16S_rDNA鉴定细菌的方法
16S rDNA鉴定细菌的方法
细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：
1.提取细菌基因组DNA,
2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离
4.胶回收目的片段
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树
试剂：
1.1 培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。(Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)
1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。(配置方法1. 称取186.1g Na2EDTA?2H2O，置于1L烧杯中。
2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0（约20g NaOH）。注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6. 室温保存。）
1.4 10×TE Buffer(缓冲液）(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS（W/V）：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl 平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。
11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。
12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。
13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB 的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB 是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等）
14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。
15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。）
1.1细菌基因组DNA提取
基本步骤：
材料准备
破碎细胞或胞膜—内容物释放
核算分离、纯化
沉淀或吸附核酸，并去除杂质
核酸溶解在适量缓冲液或水中
基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪
细菌基因组DNA提取方法综述
细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。
1 快速微量提取法
取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。
加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37o C水浴1hr。
然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。
取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备
?用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.
?4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl
pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次。
?将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、
0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h-5h。
?用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽
提一次。（取上清液。
?乙醇沉淀DNA。
?用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干
燥后溶于适
?
O中。
当1×TE或ddH
2
3
◆细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。
◆细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上
O也行)。
清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH
2
◆菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50
μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。
（此时菌液应为透明粘稠液体）。
◆抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶
1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很
粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）。
◆沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10。
◆洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。
◆抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。
?
5 CTAB/NaCl裂解法
?接两环菌（0.75ml甘油管菌液）于25ml LB培养基中，37℃、200r/min培
养24h。
?取1.5ml菌液于1.5ml Eppendorf 离心管中，8000r/min离心5分钟,弃去
上清。
?加入1.5ml TE离心洗涤后,用567 ul TE溶解菌体,混匀。
?加入30μl 10%SDS和3 ul 20 mg/ml的蛋白酶K（100 ug/ml），混匀，于
37℃温育1h。
?加入100μl 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl,混匀,65℃
温育10分钟。
?加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)（0.8ml）,混匀,12000r/min离心5分钟,
保留上清。
?上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)(0.8ml),混
匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。
?加入0.6倍的异丙醇（0.48ml）,轻轻混合直到DNA沉淀下来
（0.5h）,12000r/min离心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min离心5分钟洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5h。
?用50 ul双蒸水溶解DNA, 加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃保存。
?用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA , 每孔点样6μl (4μl样品+ 2μl
loading buffer) , 80 V , 电泳1.5小时。
2.设计选择引物进行16S rDNA的PCR扩增
一般细菌鉴定选择通用引物，最常用的通用引物为27F/1492R。
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2.1 实验原理
2.1.1 PCR
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。
ＰＣＲ技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。
PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理
2.1.2 16SrDNA的核酸序列分析
16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。目前常用的是建立在PCR技术基础上
的16SrRNA基因的直接测序法，方便快捷。较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。其序列包含10个可变区（variable region）和与之相同的11个恒定区（constant region），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。
2.1.3 PCR法的操作过程
Step 1: DNA热变性；Step 2: 引物退火；Step 3: 引物延伸
2.2 PCR反应标准体系
?DNA模板
?引物
?反应缓冲液
?dNTP
?ddH2O
?耐热聚合酶
2.2.1 PCR反应体系各组分的作用和使用量及反应条件
ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高，以增加反应特异性。
dNTP:反应体系中达100μM～200μM。
Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。
引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。
Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。
变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。
复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应特异性的决定因素。
延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。
2.2.2 材料设备及试剂
设备：eppendorf管、微量取液器、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、PCR
仪
试剂：16SrDNA引物、细菌基因组DNA、Taq Plus、dNTP、PCR、冲液、琼脂糖、TAE电极缓冲液、Lamdar DNA/HindⅢ、染色液、加样缓冲液
2.2.3 操作步骤
PCR反应
依次混匀下列试剂
5μl 10×PCR反应缓冲液
1μl 4种dNTP
2μl 上游引物（引物１）
2μl 下游引物（引物２）
1μl 模板DNA
0.5μl Taq DNA聚合酶
38.5μl H2O
混匀后离心5秒。
扩增：用94℃变性3分钟， 94℃变性1分钟，61℃退火1分钟, 72℃延伸1分钟, 循环30轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下最后延伸5-10分钟，使反应产物扩增充分。电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物电泳结果。
3.用试剂盒做琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收目的片段
用TaKaRa DNA纯化试剂盒对PCR扩增产物纯化
4. 纯化后的目的片断送到测序公司测序
也可以直接将电泳检测后的PCR产物送到测序公司，让公司对产物进行纯化和测序
5 .BLAST比对获取相似片段。
将测序得到的16S rDNA序列在NCBI上进行blast比对，选择与比对序列相似度高的菌株。
6.构建系统进化树
将选择的序列与测序序列用DNAStar软件的MegAlign构建菌株系统进化树。
如果要测16S rDNA的全序列长度则需要对PCR产物做T-A克隆。
T-A克隆步骤：
PCR 连接转化鉴定
1.1 T-A克隆需要在PCR产物末端加A尾巴
有些PCR聚合酶可以在产物末端加A尾巴，但并不是所有的聚合酶会加A尾巴，所以在克隆之前最好搞清楚使用的酶到底是否加A，否则克隆出来的白班太少，又要讨论很久。具有3'到5'外切酶活性的高保真酶就不会产生A尾巴。
产物末端加A步骤：
用高保真酶扩增完之后，在反应管中加入0.7-1unit的Tap聚合酶。无需更换buffer 期中的dATP已经够用。
在72孵育8-10min。
立即进行纯化，沉淀、跑胶、或用纯化试剂盒。这一点相当重要，否则高保真聚合酶会将A尾巴或T载体上的T尾巴切掉。
1.2 将加A尾巴的PCR产物与T载体连接
常用的T载体有Invitrogen的T载体；Promege的pGEM-T和TaKaRa的pMD18-T。
1.3 将载体与目的片断的连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中进行液体摇床培养，涂平板进行蓝白斑挑选。
1.4 对挑选的菌落提质粒，电泳检测大小，对正确的阳性克隆的质粒进行酶切目的片断回收。
目前对于T-A克隆技可以通过T-A克隆试剂盒来完成。
细菌16S rDNA鉴定是应注意的问题和常见问题
1 细胞裂解注意事项
1.1材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低
1.2选择适当的裂解处理方式
1.3高温温浴室定时轻柔震荡
2 核酸分离纯化
2.1采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系。
2.2采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。
2.3 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。
2.4针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。
3 核酸沉淀、溶解
3.1当沉淀的时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。
3.2沉淀是加入1/10体积的NaAc(PH5.2,3M)，有利于充分沉淀。
3.3沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等。
3.4晾干DNA，让乙醇充分挥发。
3.5若长期储存建议用TE缓冲液溶解，TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase，TE缓冲液PH8.0可以防止DNA发生酸解。
4 DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应
4.1 DNA中含有蛋白，多糖，多酚类杂质：应重新纯化DNA，去除杂质。
4.2 DNA在溶解前有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：应重新沉淀DNA，让酒精充分挥发。
4.3 DNA中残留有金属离子：应增加70%乙醇的洗涤次数（2-3次）。
5 DNA提取量少
5.1 实验材料不佳或量少：应尽量选择新鲜的材料。
5.2 破壁或裂解不充分：G+菌裂解前应先用生物酶或机械方式破壁；高温裂解时，时间适当延长
5.3 沉淀不完全：低温沉淀，延长沉淀时间；加辅助物促进沉淀。
5.4 洗涤DNA时丢失：洗涤时最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。
6 DNA降解
6.1 未很好的抑制内源核酸酶的活性：可增加裂解液中螯合剂的含量。
6.2 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。
6.3 外源核酸酶污染：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。
6.4 反复冻融：将DNA分装，保存于缓冲液中，避免反复冻融。
7 反应体系对PCR扩增的影响
7.1 DNA模板：
纯度：蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应
完整性：模板降解会导致PCR扩增无产物
浓度：加量过多导致非特异性扩增增加
7.2 引物
特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体
完整性：避免反复冻融
浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少7.3反应Buffer
pH值,盐离子浓度
稳定剂,增强剂
7.4Mg 2＋浓度
过高非特异性严重
过低无扩增产物
7.4dNTP Mixture
浓度适当
避免反复冻融
7.5ddH2O
pH值适当
避免污染
8 PCR常见问题与分析
8.1 无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无
原因：
1.模板:含有抑制物，含量低
2.Buffer对样品不合适
3.引物设计不当或者发生降解
4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对策：
1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更换Buffer或调整浓度
3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4.降低退火温度、延长延伸时间
8.2 非特异性扩增
现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
原因：
1.引物特异性差
2.模板或引物浓度过高
3.酶量过多
4.Mg2+浓度偏高
5.退火温度偏低
6.循环次数过多
对策：
1.重新设计引物
2.适当降低模板或引物浓度
3.适当减少酶量
4.降低镁离子浓度
5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6.减少循环次数
16S_rDNA鉴定细菌的方法
16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高压灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 1.410×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。 13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。 15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避
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痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
细菌鉴定及检测方法
细菌鉴定及检测方法 一、启动条件 1、目的样出现坏包，若批次相同，取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴 定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。 2、随机样出现坏包，必须进行细菌初步鉴定。 二、胀包 1、记录批次。 2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒，尽量不损坏封合待以后检查。在 超净台内以无菌操作剪开包装，再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。 3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。 3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中，，分别在80和100℃的水 浴中加热10分钟，冷却用营养琼脂分别做芽孢（36±1℃、72小时） 和耐热芽孢（55±1℃、72小时）的划线培养。 3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培 养（4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时）。 3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养 （25—28℃ 5--7天） 4、对样品做感官检测。 5、用PH计检测样品的PH值。 6、将样品倒掉，进行包装密封性检查，并进行记录。 7、记录菌落特征。 8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。 8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定： 8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉 丝试验。 8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》 8.1.3氢氧化钾拉丝试验 在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾，用接种针从培养皿上的
菌落中挑取微生物，放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后，抬 起针头，观察针头和玻片之间是否有丝状物，如果15—20 秒后二者 之间无丝状物，停止搅拌。 判定：无丝状物阳性；有丝状物阴性。 8.2 过氧化氢酶试验（或过氧化氢酶试纸）（产气试验）： 试剂：10%过氧化氢溶液 步骤：在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢，用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物，放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。 判定：产气阳性；不产气阴性。 8.3氧化酶试验 试剂：含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。 步骤：用上述试剂将一张滤纸浸透（或直接采用氧化酶试纸条），然后进行细菌培养物的涂片试验。 判定：30秒内使显色物质变为深蓝色阳性，不变色阴性。 三、酸包 1、发现酸包后，及时将料液快速转入无菌瓶中。 2、记录批次 3、其它项目检测同胀包。
细菌鉴定和耐药性检测方法的发展
细菌鉴定和耐药性检测对于指导临床精确用药和及时治疗患者具有重要意义。目前临床上进行细菌鉴定和耐药检测仍以表型检测方法为主，主要包括：传统手工鉴定与药敏实验方法、自动化药敏鉴定系统。传统方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术在临床检验领域的应用，近年来发展了一系列快速细菌鉴定和（或）耐药检测技术，例如基于ＰＣＲ技术和ＤＮＡ探针杂交以及生物芯片技术等，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果。 １传统方法在细菌鉴定和耐药性检测中的应用临床手工细菌鉴定和细菌药敏实验，是临床上尤其在中小医院应用最广泛的方法。细菌鉴定主要是根据细菌对生化物质的代谢特点进行，药敏方法包括纸片扩散法（常规实验室使用较普遍）和抗生素稀释法（ＭＩＣ法）等。这些方法的特点是方便、易操作，成本低，而且灵活性强，测定的细菌和药物可灵活选择。其缺点是操作烦琐、经验依赖性强、报告结果慢，不能完全适应临床治疗的需要。 使用自动化药敏和鉴定系统，是临床微生物学实验包括体外药物敏感实验的发展方向。最有代表性的是ＶＩＴＥＫ－ＡＭＳ微生物自动分析系统，可同时完成细菌鉴定和药敏实验。该套系统的检测卡片分为１４种，每一种鉴定卡片含有２５种以上的生化反应指标，基本与常规检测鉴定相同。此方法的优点是简便、快速、鉴定范围广，受人为的影响小，可靠性高。但它仍需要细菌培养的步骤，准确性也受到一定限制，同时其耗材价格较为昂贵。使用这类仪器的主要是三级甲等以上的大型医院。在细菌快速鉴定方面最有代表性的是ｍｉｎｉ－Ｖｉｄａｓ全自动免疫分析仪，其原理是应用细菌的特异性抗体对细菌进行鉴定，以荧光为标记，进行自动化检测。其最大优点是速度快，可以在４０ｍｉｎ内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。但检测指标过少，主要限于这几种菌，而且也不能进行药敏实验。 目前，微生物鉴定技术中除了少数医院使用半自动、全自动的细菌鉴定仪外，大多数医院主要还是使用常规鉴定技术进行细菌菌种的鉴定。 ２分子生物学技术在细菌种属鉴定中的应用采用与系统发育学相关的基因实现对细菌血清型的分型，越来越成为一种趋势。目前，利用基因检测方法对细菌进行种属鉴定所涉及的基因包括细菌１６ｓｒＲＮＡ基因或５ＳｒＲＮＡ序列、ＨＳＰ基因家族、ｇｙｒＢ基因以及细菌特异基因等。 ２．１利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类依据的原因利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列对细菌进行菌种鉴定在目前应用较多，也越来越被临床所接受。在细菌分类学著作中，如《伯杰氏系统细菌学手册》，越来越倾向于选择１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类的依据。主要原因有下面几点： ２．１．１ｒＲＮＡ存在于所有生物中，在生物进化过程中其功能保持不变。１６ＳｒＲＮＡ基因普遍存在于原核生物中，在真核生物中其同源分子是１８ＳｒＲＮＡ。２．１．２１６ＳｒＲＮＡ最能反映细菌间的亲缘关系。在１６ＳｒＲＮＡ分子中，既含有高度保守的序列，又含 细菌鉴定和耐药性检测方法的发展文章编号：１６７２－３３８４（２００６）－０４－００３９－０６ 【作者】杨华为蒋迪王璨赵传赞高华方 生物芯片北京国家工程研究中心（北京１０２２０６） 【中图分类号】Ｒ９１５【文献标识码】Ｂ
细菌鉴定方法
1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999），中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》（1980）的方法。 （1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O 液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。 （2）鞭毛染色：将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染6~10min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 （3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。 （4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 （5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。 （6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。 1.2.2 培养及生理特性 （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。 （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程： 取一环标本四区划线接种平板（如为粪便标本接种SS,MAC平板） 培养18-24小时后取一区菌落革兰染色，报告为革兰阳性球菌/革兰阴性球菌/革兰阳性杆菌/革兰阴性杆菌，注意区分细菌和真菌 一般情况下不会给你们做革兰阳性杆菌和革兰阴性球菌 革兰阳性球菌鉴定流程： 先做3%触酶试验：阳性的为葡萄球菌或微球菌，阴性为链球菌或肠球菌 葡萄球菌和微球菌的区别：葡萄糖OF试验，葡萄球菌为F型，微球菌为O型 所以如果做到一个触酶阳性的革兰阳性球菌都要做下葡萄糖OF试验，DNA酶试验，新生霉素试验，血浆凝固酶试验 链球菌和肠球菌的区别：链球菌高盐和胆汁七叶苷试剂均为阴性，而肠球菌都为阳性。 链球菌属内区别：本来可以通过溶血来区分一些的，但是由于实验室的平板αβ溶血比较难区分 所以如果做到一个触酶阴性的革兰阳性球菌都要做下高盐，胆汁七叶苷，杆菌肽，奥普托欣，CAMP 如果做到一个奥普托欣敏感的革兰阳性球菌再加做胆汁溶菌试验和菊糖试验（阳性为变红）可判定为肺炎链球菌 革兰阴性杆菌鉴定流程： 先做氧化酶试验： 氧化酶阴性的革兰阴性杆菌都要做下KIA，MIU，葡磷两支(做MR，VP)，苯丙，枸橼酸盐，硝还，蛋白胨水（做吲哚试验），赖氨酸，鸟氨酸，氨对 如果KIA结果为A/A或者K/A的应为肠杆菌科细菌，如上面向个反应还不能区分细菌到种根据教科书307页加做试验。 一般情况下只会给你们做大肠埃希菌，志贺菌属（四种），沙门菌属（甲副，乙副，伤寒），弗劳地枸橼酸杆菌，肺炎克雷伯，产酸克雷伯，产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，普通变形杆菌，奇异变形杆菌，沙雷菌属，摩根菌属，普罗威登斯菌属。 如果KIA结果为K/K应怀疑为不动杆菌属或者嗜麦芽窄食单胞菌：这两个菌区分可通过麦芽糖和赖氨酸试验区分， 如为氧化酶阳性，要做葡萄糖的OF试验（用非发酵），硝还产气，精氨酸双水解酶，一般情况下只有两种菌给你们做一个是铜绿假单胞菌，一个是粪产碱杆菌， 真菌给你们做的一般情况只有白色念珠菌和新生隐球菌，通过墨汁负染，芽管试验，厚膜孢
细菌鉴定学习
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】
菌种保藏中的细菌鉴定方法
万方数据
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菌种保藏中的细菌鉴定方法 作者：杜昕波， 赵耘， 李伟杰， DU Xin-bo， ZHAO Yun， LI Wei-jie 作者单位：中国兽医药品监察所,北京,100081 刊名： 中国兽药杂志 英文刊名：CHINESE JOURNAL OF VETERINARY DRUG 年，卷(期)：2009，43(3) 引用次数：0次 参考文献(6条) 1.兽医微生物学 2005 2.医学微生物学实验技术 2006 3.程池.杨梅.李金霞.姚粟.胡海蓉Biolog微生物自动分析系统--细菌鉴定操作规程的研究[期刊论文]-食品与发酵工业 2006(5) 4.杜昕波.赵耘.李伟杰.康凯.陈敏.张媛利用BIOLOG系统对不同种类细菌鉴定的研究[期刊论文]-中国兽药杂志2008(9) 5.原核生物系统学 2007 6.常见细菌系统鉴定手册 2001 相似文献(8条) 1.学位论文杜蓉分枝杆菌分枝菌酸的反相高效液相色谱分型鉴定技术方法研究与应用2008 结核病具有高流行性和高传染性，至今仍是一个严重的公共卫生问题。WHO已将结核病作为重点控制的传染病之一，据估计全球约有1/3的人感染结核菌，每秒有1个新增病例（WHO，2006年）。分枝杆菌在微生物分类中属于放线菌目、分枝杆菌科，临床主要致病的是结核分枝杆菌（MTB），此外还有非结核分枝杆菌（NTM），NTM所引起的结核样病变与结核临床表现相似，但治疗方案和抗药性根据不同种属有所不同。因此对分枝杆菌做出及时准确的分型鉴定、检测对控制结核病疫情具有十分重要的现实意义。 分枝菌酸（MA）是一类高分子量的含有α-支链、β-羟基脂肪酸的化合物，是所有分枝杆菌细胞壁脂质的主要组分，其脂肪酸上碳链的长度、不饱和状态、官能团及其含量与生物种型有关，且各生物种型之间MA呈现指纹特征。 本论文的目的是通过采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析比较样品中MA之间的差异，建立快速灵敏准确的分枝杆菌种间分型鉴定的HPLC标准方法，并构建分枝杆菌标准菌株的MA指纹谱库，为分枝杆菌的分型鉴定提供了重要的技术方法和谱库数据补充。全文分为四章： 第一章前言，简要介绍了分枝杆菌分型鉴别及检测方法的研究现状和存在问题，尤其介绍了HPLC方法的应用。并在此基础上提出了本论文的研究目的和研究内容。 第二章建立了以甲醇和二氯甲烷为流动相的梯度洗脱RP-HPLC法。分枝杆菌经过接种、培养、皂化、酸化及衍生化后，采用RP-HPLC进行分析，建立了快速灵敏准确的分枝杆菌种间分型鉴定的RP-HPLC标准方法。 第三章采用第二章所建立的方法，构建了49种《伯杰细菌鉴定手册》中所载入的分枝杆菌标准菌株（来源于ATCC（美国标准菌种收藏中心））的MA指纹谱库。通过对各个谱图进行详细分析，依据峰的分布特点可将其分为单簇（14种）、双簇（23种）、三簇及多簇（12种）三类，而后根据相对保留时间和相对峰高比的比例进行种间水平鉴别。此法成功鉴别了41种分枝杆菌（其余8种难以采用此法准确鉴别），对于难以鉴别的部分菌种尝试采用GC法对其进行进一步分型鉴别。 第四章在完成第二、三章工作的基础上，使用所建立的方法亦测定了大量来源于DSMZ（德国菌种保藏中心）的分枝杆菌（包含未收录入《伯杰细菌鉴定手册》的菌种）的MA 指纹图谱，为分枝杆菌的分型鉴定提供了重要的技术方法和谱库数据补充。 2.期刊论文程池.杨梅.李金霞.姚粟.胡海蓉.Cheng Chi.Yang Mei.Li Jinxia.Yao Su.Hu Hairong Biolog微生物自动分析系统--细菌鉴定操作规程的研究-食品与发酵工业2006,32(5) Biolog微生物自动分析系统是美国Biolog公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统,以细菌对微平板上95种碳源的利用情况为基础从而进行微生物鉴定.目前我国已经累计引进100余台,但使用率较低.文中在总结实践经验的基础上,参阅最新Biolog系统操作手册4.2版和国家微生物资源平台技术规程的统一格式,研究制定了细菌鉴定的操作规程,以规范系统使用,获得准确鉴定结果,尽快提高我国Biolog系统的应用水平. 3.学位论文刘晗黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性2006 寡糖及糖缀合物广泛的存在于生命体内，是重要的信息物质，参与多种生命活动。寡糖由于结合位置和结合类型的不同，种类繁多，有着多种重要的生物活性。黄原胶是人类研究最为透彻、商业化应用程度最高的由微生物分泌的胞外多糖，而关于其降解产物——黄原胶寡糖是否拥有某种生物学活性，至今少见报道。 首先，本文对一株从野外筛选到的分泌黄原胶酶的菌株进行了鉴定，根据该菌株形态特征、生理生化特征，对照《伯杰细菌鉴定手册》，初步确定它属于鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)。16SrRNA序列测定结果也支持这一结论。该菌已保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCCNO.1421)。 其次，通过对Sphingomonassp.XT-11发酵条件的研究，筛选出有利于产酶的各实验因子的适宜水平。结果表明，酶形成的适宜温度为30℃，培养基适宜起始pH值为7.0，培养基适宜底物浓度为1﹪，摇瓶发酵用250mL三角瓶装液30mL酶活力较高。适宜种龄为16～24h，接种量对发酵影响不大。 再次，对黄原胶寡糖在抗氧化、抑制皮肤浅部真菌、植物诱抗、抑制ACE方面的生物学活性进行了探索，发现粗酶液降解得到的粗黄原胶寡糖拥有较强的抗氧化能力，而对ACE则没有抑制作用；黄原胶寡糖还拥有了较强的抗皮肤浅部真菌活性以及一定的植物诱抗活性。 最后，对鞘氨醇单胞菌XT-11红细胞凝集活性进行了研究。发现该菌悬液能凝集2种血红细胞。菌悬液对兔红细胞的凝集可以被肝素所抑制。其凝集活性不依赖于Ca2+；在pH为6.0～10.0范围内较稳定；它的凝集活性在60℃时完全丧失。 4.期刊论文张海燕.贺江舟.龚明福.刘占文.张利莉.Zhang Haiyan.He Jiangzhou.Gong Mingfu.Liu Zhanwen. Zhang Lili利用菌落PCR-DGGE快速鉴定盐渍土壤菌种多样性-塔里木大学学报2007,19(4) 利用菌落PCR方法,结合DGGE的检测方法,对所保存的87份盐生菌的培养物进行了多样性检测,初步研究显示至少有31株不同的菌种,表明新疆盐生环境存在较为丰富的菌种资源,同时表明菌落PCR结合DGGE技术为细菌鉴定和菌种保藏过程中重复菌株的去除提供了一种快速可靠的手段. 5.学位论文陈接锋产聚β-羟基丁酸球衣菌分离筛选及发酵和提取的研究2003 球衣菌是活性污泥中的主要丝状菌,对污水中的有机物和有毒物质有很强的降解能力,而且胞内也能积累相当量的PHB,已逐渐受到重视,因此,该文详
菌种保藏中的细菌鉴定方法
菌种保藏中的细菌鉴定方法 作为科研生产中最重要的基础性资源—菌毒种,其收集、保藏及相关的研究工作在我国正处于整理、整合以及全方面逐步正规化阶段.2003年7月23日,科技部在北京召开了“国家科技基础条件平台建设”部际联席会和专家顾问组成立大会,正式启动了国家科技基础条件平台建设工作.国家自然科技资源共享平台建设作为其中的一个重要组成部分同步启动.作为该项8的一个重要组成部分,微生物菌种资源整理、整合工作同期启动,在此项工作中,中国兽医药品监察所承担了兽医微生物资源整理、整合工作.本所在行业内发展了数家加盟单位,在整理、整合菌种资源的过程中遇到了一些实验室细菌鉴定结果出现偏差的问题.经分析调查,多是由于实验室人员结构以及实验室的硬件水平差别较大等原因,造成实验室间鉴定能力的参差不齐,致使鉴定项目完成情况不尽相同,细菌鉴定结果出现偏差. 细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定.而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定.系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型(群).目前菌种保藏机构通常使用的细菌鉴定方法大致有以下几种: 1、传统方法 常规宏观菌落形态学观察,主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况:细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色是否均匀一致,菌落个体表面及边缘的生长状况;在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况;半固体上穿刺接种后,观察细菌是否沿着接种线生长以及其生长状态是呈毛刷样生长还是均匀生长,上下生长是否一致.在鉴别培养基上培养,观察结果是否跟预期结果相同. 细菌的个体形态学观察,即通过显微镜观察.观察前细菌需要着色,要根据预先确定的观
菌种保藏中的细菌鉴定方法
菌种保藏中的细菌鉴定方法 杜昕波,赵耘,李伟杰 (中国兽医药品监察所,北京 100081) [收稿日期]2008211211 [文献标识码]A [文章编号]100221280(2009)0320050203 [中图分类号]S852.61 [摘 要] 综述了在菌种保藏工作中目前行业内使用的各种细菌鉴定方法,包括传统方法、仪 器的自动化鉴定以及分子生物学方法,并简述了各种方法的原理和优缺点,以期能为行业同仁更 好开展菌种保藏、鉴定工作提供帮助。[关键词] 菌种保藏;细菌鉴定;传统方法;仪器自动化鉴定;分子生物学方法 基金项目:自然科技资源平台项目(2005OK A212053) 作者简介:杜昕波(1980年-),研究实习员,大学本科,从事细菌鉴定及方法研究和制备工作。E -mail:duxinbo@ivdc .g ov .cn 通讯作者:赵耘,主要从事病毒、细菌鉴定及检测方法研究及其防治工作。E -mail:zhaoyun@ivdc .gov .cn M ethods of Bacter i a l I den ti f i ca ti on i n the Program of Culture Collecti on DU Xin -bo,ZHAO Yun,L IW ei -jie (China Institute of Veterinary D rug Control,B eijing 100081;China ) Abstract:This paper revie wed vari ous methods of bacterial identificati on in the p r ogra m of culture collecti on t oday,including traditi onal methods,aut omatic m icr obi ol ogy analysis syste m and method of molecular bi ol ogy .It als o su mmarized the funda mental p rinci p le,relative merits of the above -menti oned methods s o as t o p r ovide aid for executing above -menti oned work . key words:culture collecti on;bacterial identificati on;traditi onal method;aut omatic m icr obi ol ogy analysis syste m;method of molecular bi ol ogy 作为科研生产中最重要的基础性资源———菌毒种,其收集、保藏及相关的研究工作在我国正处于整理、整合以及全方面逐步正规化阶段。2003年7月23日,科技部在北京召开了“国家科技基础条 件平台建设”部际联席会和专家顾问组成立大会,正式启动了国家科技基础条件平台建设工作。国家自然科技资源共享平台建设作为其中的一个重要组成部分同步启动。作为该项目的一个重要组成部分,微生物菌种资源整理、整合工作同期启动,在此项工作中,中国兽医药品监察所承担了兽医微生物资源整理、整合工作。本所在行业内发展了数家加盟单位,在整理、整合菌种资源的过程中遇到 了一些实验室细菌鉴定结果出现偏差的问题。经 分析调查,多是由于实验室人员结构以及实验室的硬件水平差别较大等原因,造成实验室间鉴定能力的参差不齐,致使鉴定项目完成情况不尽相同,细菌鉴定结果出现偏差。 细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定。而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定。系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准 ?05? 中国兽药杂志 2009,43(3):50～52/杜昕波,等
菌种鉴定常见问题解答
菌种鉴定常见问题解答 1.菌种鉴定的方法和步骤是什么？ 菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon对比即可。一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）。 -----消息来源：百度问答 . 2. 微生物的菌种鉴定可以鉴定到“株”一级吗？ 如果你的菌株是自然界中分离得到，就只能鉴定到种，不能鉴定到株，因为多多少少和其他株系的细菌有区别，即便你做了一些特征的鉴定，发现和某一株细菌一模一样，你也没有理由说你的细菌就是那一株细菌，因为你不可能把所有的特征都做完，株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系，世界上不可能有完全相同的两个人。除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的（而且要保证没有变异，否则就是一个新株），可是这样就没必要鉴定了。 -----消息来源：百度问答 3．为什么鉴定出来的菌种跟我想象的相差太大？ 答：我们菌种鉴定使用PCR直接扩增的方法，即以客户提供的菌株为模版直接进行PCR扩增，中间不经过传代培养，因此不会引入新的污染，如果出现结果不一致的情况，一般有以下原因导致： 1、您提供的样品未经过三次分离纯化，含有其他杂菌； 2、您提供样品的真实情况确认如此。 建议您提供三次纯化的菌株重新进行鉴定。 4．为什么有时会出现PCR扩增不出的现象； 答：扩增不出的原因主要有以下几种： 1、您提供的菌种从严格意义上讲不是细菌或者真菌，或者是信息有误； 2、您提供的菌种为革兰氏阳性菌，由于细胞壁较厚，采用常规方法不能有效地破壁； 3、培养基或菌体中表达产物含有抑制PCR产物的组份。 对于第二种或第三种情况需要提供基因组DNA。 5．PCR扩增直接测序为什么会出现套峰的现象； 答：1、测序结果个别碱基出现N，是由细菌rDNA多态性造成，对菌种鉴定没有无影响； 2、所有测序反应均出现大面积套峰，是由于您提供的样品模版不纯造成的。这种情况需要重新纯化菌种。 6．PCR产物克隆测序为什么会出现结果分离的现象？ 答：我们以菌种为模版直接进行PCR扩增，然后对PCR产物进行克隆测序，如果出现2种或以上的测序结果，说明您提供的模版不单一，即菌种不纯，含有其他杂菌，这种情况建议您将菌种重新进行三次以上纯化。 7．菌种鉴定可以鉴定到种吗？ 答：利用rRNA的保守区域进行鉴定只是菌种鉴定的一个分子生物学指标，通过鉴定结果可以了解未知菌株和NCBI公布序列的哪个种属比较接近。
细菌的生理生化鉴定方法
方法 2.3.5 细菌的生理生化鉴定 １、形态学观察 采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。用革兰氏染色进行油镜观察。 ①革兰氏染色 溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番红复染液等。 试验步骤：(1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。 (2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。 (3) 媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。 (4) 脱色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液（一般20～30s），当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。 (5) 复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，用吸水纸吸去残水晾干。 (6) 镜检：用油镜观察。 ②芽孢染色 (1) 制片：按常规方法涂片、干燥及固定。 (2) 加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min，加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸。 脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色。 (3) 复染：用0.5%番红水溶液复染2min。 (4) 水洗：用缓流自来水冲洗至无色。 (5) 镜检：晾干载玻片后油镜镜检。 ③鞭毛染色（硝酸银染色法）
(1) 载玻片准备：将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸20min，然后用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。 (2) 菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌悬液，不能剧烈震荡。 (3) 制片：取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片，使菌悬液流向另一边，用吸水纸吸取多余的菌悬液，自然干燥。 (4) 染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。 (5) 镜检：用油镜镜检观察。 A、B液需现用现配（4h内效果最佳，1d内可用）： A：单宁酸5ｇ，三氯化铁1.5ｇ，蒸馏水100mL，加1%氢氧化钠1mL，15%甲醛2mL。 B：硝酸银粉末2ｇ，水100mL，溶解匀均，取出10mL回滴用，往90mL 溶液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。加10mL回滴液回滴至出现薄雾。 ２、糖类分解试验 配方：蛋白胨 1.0ｇ；NaCl 0.5ｇ；0.2%溴百里香酚兰 1.2mL；葡萄糖 1.0ｇ；蒸馏水100mL。 基本原理：糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应，鉴定细菌能否利用分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氨气、甲烷、二氧化碳等）。当发酵产酸是，指示剂可有紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的小管中有无气泡来证明。 试验步骤：用记号笔在试管外面分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌的编号。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管，按编号接种细菌，每种细菌做两个平行，可留一个空白，作为对照。在接种后要轻摇试管，防止倒置的小试管进入气泡。再将将上述已接种的和对照管置37℃温室中培养2～3d。观察颜色变化及小试管中有无气泡。
病原细菌的分离与鉴定
病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可
细菌分离及鉴定的实验方案
从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料：新鲜土壤。 a)培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号培养基；马铃薯蔗糖培养基； 细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培 养基；LB培养基 b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c)仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液 管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无 菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等 相关培养基的配方:
1.1实验总流程 1土壤取样：
2制备土壤稀释液： 2.1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 3.2吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。 细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得 4分离 4.1配置LB培养基
肠道致病菌的分离与鉴定
肠道致病菌得分离与鉴定 一、实验目得 （1）掌握肠道致病菌得分离、鉴定得主要步骤 （2）掌握平板划线分离法 （3）掌握玻片凝集试验得操作方法以及实际意义 二、实验材料 （1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（EMB）、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 （1）肠道致病菌得分离 ①待测标本得制作：把接种环放置于点燃得酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌得接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水得试管中，混匀。 ②细菌得分离接种：用接种环取适量配置好得细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。 （2）肠道致病菌得纯化 ①单菌落接种：从已培养待测细菌得EMB培养基上用已灭菌得接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。 ②待测细菌得初步判断：取出已纯化培养待测细菌得KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌就是致病菌或就是非致病菌。
（3）肠道致病菌得鉴定 ①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内得小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌得接种针取已培养得KIA培养基上得培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ②动力检查：用已灭菌得接种针取KIA培养基上得培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌得接种环分别取KIA培养基上得培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧得酒精灯附近进行实验操作。 四、实验结果与分析 （1）EMB培养基现象与分析： ①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中得物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与