生物技术综合大实验

2013-2014学年生命科学综合大实验

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GFP分离与纯化

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1.文献综述

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绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。

GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。

北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu

Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger （钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。

下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。

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2.实验器材

实验材料：

含GFP融合质粒，Top10菌株

实验试剂：

质粒提取：溶液Ⅰ：50mM 葡萄糖/10mM EDTA /25mM Tris-HCl，pH=；溶液Ⅱ： NaOH/1% SDS；溶液Ⅲ：3M醋酸钾/2M 醋酸；无水乙醇，75%乙醇，TE Buffer；

转化：预冷 CaCl2，LB培养基，氨苄青霉素，阿拉伯糖；

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GFP提取：液氮，Lysis Buffer，饱和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶；

疏水作用层析柱材：苯基琼脂糖凝胶CL-4B；

离子交换柱层析柱材：DEAE+纤维素，

Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，（透析液）)

Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，SDS-PAGE电泳：PEG10000，Loading Buffer，溴酚蓝，丙烯酰胺，Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，Gly，SDS，甘油，β-巯基乙醇，溴酚蓝，甲醇，考马斯亮蓝，乙酸等

实验仪器

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高速冷冻离心机,移液枪，超声波破碎仪，梯度混合器，恒流泵,层析柱,色谱仪,自动记录仪,SDS-PAGE电泳装置。

3.实验方法

质粒提取

1.取菌液，12000rpm离心1min，弃上清液；

2.加100μL溶液Ⅰ，充分悬浮；

3.加200μL溶液Ⅱ，温和混匀，室温5min；

4.加150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5min；

离心8min，将上清加入一新的 EP管中；

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6.加800μL无水乙醇至上清液中，混匀，-20℃放置10min，12000rpm 离心8min，弃上清；

%乙醇洗DNA一次，离心弃上清；

8.在超净台中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；

9.加40μL TE Buffer溶解DNA，4℃备用。

感受态细胞的制备以及转化

1.取 Top10菌液，在4℃ 4000rpm离心10min，弃上清；

2.加200μL预冷的 CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），冰浴15min后4℃4000rpm离心10min，弃上清；

3.加200μL预冷的 CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），4℃备用；

?

4.将1μL质粒和感受态细胞混合，冰浴30min；

℃热激90s；

6.立即放在冰上3-5min；

7.加入800μL LB液体培养基，37℃ 150rpm培养60min（使Top10

恢复正常生长）；

8.取200μL菌液涂布在LB（Amp 100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培养基上，37℃培养过夜。

扩大培养

1.取含GFP质粒的Top10平板并挑取单克隆（在紫外灯照射下有绿色荧光的菌落）；

2.将挑取的单菌落接种于试管中（含4mL的LB液体培养基，100ng/ml 的Amp和4mg/ml的阿拉伯糖）37℃，200rpm振荡培养至对数生长期（约3-4h）；

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3.将上述摇好的菌液，按1:100转接至250mL LB液中（Amp工作浓度 100ng/ml，阿拉伯糖工作浓度2mg/ml），37℃，200rpm培养过夜。细胞破碎

1.将培养好的细菌3000g离心10min，紫外灯观察弃上清，沉淀用液氮冻融；

2.用30mL Lysis Buffer(50mM Tris-HCl ，1mM EDTA)悬浮沉淀；

3.向悬浮液中加15mg溶菌酶，混匀后室温溶解10min；

功率下，超声处理10min；

5.将破碎液9000g离心15min，紫外灯观察，留上清备用；

6.选取合适的浓度破碎(NH4)2SO4沉淀GFP；一般(NH4)2SO4饱和度为30%时，杂蛋白的沉淀量最大，饱和度达到70%时GFP沉淀量达最大附：(NH4)2SO4浓度与含量表，体积为10ml；

7.向上清中加(NH4)2SO4，充分溶解，室温放置20min，9000rpm离心15min，转移上清至另一试管中，再加入(NH4)2SO4，充分混匀，室温放置至少20min，9000rpm离心15min，弃上清，留沉淀备用；

疏水作用层析

1.将沉淀的GFP，用10mL 2M (NH4)2SO4/Lysis Buffer，溶解，9000rpm，离心10min，留上清；（2号样品）

￥

2.用3倍体积平衡Buffer（2M(NH4)2SO4，）平衡柱子；

3.将步骤1中的上清液上柱，用3倍柱体积的Washing Buffer （(NH4)2SO4，）洗柱子；

4.用恒流泵泵TE Buffer（Elution Buffer：10mM Tris, 1mM EDTA，）洗柱，紫外灯检查，GFP快流出时，准备收集；

5.将收集液透析过夜。（3号样品）

离子交换层析

1.将透析后所得的透析液9000rpm离心10min，弃去沉淀（4）；

2.用3倍体积的Start Buffer(A液)平衡柱子；

3.将步骤1中所得的上清液上柱，再用3倍柱体积的Start Buffer 洗柱子；

？

4.梯度洗脱GFP，梯度液：Start Buffer(A液)、Elution Buffer(B

液)，紫外灯观察，GFP 快流出来时，准备收集

5.将收集液透析过夜(透析液为A 液)。 凝胶过滤纯化GFP

1.将透析袋置入含PEG10000的培养皿中，浓缩至体积约2mL ；

2.用3倍柱体积的20mM Tris-HCl ，平衡柱子；

3.将步骤1中所得的GFP 上柱，用20mM Tris-HCl ，洗柱子，紫外灯检测，GFP 快流出时收集备用。 SDS —PAGE

将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer ，煮沸裂解5min ，冰浴2min ，12,000rpm 离心10min ，取上清-20℃保存备用。 ]

1.按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。

2.分离胶的制备 按下列成分配制分离胶：

(

各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中，并为浓缩胶留出足够空间。轻轻在顶层加入一薄层20%乙醇封顶，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的乙醇，用滤纸吸干凝胶顶端的乙醇。

ddH2O

30%丙烯酰胺混合液 Tris 10%SDS

10%过硫酸铵 ？ TEMED

mL mL mL mL

3.浓缩胶的制备

按下列成分配制2mL 5%的积层胶：

ddH2O

|

30%丙烯酰胺混合液

Tris

/

10%SDS

10%过硫酸铵

TEMED

各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其灌注到分离胶上，灌满后小心插入加样梳，尽可能避免产生气泡。

4.待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。

5.将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入20μL各样品。

6.样品在浓缩胶中电泳时，使用80V电压，待溴酚蓝带进入分离胶后，将电压升至120V，继续电泳直至溴酚蓝带到达分离胶的底部且开始泳出胶底面，关闭电源。

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7.卸下凝胶，将其浸泡在至少5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液（50%甲醇，%考马斯亮蓝，10%乙酸，40%ddH2O）中，置水平摇床上室温染色45min，之后取出凝胶并回收染色液，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝脱色液（与染色液同，只是无考马斯亮蓝）中，在水平摇床上脱色1h，其间更换脱色液3-4次，直至凝胶脱色到条带清晰为止，观察结果并拍照。（注：由于浓缩胶制备过程中凝固太快，所以最后未使用浓缩胶而只用分离胶进行SDS-PAGE。）

思考题

1.实验纯化效果如何如果要得到较纯的GFP，你会采用哪些方法进一步纯化

答：实验纯化效果请见实验结果分析。

2.SDS-PAGE的样品缓冲液中有哪些成分它们有什么作用为什么要将样品和缓冲液混合后煮沸

答：SDS-PAGE的样品缓冲液的主要成分有SDS，甘油，溴酚蓝和β-巯基乙醇，其中SDS的作用主要是使蛋白质变形，断裂蛋白质分子间和分子内的氢键，使蛋白质分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构；甘油是增加密度，使蛋白质能很好的沉淀在下面；溴酚蓝作为指示前沿，防止电泳时间过长；β-巯基乙醇作为保护剂，防止空气中的氧对蛋白质的氧化作用，同时还能断裂蛋白质分子中半胱氨酸残基中的二硫键。

3.常用的交联葡聚糖有G-25、G-50、G-70其中的25、50、75指的是什么

答：交联葡聚糖G-25、G-50、G-70中的25、50、75指的是1g交联

葡聚糖干胶膨胀时所吸收水克数的10倍，如G-25中的25指1g这种交联葡聚糖干胶膨胀时要吸水。

4.离子交换层析后，交换剂用什么方法再生后可以继续使用

答：

5.简述疏水层析的原理和主要步骤。

答：蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其他方法不易纯化的蛋白质。主要步骤有：首先用高盐溶液平衡柱子，使柱子暴露出疏水基团，然后在蛋白质过柱子后，最后换用低浓度盐溶液洗脱。