实时细胞分析技术在肿瘤研究和病毒抗体疫苗检测中的应用

实时细胞分析技术在肿瘤研究和病毒抗体疫苗检测中的应用

引言

实时无标记细胞分析技术（RTCA, Real Time cell Analysis）是艾森生物全球独有的专利核心技术，该技术采用特殊工艺，将微电极列阵整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底部，用以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗检测传感系统。该技术可广泛应用于生物活性因子测定、细胞增殖检测、大规模抗肿瘤药物筛选、细胞毒性检测等研究。

内容提要

一、实时细胞分析技术原理

1.传统终点检测与实时无标记动态检测

2. 实时细胞分析技术原理

3. 实时细胞分析技术优势

二、实时细胞分析技术平台产品简介

三、实时细胞分析技术在肿瘤、药物细胞毒性检测领域的应用

1.RTCA实时动态细胞毒性检测

2.肿瘤与微环境之间的相互作用RTCA实时动态检测

四、实时细胞分析技术在病毒、细胞毒素、中和抗体及疫苗检测与评估领域的应用

1.RTCA实时动态检测病毒Cytopathic Effect效应

2.RTCA实时定量检测病毒侵染效力及评估中和抗体效价

实时细胞分析技术原理

1.从传统终点检测到实时无标记检测

细胞活性检测是细胞生物学研究的重要内容，其广泛应用于生物活性因子测定、细胞增殖检测、大规模抗肿瘤药物筛选、细胞毒性检测等研究。

传统细胞活性检测方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法以及ATP检测法等。但这些细胞学研究检测形式多是终点检测法，仅给实验提供一个最终结果，且经常需要标记和破坏细胞。由于细胞是活体，其生物学和细胞进程是动态而非静态的，终点检测法大大局限了生物信息的全程动态收集。

为了克服终点检测方法的局限性，ACEA Biosciences开发出了一项全球领先的实时无标记细胞分析技术，并研发出一系列实时无标记细胞功能分析仪。该方法最重要的特征是检测过程无标记、对细胞无创伤性，因此可以长时间持续检测细胞状态、以及由化合物和其他因子介导的细胞生物学反应。

图1. 传统终点检测方法到实时无标记检测方法

2.实时细胞分析技术原理

实时无标记细胞分析技术，采用特殊工艺，将金微电极阵列整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底部，用于构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗检测系统。当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时，这种改变与细胞的实时功能状态改变呈相关性，通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物信息，包括细胞生长、延伸、形态变化、死亡、贴壁等。

图2. E-plate 底部的交叉微电极工作原理示意图。贴壁生长的哺乳动物细胞与微电级间的相互作用产生的阻抗与孔内的细胞数量、细胞形态以及细胞黏附质量相关；阻抗的大小用细胞指数（CI）进行衡量。

3. 实时细胞分析技术优势

传感器阻抗技术在细胞分析中的应用具有其特有的优势。第一个也是最重要的，细胞传感器阻抗为整个实验全程包括细胞粘附、增殖和融合提供了全程无损伤性的细胞监控。实时的监控为同一个实验中和不同实验间的细胞提供了出色的质量控制。另外，因为有了实时、连续显示的数据，就可以更自信地操作和处理细胞，而不是假定细胞处于合适的处理阶段。有了阻抗读数以及实时获取和显示的数据的特性，每一步处理结果都可以通过机理来预测。最后，因为读数是非损伤性的，传统的终点分析仍然可以继续结合阻抗读数来决定进行传统终点分析的最佳时间点。

表1. RTCA技术检测优势

实时细胞分析技术平台产品简介

基于实时细胞分析技术，ACEA研发出一系列实时无标记细胞功能分析仪，帮助研究人员克服传统终点检测法的局限性，实时动态检测细胞状态。该平台产品已在南京大学、复旦大学、中山大学、解放军第302医院等全国多家单位的实验室中帮助科研人员进行细胞增殖检测、细胞毒性检测，以及抗肿瘤药物筛选的研发生产等研究领域。

表2. 实时无标记细胞分析平台系列产品

实时细胞分析技术作为一种新兴的细胞活性检测技术，可广泛应用于细胞生物学、分子生物学、肿瘤学、生物化学、毒理学等多种学科领域及抗肿瘤药物筛选、研发、生产及质量控制过程。下面我们将以应用实例展示的形式为大家简单介绍RTCA技术在肿瘤、药物细胞毒性检测领域，以及在病毒、细胞毒素、中和抗体及疫苗检测与评估领域的应用。

实时细胞分析技术在肿瘤、药物细胞毒性检测领域的应用

细胞活性检测常运用在细胞功能、细胞对药物反应以及药物毒性的研究。新的药物、化妆品、食品添加剂等在投入之前，都必须进行大量的细胞毒性检测。如果是抗癌药物，细胞毒性就是它们作用的的关键所在，因此细胞毒性检测实验也随研究目的不同而不同。RTCA 实时细胞分析技术通过电阻抗的形式，可以实现实时、无标记、持续动态检测细胞表型变化。此外，在药物细胞毒性检测实验中，RTCA检测能够精确确定化合物介导的细胞毒作用发挥最大效应的时间点，帮助研究人员更好的控制和优化实验，有助于抗肿瘤药物筛选以及药物作用机理的研究和揭示。

应用实例一：RTCA实时动态细胞毒性检测

RTCA实时细胞分析技术持续动态监测细胞贴壁、伸展及细胞增殖过程。使用细胞指数（Cell Index）表示细胞阻抗。每点CI值定义为（Rn-Rb）/15，其中Rn表示孔接种有细胞时的背景阻抗值，Rb是表示孔中只有培养基时的背景阻抗值。标准化细胞指数（NCI）定义为感兴趣的时间点的细胞指数与某一特定时间点的细胞指数的比值。

实时细胞分析技术能够实时、连续检测细胞的活力。图3A为几种抗肿瘤药物（DNA损伤药物阿霉素Doxorubicin和5-FU，蛋白酶体抑制剂MG-132及抗有丝分裂药物长春新碱Vincristine）的动态细胞检测图谱，图3B为采用WST-1进行药物细胞毒性检测的结果。RTCA 实时细胞分析技术的检测曲线显示，不同作用机制的化合物介导的细胞增殖抑制速率和动力学具有明显的差异（图3A）。其中，MG-132介导的细胞毒素作用开始于加药4h，10h达到最大毒性作用；与此相反，长春新碱在加药后立即引起毒性作用，15h达到最大效应；而阿霉素和5-FU介导的细胞毒素作用在加药很长一段时间后才观察到，起效时间分别为12h和24h，药物作用48h后才观察到最大效应值。

图3A. RTCA实时动态检测细胞活力。Hela细胞接种于E-Plate 96电极板，培养24h之后用不同化合物处理：MG-132（3.3uM），阿霉素（0.33uM），长春新碱（6.2nM）及5-FU（11.1uM），未经化合物处理的细胞作为

对照组。每隔15min检测一次细胞指数，持续检测64h。曲线代表所有重复样品的平均值，误差线为标准

偏差。图3B. 细胞指数和WST-1分析结果对比。实验结束时（图3A所示），即加药后64h，加WST-1染色

分析。细胞指数和WST-1分析结果对比，结果展示为试验组相对于对照组的倍数变化，柱状图显示所有重

复样品的平均值，误差线为标准偏差。

为评估细胞指数变化是否可用于帮助选择后续检测的最佳检测时间点，我们选择了两种具有不同细胞动力学图谱的凋亡诱导药物MG-132和5-FU进行检测（图4）。Hela细胞接种于E-Plate 96培养24h后，将上述两种药物3倍稀释后加入到细胞中。RTCA持续检测64h，MG-132在加药后10h内出现CI最低值（图4A），而5-FU达到最低值则至少需要48h（图

4B）。另外，细胞作用动力学图谱显示药物作用具有浓度依赖性，高浓度药物对细胞的作用效应更明显，细胞指数下降速率较快，而低浓度药物的细胞指数下降速率较慢（图4B）。同时，我们分别选取两个不同的时间（图4A 4B）。用凋亡实验进行检测的结果显示，对于MG-132，凋亡反应时间最佳剂量依赖时间出现在加药后16h而非在64h（图4C）；而对于5-FU，在16h，此时CI值刚开始出现下降趋势则无法测得凋亡效应，凋亡反应时间最佳剂依赖反应时间出

现在64h（图4D），这说明凋亡反应具有瞬时性，同时也说明在捕获瞬时细胞反应时挑选最佳时间的重要性。根据上述RTCA获取的数据，进行凋亡检测试验时，应取CI值刚达到最低值时的时间点为佳，检测时间过早或过晚都无法捕捉到凋亡效应的最佳窗口。建立了最低细胞指数与凋亡作用之间的关系之后，我们又研究了如何根据细胞指数变化来预测细胞凋亡作用。

图4. RTCA实时检测细胞凋亡。Hela细胞分别用不同剂量的蛋白酶体抑制剂MG132（图A和图C）和DNA 损伤抑制剂5-FU（图B和图D）处理，持续检测细胞指数64h。E-Plate 96电极板检测的同时，平行实验使用常规细胞凋亡方法进行检测。加药后16h和64h分别收集细胞，用ELISA PLUS细胞凋亡检测试剂盒，其结果显示为药物组相对于对照组的比值。

图5. RTCA检测指示最佳检测时间。（A）Hela细胞用3.3uM MG-132处理后，细胞指数持续检测12h；（B）RTCA检测和传统终点WST-1检测的对比；（C）ELISA PLUS检测加药后1,4,8,12h的细胞凋亡。

在该研究中，我们使用了具有较快反应动力学的药物MG-132。加药后持续检测细胞指数12h；同时设立平行试验，使用WST-1细胞增殖检测试剂和ELISA PLUS细胞凋亡检测试剂盒检测药物作用1,4,8,12h的细胞凋亡现象（图5）。当细胞指数接近最低值时可观测到最高水平的细胞凋亡效应（图5C），重要的是，与WST-1分析法相比，细胞指数变化能更灵敏的预测细胞凋亡效应（图5B）。例如，在加药后8h，指数显示与对照组相比，实验组细胞指数发生了>80%的变化，而WST-1分析法则只显示发生了<20%的变化，相应的，在该时间点细胞凋亡作用非常明显，为对照组的6倍。因此，检测化合物引起的细胞黏附、形态等快速瞬时变化，与传统的检测线粒体功能的WST-1终点检测法相比，更适合用实时细胞分析技术进行检测。实时细胞分析技术检测细胞瞬时反应的高灵敏性特性，也非常适用于指示后续实验的最佳检测时间点，从而帮助研究者更深入的揭示化合物介导的细胞凋亡效应。

应用实例二：肿瘤与微环境之间的相互作用RTCA实时动态检测

肿瘤与微环境的相互作用是近年来肿瘤细胞学研究的一个热点，不仅对肿瘤本身的发生发展和转移等研究有着非常重要的意义，而且对抗肿瘤药物筛选和肿瘤治疗起着相当重要的作用。

检测肿瘤和微环境之间相互作用的传统细胞学方法是共培养的终点法，将肿瘤与基质细胞共培养一段时间后，染色后用显微镜来观察效应细胞对应答细胞的作用效果或是通过WST 等方法检测应答细胞的生长情况。而这两种方法由于灵敏度不高，且检测的时间不易把握，因而具有一定的局限性。

艾森生物开发的细胞共培养（CCD）系统是以艾森的实时细胞分析技术为基础，由E-Plate 和insert两部分组成。贴附于E-Plate中的细胞，其贴附能力及相互作用都会导致阻抗的变化；同时，阻抗的变化与贴壁细胞的数量，大小，形状变化都有关系。如图6所示，在E-Plate 中接种应答细胞，insert中接种效应细胞，insert中的效应细胞通过分泌影响应答细胞的生长因子等物质，对E-Plate中的应答细胞产生刺激，毒性或调解作用等。这些作用引起E-Plate 中应答细胞发生增殖、形态变化、死亡等现象，从而引起电阻抗变化，并通过实时细胞分析技术进行实时检测，并且通过细胞指数的测定定量计算刺激的产生效果。ACEA实时细胞分析CCD系统使动态监测肿瘤及肿瘤微环境之间的相互作用成为可能，而且，这种检测无需对应答细胞进行额外的标记。

图6. 细胞共培养系统（CCD）的结构示意图

动态检测C-Met及HGF介导下的肿瘤细胞Hcc827对Gefitinib的耐受

利用ACEA实时细胞分析系统的CCD产品检测C-Met及HGF介导下的肿瘤细胞Hcc827对Gefitinib的耐受。在E-Plate板的每孔中接种Hcc827细胞作为应答细胞，MRC-5细胞作为效应细胞接种在insert中，可分泌生长因子HGF，同时按实验设计加入EGFR抑制剂Gefitinib 和/或C-Met抑制剂Crizotinib，动态监测MRC-5细胞介导的Hcc827细胞对药物的耐受过程。如图7B中NCI Curve所示，正常生长情况下的Hcc827的曲线为红色；Hcc827细胞中加入抗肿瘤药物Gefitinib后Hcc827的生长受到明显的抑制（绿色曲线）。如图7C所示，Gefitinib 处理并加入接种MRC-5细胞的insert，insert中的MRC-5细胞分泌的HGF通过cMET通路刺激Hcc827细胞的增殖，引起了Hcc827细胞对药物的耐受性（绿色曲线）。图7D所示，在图5C实验的基础上，加入cMET通路的抑制剂Crizotinib，阻断了HGF的作用，Hcc827细胞对Gefitinib的敏感性重新恢复（绿色曲线）。细胞染色图片与曲线所显示的结果一致。总之，ACEA实时细胞分析系统是目前唯一一种不需要对应答细胞进行标记或添加任何化学指示物就能够实时直接检测肿瘤与微环境之间相互作用的方法。该系统可以动态监测肿瘤与微环境之间相互作用的全过程，这是基于标记的终点分析法无法达到的。

图7. 动态检测成纤维细胞MRC-5介导的肿瘤对治疗的耐受

动态检测C-Met通路影响EGFR抑制剂耐药性与终点法的对比

图8. 动态检测与终点法检测成纤维细胞介导的肿瘤细胞对治疗的耐受性对比。（A）使用RTCA方法检测得到的细胞指数在96h的数值对比；（B）使用终点法在96h进行WST-1检测，得到的WST-1读数的对比。

对比ACEA实时细胞分析系统检测和终点法检测的最终结果，图8A显示的是实时细胞分析系统动态检测法在实验结束时（96h），以细胞指数为纵坐标，显示了各个条件下Hcc827细胞的生长状态。图8B显示的是终点法使用WST-1检测的Hcc827细胞的生长状态，以WST-1的读数为纵坐标。两种方法得到的结果趋势基本一致，且使用实时细胞分析方法得到的结果灵敏度更高，加入药物的反应更加敏感。

RTCA技术在病毒、细胞毒素、中和抗体及疫苗检测与评估领域的应用

微生物和病毒通过感染宿主细胞改变宿主细胞的生理功能，进而导致了疾病的发生。对病原体感染细胞的分析除了作为一个重要的感染诊断结果，还可以为我们提供关于微生物-宿主和病毒-宿主之间相互作用功能性评估的重要信息。迄今为止，虽然已经开发了多种基

于细胞分析的微生物和病毒感染诊断方法，但却几乎没有一个平台的技术是专门用于此目的的。而且大多数分析方法的结果是定性的而无法定量，并且诊断的敏感性和准确性还有待提高。因此，我们迫切需要一种定量的、多功能的、快速的、且易于使用的细胞分析系统，而艾森生物研发的实时细胞分析技术正是集这些特点于一体的新型细胞分析技术。下文我们将介绍该技术在微生物和病毒感染中的应用，包括细胞毒素检测、细菌与宿主细胞之间相互作用检测、病毒介导的CPE定量分析、中和抗体检测、寄生虫感染活动的评估和免疫系统功能检测。

应用实例一：RTCA实时动态检测病毒Cytopathic Effect效应

病毒引起的细胞病变作用Cytopathic Effect（CPE）是评价病毒的感染力及致病效应的通用方法。目前研究病毒的最常用方法是空斑实验。空斑实验的结果是来自于终点法检测，因此无法获取病毒复制及其引起的细胞病变的完整信息，此外，空斑实验过程中人工操作步骤过多，增加了操作人员感染病毒的风险。RTCA实时细胞分析技术可用于细胞增殖检测、细胞黏附及细胞活性检测等。因此，RTCA实时细胞分析技术的应用领域非常广泛，涉及新药研发、毒理学、肿瘤学、医学微生物学及病毒学等。同时该方法还可应用于细胞增殖及细胞毒性检测、细胞黏附和伸展、细胞质控、酪氨酸激酶受体反应、肥大细胞活化及G蛋白偶联受体激活等实验中。

本应用案例讲述了通过RTCA实时细胞分析技术研究病毒介导的CPE效应的实验方法。此方法克服了传统终点法的限制，无需标记，步骤简单，且实时记录病毒CPE效应，成为研究病毒CPE效应的一种简便有效的方法。

本实验使用实时细胞分析技术进行细胞增殖检测，并由此确定滴加病毒的最佳时间点，从结果中可以发现Vero E6细胞的最佳感染时期为细胞接种后20.5h，HEK293则在细胞接种后68.5h（图9A，B），在这个时间点接种密度为50000个/孔的细胞处于平台初期，接种密度为12500个/孔的细胞处于对数生长期。选择这两个时间点可分别观察病毒对增殖平台期和对数生长期细胞的不同影响。

图9. 动力学监测细胞增殖情况。细胞接种于E-Plate 96孔板后置于RTCA实时无标记细胞功能分析仪实时动态监测细胞增殖状况，并确定加入病毒的时间（细胞生长对数期或平台期）。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每30min检测一次（A）Vero E6细胞及（B）HEK293细胞黏附伸展及增殖状况。不同颜色的曲线代表不同的细胞接种密度。

通过RTCA实时细胞分析技术实时动态检测细胞状况，发现Vero E6细胞无论在增殖平台期还是在对数生长期用高低两个滴度的病毒处理细胞都能产生CPE效应。当Vero E6在对数生长期感染病毒，病毒的CPE效应与病毒接种的滴度呈明显的相关性（图10）。在VSV病毒以较低的滴度（80,000 PFU）感染细胞，在感染期的15h Vero E6细胞的生长状况（图10A，

蓝色曲线）与对照组类似（图10A，绿色曲线），但之后VSV病毒开始复制并诱导了细胞的死亡，表现为CI值下降，24h后CI值下降到50%（CI50），并持续下降，最后降为0，细胞全部死亡。若VSV病毒以较高的滴度（800,000 PFU）感染细胞，CI值在感染后4h就有所下降，在感染后11h下降到CI50。

VSV病毒在Vero E6细胞生长平台期感染与细胞生长对数期感染的结果类似（图10B）：VSV病毒以较高的滴度（800,000 PFU）感染细胞，10h后CI值下降到CI50（图10B，红色曲线），VSV病毒以低滴度（80,000 PFU）感染细胞，19h后CI值下降到CI50（图10B，蓝色曲线），最后CI值也下降为0，细胞尽数死亡。

图10. 实时监控VSV病毒感染后Vero E6细胞的生长状况。（A）对数生长期细胞标准化CI值；（B）平台期细胞标准化CI值。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每15min检测一次VSV病毒对Veri E6细胞黏附伸展及增殖的影响。

根据实时细胞分析技术检测到的细胞增殖曲线，选择HEK293细胞接种后68.5h滴入病毒（图11A，B）。感染VSV病毒后HEK293细胞与Vero E6细胞的反应不一致。HEK293在细胞对数生长期对病毒的作用非常敏感：高滴度的VSV病毒作用细胞后细胞CI值下降到CI50只要6h（图11A，红色曲线）；低滴度病毒组细胞CI值下降到CI50也只要12h（图11A，蓝色曲线）。然而，VSV病毒在细胞生长的平台期感染细胞的结果却完全不同（图11B）。高滴度病毒在细胞增长平台期感染细胞CI值变化的趋势和细胞对数生长期感染细胞的结果一致（图11B，红色曲线）；而低滴度病毒接种于平台期细胞时，细胞CI值变化趋势却与对照组相似，说明低滴度病毒对平台期HEK293没有产生CPE效应（图11B，蓝色和绿色曲线）。

图11. 实时监控VSV病毒感染HEK293细胞的生长状况。（A）对数生长期细胞标准化CI值；（B）平台期细胞标准化CI值。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每15min检测一次VSV病毒对HEK293细胞黏附伸展及扩增的影响。

Vero E6与HEK293唯一的不同之处在于HEK293能产生Ⅰ型干扰素，Vero E6敲除了Ⅰ型干扰素基因，Ⅰ型干扰素基因可以上调抗病毒活性蛋白如MxA及OAS/RNaseL蛋白的表达，

这就导致了两种细胞对VSV病毒的不同响应。HEK293细胞有完全的干扰素系统，当病毒感染时，HEK293细胞能产生干扰素并激活JAK/STAT信号通路，并引起抗病毒活性蛋白表达量的增加，细胞的抗病毒能力随之增强。因此，推测本实验中干扰素系统的作用是HEK293细胞对低滴度病毒（PFU 80,000）产生抗体的关键因素。细胞对VSV病毒的不同响应有助于研究细胞的抗病毒作用机制。

综上所述，与常规终点法相比，RTCA实时细胞分析技术可以实时动态监控病毒与宿主细胞相互作用，且无需标记，为科学研究带来了极大的便利。

应用实例二：RTCA实时定量检测病毒侵染效力及评估中和抗体效价

本研究中，以H1N1病毒为例，着重介绍RTCA实时细胞分析技术在病毒学检测中的应用。我们应用实时细胞分析技术实时监测MDCK细胞中的H1N1病毒引起的细胞病变效应，并进行定量分析。同时，用该法评估了21个接种H1N1流感疫苗的健康个体在接种前和接种后的中和抗体效力，并与传统凝血实验得到的数据进行对比。

为确定合适的MDCK细胞接种数量，向E-Plate检测板接种不同数量的细胞，利用RTCA 技术进行细胞增殖检测。根据细胞增殖曲线，确定1×104/孔为最佳接种量。根据不同剂量TPCK-胰蛋白酶作用下病毒对MDCK细胞的侵染情况，确定最佳的胰蛋白酶浓度为2.5ug/ml，此浓度对MDCK细胞增殖的影响最小。

MDCK细胞到达对数生长期时，向其中分别加入5.5×108/ml的SH37T的SH143T病毒株，RTCA实时动态监测病毒介导的CPE，同时显微镜下观察细胞CPE状态（图12A）。随着H1N1病毒的大量复制，导致细胞逐渐死亡，RTCA检测显示细胞指数（CI）下降（图12B），而对照组未感染细胞呈正常增殖状态。平行进行的WST-1实验进一步证实了细胞指数（CI）变化可反映H1N1病毒介导的CPE（图12C），在WST-1实验中，细胞感染病毒后，活细胞量减少，引起吸光值明显下降，该结果与RTCA检测获得的结果是完全相同的。上述试验表明RTCA 实时细胞分析技术可实时动态和准确的检测H1N1病毒感染引起的CPE。当测试感染病毒数下降一个梯度时，CPE起始时间延迟约8h，说明病毒负荷量与CPE之间有直接的相关性。

图12. RTCA实时动态检测H1N1病毒引起的细胞CPE。（A）显微镜下检测MDCK细胞被SH37T病毒株（1:10稀释）感染24h，48h，72h后的反应情况。（B）RTCA实时动态检测SH37T病毒株感染MDCK细胞引起的效应。箭头指示在该时间点加入不同稀释梯度的病毒。（C）比色法检测SH37T病毒株（1:10稀释）感染MDCK 细胞引起的细胞CPE，A450波长处测量病毒感染24h，48h，72h后的OD值。（D）比较两类病毒株SH37T

和SH143T在相同数量下的侵染情况，红色标注线代表两类毒株感染细胞引起的细胞指数CI降到0时所需要的时间。

表3. 两类病毒株的TCID50，病毒载量及每TCID50单位的病毒载量。

另外，在病毒载量相同的情况下，病毒株不同，所引起的细胞CPE起效时间及细胞完全死亡时间也不同。例如，在病毒载量为10-1稀释浓度时，毒株SH37T感染引起的细胞全部死亡发生在37h，而毒株SH143T感染引起的细胞全部死亡发生在48h（图12D）。使用比色法TCID50检测，结果显示每TCID50单位SH37T病毒载量小于SH143T（表3），这与RTCA

获得的结果一致。上述结果表明，RTCA检测不仅可以量化H1N1病毒引起的CPE，也可检测不同菌株的感染效力。

由于RTCA实时细胞分析技术不仅能够对甲型H1N1流感引起的CPE进行准确的量化，也能定量分析血清中和抗体对CPE效应的阻断或延迟作用。本实验中，我们利用实时细胞分析技术对21个血清样本的免疫效价进行了检测。首先，将MDCK细胞接种于E-Plate检测板上，加入经SH37T病毒预处理的血清，血清稀释浓度分别选择为S0 1：40，S1 1：80，S2 1：160，每组设三个复孔，若血清浓度高于此浓度，病毒复制会被完全抑制。每组加入100 TCID50 单位的病毒载量，RTCA实时监测H1N1病毒介导的CPE，结果见图13。经S0血清处理的细胞指数很快下降为0，其作用曲线接近病毒对照组，表明S0血清稀释浓度高于20倍以上时无法抑制病毒复制。而对于S1和S2，直至血清浓度分别稀释到320倍和1280倍时才观察到细胞死亡，细胞增殖曲线接近细胞阴性对照组（图13B,C）。结果显示S1和S2中和抗体滴度分别为160和640。

图13. RTCA实时监测H1N1病毒介导的CPE。

本实验中，对21对H1N1疫苗接种前和接种后的血清样本进行检测，RTCA中和试验（NT）和传统检测方法试验（HI）同时进行。结果显示两种检测方法的抗体滴度结果的数据都呈现

出明显的统计学差异（p<0.05，威氏符号秩序检验）。且两种方法结果具有良好的相关性（Spearman相关系数，r=0.78，p<0.01）。另外，在接种后21天抗体对疫苗的免疫应答达到最大反应时计算抗体滴度值。两种检测方法无明显差异（p>0.05）。因此，RTCA实时动态NT实验结果与传统的HI实验结果是一致的，说明利用RTCA实时细胞分析技术可以准确的定量检测抗体滴度。

以上内容为大家展示了RTCA实时细胞分析技术的一部分应用领域。基于该技术无标记、实时监控、对细胞无损伤等技术优势，RTCA实时细胞分析技术无论是在药物开发研究还是基础生命科学领域都具有广泛的应用：

药物研发

● 药物毒理学分析● 环境毒理学

● 抗肿瘤药物筛选和研制● 抗肿瘤转移药物筛选和研究

● 抗肿瘤药物疗效观察● 神经营养药物的筛选和研究

● 现代中药的开发和药理机制分析● 基因诊断及药物疗效的基因学分析

● G-蛋白偶联受体相关疾病药物的筛选和研究

基础研究

● 细胞生长、分裂和死亡的机制研究● 细胞生长、分化微环境研究

● 细胞表面受体配体结合研究● 细胞生长因子的生物学功能研究

● 细胞质量控制● 基因功能研究

● 细胞粘附和细胞伸展● 受体介导的信号通路

相信艾森生物RTCA实时细胞分析技术和其一系列实时细胞动态分析仪产品的独特优势将会很大程度上解放研究者的劳动力，对细胞生物学研究带来极大的方便，和极大的飞跃。

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调

亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别

实验14-细胞凋亡的诱导和检测

实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。

形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

流式细胞仪检测技术与质量控制

流式细胞仪检测技术与质量 控制 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在

细胞凋亡的检测(含图片) 陈英玉

细胞凋亡的检测 细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。

流式细胞仪常用的几种检测方法

精品文档，放心下载，放心阅读 流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定精品文档，超值下载 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发

生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，

薄层液基细胞检测技术

薄层液基细胞检测技术(TCT)及临床意义 一，薄层液基细胞学检测技术（TCT技术）研究发展背景 薄层液基细胞学检测技术（Thin-Cytologic Test TCT），液基薄层细胞制片检查系统处理技术诞生于1991年美国等国家，率先应用于妇科细胞学检查，国内从2001年开始作液基细胞学筛查宫颈癌的研究，使该项技术得到迅速发展，被称之为一场细胞学制片技术的革命。 TCT从根本上解决了常规脱落细胞制片假阴性率高、丢失细胞率高（80%）和涂片质量差等技术难题，使宫颈癌的阳性检出率达95%以上，为脱落细胞学诊断作出了重大贡献。但是过去该技术需要国外的制片机、细胞保存液等，它的价格昂贵，在国内也只能是一些大医院才能开展该项目，在基层医院的推广则比较缓慢。后来国内的一些厂家研发了半自动的离心法制片机，并自主研发了细胞保存液，大大地降低了薄层液基细胞的制片成本，从而使该项技术易于被广大基层医院所接受并且进行推广使用。目前，它已成为筛查宫颈癌最好的推荐方法之一，为宫颈癌的早期诊断和治疗提供了非常明确的诊断依据，是一项非常值得推广应用的临床检验技术。 二，产品作用原理： 通过采集阴道或宫颈分泌物，获得脱落细胞后浸入液基细胞处理试剂中进行处理，试剂中的裂解成分能对红细胞进行裂解，去除红细胞对检验结果造成的干扰；同时试剂中的固定成分能保存固定白细胞、脱落上皮细胞等有价值的细胞；并使包裹在黏液中的有效细胞充分分离出来，防止有价值细胞的丢失。将有效细胞制备成细胞悬液，最后通过过滤离心方法清除黏液对制片的干扰，制成脱落细胞薄片。可用HE染色、巴氏染色或其他免疫组织化学染色等方法使细胞着色，再通过人工观察分析来检查阴道或宫颈的细胞形态，诊断子宫颈癌及其癌的前期变化、人乳头瘤病毒和单纯疱疹病毒感染。 三，主要开展的检查项目： 宫颈脱落细胞检查、胸腹水脱落细胞检查、尿沉渣检查、痰液脱落细胞检查、支气管刷片细胞检查。特别适用于所有的女性的宫颈癌的早期诊断。 四，TCT优点： 1、保存液试剂盒有裂解红细胞功能，能快速裂解采集样品中的红细胞，裂解能力强，裂解更完全，能去除血液对检验结果造成的干扰。 2、试剂盒含有细胞固定剂成分，能快速对样品中的白细胞、脱落上皮细胞等有检验价值的细胞进行固定保存，防止有效细胞发生自溶。经试剂盒固定保存的细胞，细胞形态完好，能保持样品采集时细胞的原始形态，不会发生膨胀、固缩等形态变化，保证检验对有效细胞的数量和质量要求。 3、试剂盒对粘液具有稀释作用，能分离出大量包埋在粘液中的有效细胞。使更多有检验价值的细胞被保存下来，提供充足的细胞数量，为检验结果的准确提供保证；同时，处理后的样品经低速离心过滤后能彻底清除样本中的粘液，有效防止粘液对样品检验结果的干扰。 4、处理过的样本经过低速离心后可制成均匀单层的细胞薄片，达到检验要求。 5、、经试剂盒处理的脱落细胞对生物染色剂具有亲和性，有利于生物染色剂着色，为诊断工作提供了方便。 6、、试剂盒使用简单，操作方便，大大节省了制备样品标本的时间，同时克服了传统检查方法的不足。 五，宫颈癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率位于女性恶性肿瘤的第二位，据相关组织公布全世界每年大约有20万名妇女死于这种疾病。近年筛查发现，发达国家发病率明显下降，而发展中国家的发病率是发达国家的6倍，我国妇女宫颈癌的发病率和死亡率占世界的1/3，可见改善卫生状况，及时就诊，早发现、早治疗极为重要。

流式细胞仪常用的几种检测方法

流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测 1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）

(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项

(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 编辑整理： 尊敬的读者朋友们： 这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。 本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项的全部内容。

常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法. 细胞凋亡检测更多详情，点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落. (2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ～1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1）。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro—apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations)的空泡结构(图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 图2

流式细胞仪检测技术与质量控制

流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，

流式细胞仪试验方法

流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病

第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。 5．其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。

细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法

细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法 一、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 四、细胞凋亡检测 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) T elemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测： 1）典型的生化特征：DNA 片段化 2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记） 4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，

关于循环肿瘤细胞(CTC)的一些认识

关于循环肿瘤细胞（CTC）的一些认识 摘要：通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell）。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临川筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。检测CTC 有着良好的应用前景，随着这一研究领域的不断发展，必将产生新的诊疗手段，从而使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。 关键词：循环肿瘤细胞；CTC；检测方法；临床意义 早在1896年，Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）的概念[1]。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。 1、概述 CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖,部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质,增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。 2、检测方法 2.1免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC） 这一检测方法基于抗原抗体结合反应的原理，利用单克隆抗体（McAb）与特异的肿瘤标记物结合，并通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。检测的肿瘤标志物主要分三类：①上皮细胞角蛋白（CK），如CK19；②上皮细胞膜特异性抗原，如黏蛋白类，包括EMA、HMFG、HEA125等；③肿瘤相关糖蛋白（TAG），如TAG12。1980年，Sloane等首次 采用ICC的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞。该方法可以进行形态学分析，但是检 测的细胞量少，敏感性只有10－4～10－5（即在1万~10万个单核细胞中发现一个肿瘤细胞），而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,故特异性不高。Braun等[2]认为由于CTC不表达白细胞共同抗原CD45，采用CD45－/CK＋双标技术可以提高ICC检测的特异性。 2.2多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 该方法的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中因癌基因、抑癌基因突变或染色体重排而产生 的DNA异常。这类基因的改变应满足以下条件：①该基因的突变在待检肿瘤中发生率较高，至少应达50％左右；②基因内发生碱基突变的部位应相对集中，如果过分分散，目前临床 应用有困难。这一方法检测肿瘤细胞的敏感性约1×10－6左右，比Southern印迹杂交法约提高10 000倍。应用PCR技术检测CTC受到缺乏肿瘤特异性和高表达标记的限制，该方法敏感度高，易出现假阳性，同时由于癌细胞的异质性亦可出现假阴性。目前多应用突变等位基因扩增（mutant allelie specific amplification, MASA）的PCR技术，检测大肠癌和胰 腺癌患者外周血中具有K-ras癌基因突变的肿瘤细胞。 2.3逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

常用的细胞凋亡检测方法

细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V 进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 一、简介 随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。 胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点：

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡的检测方法 一、细胞凋亡概念： 细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。 细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。 二、细胞凋亡的检测方法： 1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法) 在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中。 荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白V 可与暴露在质膜外侧的PS 结合，用于识别凋亡细胞。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 应用实例：以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子 2. Caspase-3活性的检测: 半胱氨酸蛋白酶caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。Caspase-3正常以酶原（32KDa ）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa ）和两个小亚基（12KDa ）组成， 图1. 使用10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞4 小时作为阳性实验组（右图），同时设置未处理组做阴性对照（左图）。使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 对以上两组细胞进行相应的实验处理，流式细胞仪进行观察。

DNA细胞定量检测分析技术

临床新项目开展申报表 项目名称：全自动DNA细胞定量检测分析技术 申报科别： 协助科室： 申报人签名： 申请日期：

申请报告 申请项目：全自动细胞DNA倍体定量分析技术 申请原因： 1. 技术优势：这是国内领先的肿瘤早期筛查技术。手工涂片的制片效果不好， 对细胞学医生的诊断准确性有很大的影响和制约；液基薄片制片技术改进了取材和制片，但是在诊断方面没有改进，在癌变前期细胞形态还没有发生改变时容易漏诊；细胞DNA倍体定量分析技术在液基薄层制片的基础上改进了诊断技术，可以通过全自动分析系统直接检测细胞DNA含量的变化，在细胞DNA含量的变化还不足以引起细胞形态变化时就能检测出早期癌变，结合人工阅片后能最大程度较少漏诊率。 2. 经济效益：细胞DNA倍体定量分析技术能够检测出更多的癌前病变，后继的 阴道镜检查、病理活检、物理治疗、药物治疗、手术治疗等将给医院带来的利润增长点。分析技术本身采用免费提供设备，供应耗材的方式，对医院来说成本极低，每月病例检测数大概在1000例左右，将为医院带来较高纯利润收入。 3. 社会效应：目前已经有北京妇产医院、北京海妇医院、上海同济医院、上海 第五人民医院、上海第七人民医院、上海奉贤中心医院、江苏省中医院、江苏省肿瘤医院、南京军区总医院、南京市妇幼医院、湖北省妇幼医院、武汉市中南医院等多家医院使用此技术，使用效果非常良好，已发现多例经确诊的早期癌变，挽救了病人的健康和家庭，给医院带来了良好的口碑和社会效应。

一、申请项目内容、国内外开展现状以及开展该项目的目的、意义及可行性分析（如果是替代已开展的技术则应说明新技术的优势所在） 该项目的现状：目前世界先进水平的全自动细胞图像分析技术借助计算机辅助，做到自动检测，即全自动细胞分析。从细胞标本自动扫描，自动调焦，自动搜索视野，逐个细胞分类、DNA含量测定、分析诊断到打印出有被检测细胞图像的诊断报告均实现自动化操作，在2钟时间内，可对上万个细胞逐个进行定量检测，其参数达125个。 该项目的目的和意义：子宫颈癌是WHO唯一建议在世界范围内开展筛查的肿瘤，可以通过简便无创的检查技术进行大规模的人群筛查。而在我国，由于对子宫颈癌的认识不够，国家医疗机构预防性的普及及筛查工作欠缺，子宫颈癌早期诊断方法比较落后，故子宫颈癌一经发现，更多患者面对的是中晚期病痛的折磨、高昂的医疗费用和生命的威胁。因此，在全国范围内开展子宫颈癌筛查，变被动就医为主动预防，可以大大减轻家庭及社会经济负担，提高广大妇女生活质量，尤其是对于贫困地区的育龄妇女，意义尤为重要。 该项目的可行性：该DNA定量分析系统设备由武汉呵尔医疗科技发展有限公司提供。该技术为目前世界领先的定量细胞学技术——全自动细胞DNA定量分析系统，己通过药监部门的审查许可，持有合法的医疗器械注册证，并已在全国多个城市开展和实施宫颈癌筛查，为宫颈癌前病变和宫颈癌早期诊断技术提供了经济实用的新方法。 二、项目使用设备 项目使用设备名称： SPICM-DNA型全自动肿瘤筛查分析系统 产地：武汉 价格： 128万 三、开展该项目的技术路线、技术难点、实施方案 技术路线：脱落细胞采集、固定、DNA特殊染色及设备的调试、校准、操作标准程序 技术难点：DNA特殊染色及设备操作