因Bmhrp28和BmPSI的功能研究2009

性别决定是生物界基本的科学问题之一。家蚕属于鳞翅目昆虫，其性别决定机制与目前研究的最为清楚的模式昆虫果蝇相比，既有共同性，也有特殊性，因此家蚕性别决定机制的研究可为我们更好地理解昆虫性别决定提供一个新的模式。另外，其研究在产业上也具有重要的应用价值。家蚕泌丝结茧，具有很高的经济价值。家蚕为雌雄异体，而雄蚕的经济价值显著高于雌蚕。雄茧的平均出丝率要比雌茧高，并且雄蚕体质强健、好养、饲料效率高、茧丝品质好。因此，家蚕性别决定研究一直是蚕业的重要课题。本研究利用家蚕的全基因组序列、表达序列标签(ESTs)数据以及基因芯片数据，对Bmhrp28和BmPSI进行了克隆和分析。同时采用了RT—PCR、原核表达、RNAi、酵母双杂交、免疫共沉淀等技术对Bmhrp28和BmPSI的功能进行了研究。主要研究内容及结果如下：

⑴根据文献报道与GenBank登录的Bmhrp28和BmPSI的基因序列，设计引物，进行克隆，经酶切和测序验证获得两个基因包括完整ORF序列的阳性克隆。在基因结构上，Bmhrp28的ORF长为771 bp，编码256个氨基酸残基，预测其蛋白质分子量为28.2 kD，等电点为8.72，位于第21号染色体nscaf3044上，含有7个外显子、6个内含子。而BmPSI的ORF长为2112bp，编码703个氨基酸残基，预测其蛋白质分子量为76.4 kD，等电点为6.07，位于第20号染色体

nscaf2789上，含有14个外显子、13个内含子。两个基因的外显子、内含子边界处均符合GT—AG规则。蛋白质结构域分析显示，Bmhrp28和BmPSI所编码蛋白均为RNA结合蛋白。Bmhrp28含有两个RRM结构域，BmPSI含有四个KH结构域和A、B两个功能域。RRM和KH结构域均为RNA结合的区域，此结构域在RNA的选择性剪接、加工、转录等过程中发挥作用。Bmhrp28和BmPSI蛋白质结构域部分与果蝇同源基因hrp48和PSI的结构域部分相似性较高，在果蝇中hrp48和PSI作为调控因子参与P元件转座酶的选择性剪接。利用家蚕ESTs数据、全基因组芯片数据以及半定量RT—PCR方法进行了表达谱分析。ESTs数据分析结果显示，Bmhrp28和BmPSI均具有EST证据。在家蚕卵巢细胞、胚胎、卵巢等组织器官中找到Bmhrp28的EST证据。在家蚕精巢、卵巢、丝腺、胚胎等组织器官中则具有BmPSI的EST证据。

⑵为了进一步研究基因功能，我们将Bmhrp28和BmPSI分别连入经改造的p28和pET—MBP表达载体进行原核表达。将构建好的重组表达质粒命名为

Bmhrp28/p28和BmPSI/pET—MBP，并将其分别转化到BL21(DE3)表达菌株和Rosetta(DE3)表达菌株。通过IPTG诱导表达，分别得到了分子量约为31 kD和120 kD的重组蛋白，目的蛋白分子量约为28.2 kD和76.4 kD，加上6×His标签序列和MBP标签序列，大小约为31 kD和120 kD，与预测分子量相吻合。经蛋白组分鉴定发现，诱导表达的两个重组蛋白均主要以可溶形式表达。通过亲和层析和电洗脱的方法分别纯化原核表达的BmHRP28和BmPSI蛋白，将纯化的蛋白免疫成年健康公兔，制备多克隆抗体。利用western blotting分析表明，BmHRP28和BmPSI的抗体是由其蛋白作为抗原而产生的，可以用做后续实验。

⑶采用体外合成短链siRNA介导RNAi的方式，利用家蚕限性白卵早期胚胎(雄)为材料，在产卵后48 h进行显微注射，后让其继续发育到96 h进行荧光定量PCR检测在干扰Bmdsx上游基因Bmhrp28和BmPSI后，Bmdsx下游基因PBP、SP1和Vg的表达差异，进而对Bmhrp28和BmPSI在家蚕性别决定中的功能进行研究。研究结果显示，干扰BmPSI，下游基因PBP表达量降低，SP1和Vg表达量增加，暗示BmPSI作为Bmdsx上游调控因子在家蚕性别决定路径中具有重要作用。而干扰Bmhrp28，下游基因PBP表达量虽然也有所降低，但SP1和Vg的表达量并未增加。我们推测Bmhrp28作为Bmdsx的上游调控因子虽然同样参与了家蚕性别决定路径，但是功能可能弱于BmPSI。

⑷为确定Bmhrp28与BmPSI的相互关系，采用酵母双杂交和免疫共沉淀的方法进行研究。首先利用酵母双杂交技术，在无自激活的前提下，将待检测的目标基因共转酵母，通过检测三个报告基因(HIS3、URA3、LacZ)是否表达从而确定目标基因之间的相互关系。本研究中，首先将Bmhrp28连入pPC86载体(AD)，BmPSI连入pDBLeu载体(BD)。在检测无自激活后，将pPC86—Bmhrp28和pDBLeu—BmPSI共转酵母。结果显示，在SC/—Leu—Trp—His+3—AT平板与SC/—Leu—Trp—ura平板上均无可生长的阳性克隆，在LacZ膜检中无显蓝色的阳性结果，即HIS3、URA3、LacZ三个报告基因均未检测到表达。由此可见Bmhrp28与BmPSI之间没有直接相互作用或者相互作用极弱。为了进一步验证该结果，我们采用免疫共沉淀检测Bmhrp28与BmPSI之间的相互关系。首先以精巢组织抽提物为材料，加入BmHRP28抗体去沉淀其抗原，与BmHRP28相互作用的其它蛋白也会一并沉淀下来，再用BmPSI抗体检测沉淀蛋白产物中是否存在BmPSI。结果显示，BmHRP28抗体沉淀的蛋白产物中，既存在BmHRP28，也存在BmPSI。结合之前酵母双杂交的结果表明，Bmhrp28与BmPSI并不是直接相互作用，而是共存于一个蛋白复合体在家蚕性别决定路径中行使功能。

⑸构建了酵母双杂交早期胚胎cDNA文库。此文库以家蚕限性白卵品种(雄)为材料，将cDNA连入pDONR222载体，产生Gateway入门文库。随后将入门文库转到pDEST22载体上，获得酵母双杂交cDNA文库。经鉴定，该文库的总克隆数为1.36×107。从平板上随机挑取40个转化子菌落，提取文库质粒DNA进行

PCR检测。结果显示，该文库插入的平均片段大小大于1.3 kb，重组率大于95％。取文库1μL稀释106倍后涂板检测，共长出77个菌落。扩增后的文库效价为7.7×1010cfu/mL。鉴定结果表明，该文库达到构建文库的标准，可以用做下一步文库的筛选。采用酵母双杂交的方法，在无自激活的前提下，将pDBLeu—BmPSI筛选已构建的家蚕酵母双杂交早期胚胎cDNA文库。菌落在SC/—Trp/—Leu/—His+30mM3—AT平板上生长7天后，共长出22个酵母转化菌落。将酵母菌落在SC—Trp—Leu二缺平板上划线保种，并挑取少量菌落检测LacZ报告基因的表达。通过LacZ检测的阳性克隆在SC—Trp—Leu—Ura平板上划线。从通过LacZ和URA3检测的酵母菌中抽提出猎物质粒与诱饵质粒做共转化验证。

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