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斑玉蕈甘油醛_3_磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析

食用菌学报 2011.18(2):5~9

收稿日期:2011 02 27原稿;2011 04 12修改稿

基金项目:国家科技支撑计划项目(编号:2010BA K69B18)、上海科委科研平台建设专项(编号:09dz2200800)、上海

市科委崇明科技攻关专项(编号:10D Z 1960100)的部分研究内容

作者简介:张津京(1985-),女,2009级南京农业大学生命科学学院硕士研究生,主要从事食用菌的遗传与栽培的

研究。

本文通讯作者 E mail :f incbio @ya hoo.co https://www.wendangku.net/doc/9d5643811.html,

文章编号:1005 9873(2011)02 0005 05

斑玉蕈甘油醛 3 磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析

张津京1,2,陈辉1,冯志勇1*,陈明杰,汪虹

(1农业部南方食用菌资源利用重点实验室,国家食用菌工程技术研究中心,上海市农业遗传育种重点开放实验室,

上海市农业科学院食用菌研究所,上海201403;

南京农业大学生命科学学院,南京210095)

摘要:甘油醛 3 磷酸脱氢酶(gly cer aldehyde 3 phosphate dehydr ogenase,GA PDH)是糖酵解和卡尔文循环中的关键酶,本实验室之前的研究发现斑玉蕈菌丝的GA PD H 表达随培养基中葡萄糖添加浓度的变化而变化,在此基础上我们首次克隆了斑玉蕈G APD H 的DNA 和cDNA 序列,结果斑玉蕈gpd 基因长2724bp,对比基因组DNA 和cDNA 序列知其中有7个内含子、8个外显子;其理论分子量为36.15kD 、编码蛋白质含338个氨基酸、等电点(PI)为8.24。

关键词:斑玉蕈;甘油醛 3 磷酸脱氢酶;基因克隆;序列分析

甘油醛 3 磷酸脱氢酶(glyceraldehy de 3 phosphate dehydrog enase,GAPDH )是糖酵解途径和葡萄糖异生作用过程中的一个关键酶基因,有较强的转录调控能力[1]

。同时GAPDH

也是一种很重要的抗逆境胁迫基因。H ARRIS

和WATERS

[2]

研究表明GAPDH 可以大致分为

烟酰胺结合区,催化区和S loop 区。同时,OLSEN [3]

研究也表明甘油醛 3 磷酸脱氢酶的S loop 区已经被证实非常重要,因为它包含一个疏水序列,是形成四聚体酶和重要离子与底物结合的核心。这个位点被证明在决定其热稳定性上也是至关重要的[4]。还有研究表明在S loop 区中有24个氨基酸(178 201aa),第183、185和195位的氨基酸影响着C 149和康宁木霉酸结合的活性,因此决定了GAPDH 对抑制剂的敏感性

[5 7]

。

斑玉蕈(H y p siz y gus m armoreus )又名玉蕈、真姬菇、蟹味菇等,是一种珍稀食用菌,它隶属担子菌亚门,层菌纲,伞菌目,白蘑科,玉蕈属,自然分布于欧洲、北美、西伯利亚和日本等地[8]。本实验室先前对斑玉蕈表达谱的研究表明,在不同葡萄糖浓度培养条件下该菌的菌丝和原基中甘油醛 3 磷酸脱氢酶表达量差异很

大。目前斑玉蕈GAPDH 基因尚无报道,为了深入研究GAPDH 在斑玉蕈子实体发育过程中的作用,笔者分别克隆得到斑玉蕈GAPDH 的DNA 和cDNA 序列,并利用生物信息学方法对其编码区产物进行了预测和分析。

1 材料和方法

1.1菌株和质粒

斑玉蕈(H .mar mor eus )菌株SIEF3133是由上海市农业科学院食用菌研究所保藏中心保藏;感受态细胞购自T iangen 公司,质粒载体pGEM T easy 购自T aKaRa 公司。1.2试剂

PCR 试剂购自T akara 公司,凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司,反转录PCR (RT PCR)试剂盒购自TaKaRa 公司,Redzol 购自北京赛百盛基因技术有限公司,DEPC 水购自Bio Basic Inc 公司。

1.3菌丝培养及D NA 和R NA 提取及cD NA 的合成

斑玉蕈菌丝在PDA 培养基中培养大概15d 长满平板后,将菌丝刮取于-70 冷冻过夜,按参考文献[9]的方法提取基因组DNA;总RNA

食用菌学报第18卷

提取采用T rizo l法[10]。单链cDNA的合成根据Takar a反转录试剂盒说明书进行。

1.4斑玉蕈gp d基因全长及cDNA序列的获得根据双色蜡蘑(L accaria bicolor,XM 001887335),裂褶菌(S chiz op hy llum commune, XM003028287),香菇(L entinula edod es, AB012862)和金针菇(Flammulina velutip es, AF515622)的gp d基因核苷酸序列进行同源性比对,选取高保守序列设计兼并引物进行巢式PCR。兼并引物序列分别为:g pdF1 GT TCAAGT AYGAYT CCGT CCA;g pdR1 TARCCCCACTCRT T GT CGT AC;g pdF2 CGAGTCH ACBGGT GT YTT YA C;g pdR2 GGARA CRASRBBGTCCTCDGT。PCR反应参数是:94 预变性3min,94 变性30s,35 退火30s,72 延伸1min,6个循环后再在72 继续延伸5m in,4 保存。以PCR扩展产物为模板再进行一轮巢式PCR,将PCR产物电泳后切下特异的DNA条带,按凝胶回收试剂盒要求进行回收,采用Nano Drop分光光度计ND2 1000检测浓度,按Promeg a公司提供的方法,将PCR扩增片段与pGEM T easy载体连接。连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5 感受态细胞,而后将菌液涂布于含氨苄青霉的LB平板(含X gal和IPTG),倒置平板于37 培养12~16h,挑出白色菌落进行鉴定。

根据获得序列的两端设计引物进行染色体步行[11]。首先将提取合格的DNA(浓度> 4000ng/uL,1.8<260/280<2.0)利用EcoR 酶和H ind 酶分别进行酶切3h,再进行连接反应,将接头连接到酶切后的DN A上,之后进行两轮PCR,将获得的特异DNA条带进行克隆测序。将以上获得序列进行拼接,对其结构进行分析后在可能的起始密码子和终止密码子处设计引物,获得斑玉蕈gpd基因的cD NA序列。

1.5GAPDH的生物信息学分析

利用FGENESH 2.6(http://linux1. softberry.co m/berry)预测H M.GA PDH内含子位置;利用启动子在线预测软件Pro moter Prediction(http://w w w.cbs.dtu.dk/services/ Pro moter/)预测H M.GAPDH的启动子结构;利用蛋白分析专家系统服务器ExPA Sy Pro2teom ics Server(http://ca.ex pasy.o rg/)中提供的Protpar am(http://ca.ex https://www.wendangku.net/doc/9d5643811.html,/ tools/pr otparam.html)预测H M.GAPDH cDNA编码产物的理论分子量、理论等电点以及蛋白稳定性指数等;利用T M2H M M(http:// geno me.cbs.dtu.dk/services/TM2H M M 210)预测GAPDH cDNA编码产物的跨膜区;利用Sig nalP 3.0软件(http://w w w.cbs.dtu. dk/serv ices/SignalP/)预测H M.GAPDH cDNA 编码产物是否有信号肽及可能的切割位点。利用SPSSP软件(http://imtech.res.in/ raghava/apssp/)预测H M.GAPDH cDNA编码产物的二级结构;利用InterProScan(ht2tp:// w https://www.wendangku.net/doc/9d5643811.html,/InterPro Scan/)预测H M. GAPDH cDNA编码产物的保守结构域和功能域。

2 结果与分析

2.1斑玉蕈GAPDH基因的克隆

根据设计的兼并引物进行巢式PCR扩增获得约550bp大小的序列(图1)。BLASTX 同源性分析和其它物种的gp d基因同源性非常高,证明是斑玉蕈gp d基因。再根据已获得序列的两端序列设计引物进行染色体步行PCR,分别在其上下游扩增得到1163bp和1011bp,序列拼接共获得斑玉蕈GA PDH基因2724bp。此基因以H M.gpd为名,登录号JN048800。

M为D2000DNA M ar ker;1为以基因组DNA为模板扩增的条带;2为以cDNA为模板扩增的条带

Lanes:M:D2000DNA M ark er;1:u sing gen om ic DNA as template;2:u sing cDNA as template

图1 扩增斑玉蕈gpd基因片段电泳图Fig.1 Amplification patterns of gpd gene fragment

in H.marmoreus

第2期张津京,等:斑玉蕈甘油醛 3 磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析

2.2斑玉蕈GAPDH基因的序列分析

利用内含子分析软件FGENESH2.6对其进行分析,在可能的起始密码子和终止密码子处设计,PCR扩增获得1268bp序列,利用在线软件EMBL EBI将获得DNA序列和cDN A序列进行序列比对可知,斑玉蕈gp d基因中共有7个内含子和8个外显子,内含子的长度都大约在55bp左右,在它们的边缘都显示内含子边缘序列 GT AG ,编码区大小为1017bp,共编码338个氨基酸,编码产物命名为H M.GAPDH,登录号JN048799。

基因内含子的位置在一定程度上反映了基因的进化程度,在分类学上亲缘关系较近的物种,往往内含子的位置同源性也是比较高的,在一定程度上可以根据内含子的位置推测出物种之间的亲缘关系[12,14]。斑玉蕈g p d的第二个内含子的位置是担子菌gp d的典型特征[13]。和大多数报道的真菌gp d相似,斑玉蕈gp d的内含子分布在5 端。

利用在线软件Pro moter Prediction对斑玉蕈gp d的启动子序列进行预测。结果表明其启动子区在73~23,序列为CCAGGGGCGT TA TAAAACCCTCT CCCCGCCCT TT CCT TT CA ACA CCCAT C,斑玉蕈gp d的5 端序列中含有一个CAAT box,三个T ATA bo x,一个GATA bo x和一个CT rich m otif。和其它担子菌类似[14],一些共识启动子元件比如在构巢曲霉和黑曲霉中的g pd box,pg k bo x,qut box和qa bo x[15]在斑玉蕈gp d的启动子区域中也同样没有发现。

2.3HM.GAPDH基本理化性质的预测和分析利用Protparam软件预测H M.GAPDH编码产物的理论Mr为36.15kD,理论等电点为8.24,半衰期为30h,不稳定指数是24.34,该蛋白属于稳定蛋白。进一步利用TM H MM软件对H M.GAPDH编码产物的跨膜区域进行预测,结果发现H M.GAPDH是一个没有跨膜区域的蛋白,该结果与利用ProtScale软件在线分析其亲水性和疏水性的结果类似,即:H M.GAPDH属于亲水性蛋白。SignalP

3.0的分析结果表明H M.GAPDH中无信号肽,推测此蛋白在核糖体中合成完毕后就分布在细胞质中了,属于NAD+ -GAPDH(EC1.1.2.1.12)。

2.4HM.GAPDH的结构预测

在预测的H M.GA PDH的二级结构中, -螺旋占31.36%、延伸链占26.04%、无规卷曲为34.02%、 -转角占8.58%。

通过InterPr oScan软件的分析结果也显示HM.GAPD H的第2~150位氨基酸残与Gp dh_N超家族高度同源,而其第155~312位氨基酸残基与G p_dh_C超家族高度同源,该蛋白属于type ;CDD对HM.GAPD H分析结果也显示HM.GAPDH的第2~150位氨基酸残基为NADB Ro ssm ann结构域、第155~312位氨基酸残基为Gp dh C超家族结构域。进一步利用Pro site蛋白质数据库对H M.GAPD H中可能含有的隐含功能域进行了预测,发现其在第148~ 155位氨基酸残基处存在1个HM.GAPDH激活位点,结构为ASCTTNCL。这个预测结果和Har msen等人[13.15 17]通过实验证明是一致的,S. com m une,P.chysosporium和A.bispo rus的第150位上的半胱氨酸是GPD的活性位点所在,且其周围的氨基酸序列也是ASCTTNCL。

2.5基于HM.GAPDH系统发育树的构建

将H M.GA PDH蛋白与其它真菌进行同源性比较可知,它与蜜环菌(A rmillariella tabescens,CAF74786),灰霉菌(Cop rinop sis ciner ea,BAC75713),金针菇(Flammulina velutip es,AAQ08201)和双色蜡蘑(L accar ia bicolor,XP_001887370)等种类的GAPDH在氨基酸序列的一致性均在94%以上,与其它真菌的同源性也高达到90%以上,反映出该基因在进化上比较保守,也说明了这个酶在功能上的重要性。利用软件Meg a3.1中的N J法将斑玉蕈的GAPDH和另外19种真菌的GAPDH构建的进化树可以看出(图2),斑玉蕈GAPDH与香菇和金针菇的GAPDH同源性最高,来自同一个进化分枝;与其它真菌进化关系较远,属于不同的分枝。并且这20种真菌的GAPDH氨基酸个数从336~340不等,氨基酸个数相差1~4个,从这个数据也可以看出GA PDH在进化上是非常保守的。

食用菌学报第18

卷

图2 斑玉蕈GAPDH 和其它食用菌的系统发育分析

Fig.2 Phylogenetic tree based on GAPDH amino acid sequences

3 小结

本文首次扩增出斑玉蕈的甘油醛 3 磷酸脱

氢酶(GA PDH )的基因(gp d ),并根据已获得序列的两端序列设计特异引物进行步行获得gp d 的全长序列;据此序列可能的起始密码子和终止密码子设计引物,扩增出gp d 的cDNA,通过软件预测其编码的氨基酸序列。我们还利用生物信息学预测了斑玉蕈GAPDH 的结构特征,通过构建系统发育树分析了斑玉蕈GAPDH 与其它真菌的亲缘关系。系统发育树分析表明,斑玉蕈GAPDH 与香菇和金针菇的GAPDH 同源性最高。

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Cloning and Sequence Analysis of a Glyceraldehyde

3 Phosphate Dehydrogenase Gene from

Hypsizygus marmoreus

Z HANG Jinjing1,2,CH EN H ui1,FENG Z hiyong1*,C HEN M ingjie1,W ANG H ong1

(1N ationa l R esea rch Cente r f or Edible F ungi Bio techno lo gy and Eng ineer ing;Sha nghai Ke y L abor at or y o f

A gr icultura l G enetics and Bree ding;Institute of Edible F ungi,Shanghai Ac ade my o f A gr icultur al Scie nce s, Sha ng hai201403,China;2Co llege o f L ife Scie nces,N anjing A gr icultur al U nive rsity,N anjing210095,China)

Abstract:A g lyce ra ldehyde 3 pho sphate dehy dr o genase gene(gpd)and co rr espo nding cD NA w er e clo ned

fr om the edible f ung us,Hypsizigus m arm or eus.Co mpar iso n o f the cloned DN A and cDN A sequence re vealed that gpd wa s2724bp in le ng th,co ntaining se ven intr o ns and e ight e xo ns,and encoding a pro tein c onsisting

of338am ino acids r esidues.T he ca lculate d mo lecular w eight and PI of the pro tein w ere36.15kD and pH 8.24,r espectively.

Key words:Hypsizigus ma rm oreus;G ly cer aldehy de 3 phospha te dehy dr o genase;ge ne c lo ning; sequence a naly sis

[本文编辑] 曹晖

【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析

（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多

控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测试剂盒说明书微量法

3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号：BC2215 规格：100T/96S 产品内容：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存。试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。试剂三：液体12uL×1支，4℃保存。临用前加入0.4mL蒸馏水充分混匀，或根据比例现配现用；用不完的试剂4℃保存一周。产品说明： GAPDH（EC1.2.1.12）催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。 3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD+，340nm处测定NADH的减少量可反映GAPDH活性的高低。试验中所需的仪器和试剂：紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。操作步骤：一、粗酶液提取：组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。血清（浆）：直接检测。二、测定步骤： 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，分光光度计蒸馏水调零。 2、工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，根据需要取一定的量置于37℃(哺乳动物) 或25℃(其它物种)预热10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 3、操作表：在微量石英比色皿或96孔板中分别加入下列试剂：试剂名称空白管测定管样本（μL）6 蒸馏水（μL）6 试剂三（μL）44 试剂五（μL）190190在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值 A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴或培养箱5min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或25℃），拿出迅速擦干测定5min10s时的吸光值A2，计算△A测定管=A2测定-A1测定，△A空白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。三、GAPDH酶活计算： 1、按微量石英比色皿计算：（1）按蛋白浓度计算酶活定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 GAPDH酶活（U/mg prot）=△A÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T =1072×△A÷Cpr （2）按样本质量计算酶活定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 GAPDH酶活（U/g鲜重）=△A÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T

3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)试剂盒说明书

货号：MS2205 规格：100管/96样 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)试剂盒说明书微量法正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义： GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。测定原理： 3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。自备实验用品及仪器：分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制：提取液一：液体100mL×1瓶，4℃保存。提取液二：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂三：液体14uL×1支，4℃保存；组织样本的前处理： ①总GAPDH酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。 ②胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆GAPDH酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g 离心10min，取上清测定叶绿体中GAPDH酶活性。建议测定总GAPDH酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH，则按照步骤②提取粗酶液。细菌或培养细胞的前处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。测定步骤：第1页，共2页

红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析开题报告于凯

毕业设计/论文开题报告课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文系别城市建设学院专业班生物工程0701班姓名于凯评分指导教师华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。

3-磷酸甘油醛脱氢酶

货号：QS2205-25 规格：25管/24样 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)试剂盒说明书分光光度法正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义： GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。测定原理： 3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。自备实验用品及仪器：分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制：提取液：30mL×1瓶，4℃保存；试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存；试剂三：液体×1支，4℃保存；样本的前处理： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟；现配现用。（2）在试剂三中加入500μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂4℃保存一周。（3）在1mL石英比色皿中加入30μL样本、20μL试剂三和950μL工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录340nm处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。第1页，共2页

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析 3.1质粒提取用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果

3- 磷酸甘油酸激酶(3- Phosphoglycerate kinase ,PGK )试剂盒说明书

货号：MS2208 规格：100管/96样 3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK）试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义； 3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸，产生1分子ATP，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。测定原理； 3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，340nm处的吸光度变化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。自备实验用品及仪器；天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。试剂组成和配制；提取液：液体100mL×2瓶，4℃保存。试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。试剂三：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。试剂四：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加1 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。试剂五：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加4 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。酶液提取； ①总PGK酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，500g离心5min，取上清测定。 ②胞浆和叶绿体PGK酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液），冰浴匀浆后于4℃，500g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆PGK酶活性，取沉淀加1mL提取液，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，500g离心5min，取上清测定叶绿体中PGK酶活性。建议测定总PGK酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的PGK，则按照步骤②提取粗酶液。测定操作； 1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。第1页，共2页

第五章基因克隆技术

第五章基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。基因克隆的一般程序为：一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在

3- 磷酸甘油酸激酶

货号：QS2208 规格：50管/48样 3- 磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK）试剂盒说明书紫外分光光度法注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义: 3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸，产生1分子ATP，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。测定原理: 3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，340nm处的吸光度变化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。自备实验用品及仪器: 天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿。试剂组成和配制: 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2.5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。试剂四：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2.5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。试剂五：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加10 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。酶液提取： ①总PGK酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，500g离心5min，取上清测定。 ②胞浆和叶绿体PGK酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液），冰浴匀浆后于4℃，500g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆PGK酶活性，取沉淀加1mL提取液，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，500g离心5min，取上清测定叶绿体中PGK酶活性。建议测定总PGK酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的PGK，则按照步骤②提取粗酶液。测定操作： 1.分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。第1页，共2页

L_乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析

20卷5期2004年9月生物工程学报Chinese Jou rnal o f Biotechnology Vol.20 No.5 September 2004 收稿日期:2004_03_08,修回日期:2004_05_31。 *通讯作者。 Tel:86_22_23505967;Fax:86_22_23505967;E_mail:meor@https://www.wendangku.net/doc/9d5643811.html, L_乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析李剑唐梁凤来张心平刘如林 * (南开大学生命科学学院,天津 300071) 摘要构建了一株产D,L_乳酸的乳杆菌(Lactobacillus sp.)MD_1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的Escherichia coli FMJ144作为宿主,通过互补筛选分离克隆到乳酸脱氢酶基因(ldh L )。核酸序列分析表明,该基因以ATG 为起始密码子编码316个氨基酸残基组成的蛋白质,预测的分子量为33 84kD;5 端存在典型的启动子结构,3 端的终止子是不依赖于因子的转录终止子。ldh L 编码的蛋白质有3个保守区域,其中Gly13~Asp50保守区域是NADH 的结合位点,Asp73~Ile100和Asn123~Arg154保守区是酶的活性部位。该ldhL 和其他乳杆菌的ldhL 基因和编码的氨基酸序列相似性较低,核苷酸序列相似性最高仅为64 1%,氨基酸序列相似性最高仅为68 9%,是新的L_乳酸脱氢酶基因。关键词乳杆菌(Lactobacillus sp.)MD_1,L_乳酸脱氢酶基因,互补筛选,功能分析中图分类号 Q93 文献标识码 A 文章编号1000 3061(2004)05 0725 05 乳酸在食品、医药、化工、环保等领域有广泛的用途。L_乳酸的生产及其聚合物作为可降解塑料和医用材料的研究日益深入。D_乳酸的聚合物可以用于药物的缓释技术和可降解环保农药的前体物。因此,高光学纯度的D_乳酸或L_乳酸均具有广阔的应用前景[1] 。乳酸脱氢酶(LDH )是以NAD H 为辅酶,将丙酮酸经过生化反应生成乳酸,因此LDH 是乳酸菌合成乳酸的关键酶。产D,L_乳酸的乳杆菌中存在L 和D 两种依赖NADH 的LDH,分别催化丙酮酸生成L_乳酸和D_乳酸。作者筛选到一株产DL_乳酸的乳杆菌(Lactobacillus sp.)MD_1,能在48 含200g L 葡萄糖的发酵液中快速生长并生产乳酸,72h 产量可达 140g L 以上。如果使乳杆菌的D_乳酸脱氢酶基因(ldhD )缺失,则只生产高光学纯度的L_乳酸(理论上光学纯度可达到100%),同时可以大幅提高L_乳酸产量。反之,如果使L_乳酸脱氢酶基因(ldhL )缺失,则生产高光学纯度的D_乳酸。本文报道了Lactobacillus sp.MD_1菌株的ldhL 序列,同时对ldhL 及编码的蛋白质的一级结构进行了初步分析。 1 材料与方法 1 1 菌株与质粒本文所用的菌株和质粒见表1。质粒pJDC9、菌株E .coli FMJ144由Jean Delcour 教授惠赠。表1 菌株和质粒 Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study Strain or plas mi d Characteri stic(s) Source or reference Lactobacillus .s p.MD_1 Wild_type s train this study E .coli FMJ144 ldh pfl ::Cam r t rpR his _29(Am )pro _2ary _427deo B arc ts x IN (rrnD _rrnE )lacY 2 TG1suoE hsd 5thi (lac _proAB ) F (traD 36)ProAB +lac I q lacZ M 15 3Plas mid pJDC9Em r ;l dhZ 4 pLZD3083 Em r ;pJ DC9wi th a 3 11Bam H fragment from s train MD_1 this study Em r ,Ap r and Cm r indicate resistance to erythro myci n,ampicillin,and chl oramphenicol,respectivel y