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精子形态学分析

精子形态学分析

正常形态精子百分率是评价精子受精能力的重要指标之一。目前,用于精子形态学分析的染色方法有:改良巴氏染色法、苏木精-伊红(HE)染色法、瑞氏染色法、瑞-吉氏染色法、Diff-Quik染色法和Shorr染色法。

1 涂片的制备

一般用新鲜的液化精液或生理盐水洗涤过的精子悬液进行涂片,通常每份标本涂双份片子,以备染色或操作出问题。载玻片应洁净,可用70%酒精洗涤并干燥后使用;涂片的厚薄应根据精子密度而定,精子密度高者涂片应薄些,而精子密度低者涂片应尽可能厚些。涂片的方法有多种,WHO推荐的方法有拉薄技术和滴管法,拉薄技术即用另一张载玻片的边缘拖拉载玻片上的一滴精液;滴管法即水平持滴管使一滴精液沿载玻片的表面展开。由于精液有一定粘稠度,这两种方法都很难涂成均匀的涂片。可建议用以下方法涂片:用滴管将一滴精液置于载玻片上,然后从液滴中央向周围循环吸净多余的精液,注意滴管的头要平整,滴管与载玻片垂直,缓慢吸去多余的液体。低密度、粘稠的、或充满碎屑的标本,建议先离心去除精浆,沉淀的精子团重新悬浮在适当体积中,以获得尽可能高的密度,但不应超过80×106/ml。正常精子密度且液化良好的精液标本亦可以洗涤后用精子悬液进行涂片,但离心操作对精子形态分析有无影响,尚需要进一步验证。

精子涂片可进行空气干燥并固定。固定程序取决于染色方法。

2 改良巴氏染色法

这是WHO手册推荐的方法。它可以使精子和其他细胞很好地染色,可使精子头部的顶体和顶体后区、胞浆小滴、中段和尾部着色。染液中的俾士麦棕为盐基性染料,伊红、亮绿、橙黄等为酸性染料,能与细胞中具有相反电荷的蛋白质结合,而染成各种不同的颜色,从而能清楚地区分各种细胞成分。以往用巴氏染色法进行染色时,操作步骤繁琐,目前已有改良的单一的巴氏染色液出售,操作非常简单,只需在自然干燥的精子涂片上滴加1~2滴巴氏染液,染15分钟即可。流水冲洗后自然晾干,显微镜油镜下观察精子形态。

3 HE染色

带正电荷的碱性染料苏木素能与细胞核中带负电荷的核酸结合而使核染成紫蓝色,伊红为酸性染料,能与细胞质中具有相反电荷的蛋白质结合,使胞质呈红色。HE染色为医院病理科的常用染色方法,操作比较繁琐,对于可以借助病理科染色的医疗单位可以选用此法对精子进行染色。

4 瑞氏和瑞-吉氏染色法

瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料,细胞染色后可用于观察内部结构;吉氏染料是由天青、伊红组成的染料,天青对细胞核着色较好,结构显示更清晰。因此,瑞-吉氏染色法比瑞氏染色法效果稍好些,两种染液均可自行配制或购买,操作都比较简单。

①瑞氏染液:取瑞氏染料0.1 g放入清洁干燥的研钵中,边加少量甲醇边磨至染料完全溶解,加甲醇到60 ml,倒入棕色瓶中,室温下放置1周以后即可用。②Giemsa染液:取Giemsa 染料0.5 g,置于33 ml甘油中,60℃水浴2小时,使其溶解,再加入60℃预热的甲醇33 ml,混匀后置棕色瓶中,室温下放置数周后方能使用(最好放置半年以上)。③30.1 mol/L pH6.9磷酸盐缓冲液:称取NaH2PO4?2H2O 1.4 g、Na2HPO4?12H2O 3.94 g,加蒸馏水至100 ml。染色时,将单独瑞氏染液或瑞氏∶吉氏(10∶1)混合染液滴加于精子涂片上,静置10秒后,滴加等量pH6.9磷酸盐缓冲液,染色10分钟后自来水冲洗,自然干燥,置于油镜下观察。

5 Shorr染色法

精子涂片空气干燥后,用苏木精染色1~2分钟;流水浸洗后置42℃温水中蓝化5分钟(或浸入乙醇铵中蓝化);Shorr染剂(BDH Shorr粉4 g溶于220 ml 50%温乙醇中,冷却,加入

2.0 ml冰醋酸,过滤即可)染3~5分钟;流水冲洗,晾干后镜检。

6 Diff-Quik染色法

精子涂片先置于固定液(1.8 mg二芳基甲烷加至1 L甲醇中而成)中固定5分钟;将玻片直立于吸水纸上以去除多余的液体;将玻片在溶液1(1 g氧甲蒽加至1 L叠氮钠防腐液中)中染色10秒钟,然后在溶液2(0.625 g天蓝A和0.625 g亚甲基蓝加至1 L缓冲液中)中染色5秒钟,各步骤之间均除去多余的液体;在流水中浸洗10~15次以除去多余的染料;将玻片垂直竖立以去除水分,使之完全干燥;显微镜下观察。

7 六种染色方法的评价

目前使用的精子形态学分析的6种方法,对精子头大小的影响不同,瑞-吉氏和瑞氏染色法的精子头的长轴和短轴最高,其次为Diff-Quik染色法,它们均显著高于其他三种染色方法,可能与精子头发生肿胀有关;巴氏染色法的精子头的长轴和短轴最低,而HE和Shorr染色法的精子头长轴和短轴介于巴氏染色法和Diff-Quik染色法之间。不同染色方法对精子头大小产生显著影响的原因尚不清楚,可能与不同化学物质的特性和不同染色液的渗透压等有关。6种精子染色方法的染色效果亦不同,Diff-Quik和Shorr染色法可以很清楚地区分顶体和核,其次为HE染色法,而巴氏、瑞氏和瑞-吉氏染色的精子顶体和核分界不很明显。基于不同染色方法对精子头大小的影响、染色效果以及操作的简易与否,Diff-Quik和Shorr 染色法值得推荐。

目前,评估精子形态学的标准有:一般标准,正常生育男性精液中正常形态精子比例应大于30%;严格标准,正常生育男性精液中正常形态精子比例应大于10%。

在评估精子正常形态时,应采用严格标准。只有头、颈、中段和尾部都正常的精子才正常。精子头的形状必须是椭圆形的。考虑到固定和染色所致的轻度收缩,精子头部长度为4.0~5.0 μm,宽为2.5~3.5 μm,长宽之比应在1.50~1.75之间。这些范围是巴氏染色精子头部测量值的95%可信区间范围。顶体的界限应是清晰的,占头部的40%~70%。中段应细,宽度<1 μm,大约为头部长度的1.5倍,并且在轴线上紧贴头部。胞浆小滴应小于正常头部大小的一半。尾部应是直的、均一的,比中段细,非卷曲的,其长约为45 μm。这个分类标准,要求将所有形态学处于临界状态的精子均列为异常。利用这些分类标准,可得到对体外受精有价值的精子形态学方面的数据。

精子形态学观察时,应注意下列精子缺陷的类型:

①头部缺陷:大头、小头、锥形头、梨形头、圆头、无定形头、有空泡的头(未染色的空泡区域占头部的20%以上)、顶体过小的头(小于头部的40%)、双头以及上述缺陷的任何组合。

②颈部和中段的缺陷:颈部“弯曲”(颈和尾形成的角度大于头部长轴的90%)、中段非对称地接在头部、粗的或不规则的中段、异常细的中段(即无线粒体鞘)和上述缺陷的任何组合。

③尾部缺陷:短尾、多尾、发卡形尾、尾部断裂、尾部弯曲(>90度)、尾部宽度不规则、尾部弯曲或上述缺陷的任何组合。

④胞浆小滴大于正常精子头部的一半。此小滴通常位于中段。

只有带有尾部的可辨认精子,才考虑进行不同形态精子计数;未成熟精子细胞包括圆形精子

细胞阶段,不能作为精子进行计数。精子头脱落或无精子头的不作为精子计数,无尾精子亦不作为头部缺陷计数,但应分开记录。卷尾的精子可能与精子活力低相关,或提示精子已暴露于低渗透压。偶尔,许多精子可能有特异的结构缺陷,例如,顶体发育失败,导致“小圆头缺陷”或“球形精子症”。

精子形态分析要求在100×的油镜亮视野下进行计数,应系统地选择涂片上多个区域进行形态学的评估。不应评估重叠的精子和头部位于边缘的精子,后者可通过上下调整焦距加以识别。用目镜上的微标尺测量精子的大小是必要的。应至少连续计数200个精子(一次计数200个优于两次计数100个)。当病人的诊断和治疗主要依赖于正常形态精子的百分比时,应计数两次200个精子,以增加精确性。

(九)精子凝集

精子凝集是指活动精子以不同方式,如头对头、头对尾、尾对尾或混合型,彼此粘在一起。不活动精子之间、活动精子与粘液丝之间、非精子细胞成分或细胞碎片等粘在一起,为非特

异性聚集而非凝集,这种情况应如实记录。

凝集的存在可能提示,但不足以说明不育是免疫因素引起的。凝集在测定精子活动力时评估。精子凝集的类型应当记录,如头对头、尾对尾或混合型。可采用一种半定量的分级方法:从没有凝集到所有可动的精子凝集到一起(+++)。

三计算机辅助的精液分析

手工精液分析往往带有很大的主观性,不同的技术人员分析的结果有时相差甚远,对精子运动能力的判断缺少严格的量化指标。计算机辅助的精液分析(computer-aided semen analysis,CASA)是80年代发展起来的新技术,现已逐步应用于男科实验室常规分析。CASA 具有客观、高效、高精度的特点,尤其能分析与精子运动功能相关的多种参数。CASA系统识别精子是根据人为设定的大小和灰度来判断的,准确性受精液中细胞成分和非细胞颗粒的影响。计算精子活动率时,精子只有产生了一定的位移,CASA系统才认为是活动精子,而对原地摆动的精子则判为不活动精子,测出的值低于实际结果。CASA系统参数的设置、阈值的设定、视屏取像率等都可以影响最终结果。CASA对精子密度有一定的限制,在(20~50)×106/ml范围内检测结果较理想。精子密度过高时,标本需要适当稀释,一般采用同份精浆标本稀释。精子密度过低时应多选几个视野采样。随着软件系统的不断改进,目前新的CASA 系统可检测较大精子密度范围的精液标本。用于CASA系统的精子计数板有Macro计数板、Makler板、MicroCell计数池、Cell-VU等。由于CASA系统的设置缺乏统一的国际标准,不同厂商和型号的CASA分析结果可比性差,尤其是分析精子密度和活动率。因此,建立标准化的CASA操作系统很有必要。

CASA系统用于分析精子运动能力有一套术语:①轨迹速度(VCL):也称曲线速度,即精子头部沿其实际行走曲线的运动速度。②平均路径速度(V AP):精子头沿其空间平均轨迹的运动速度,这种平均轨迹是计算机将精子运动的实际轨迹平均后计算出来的,可因不同型号的仪器而有所改变。③直线运动速度(VSL):也称前向运动速度,即精子头部直线移动距离的速度。④直线性(LIN):也称线性度,为精子运动曲线的直线分离度,即VSL/VCL。

⑤精子侧摆幅度(ALH):即精子头实际运动轨迹对平均路径的侧摆幅度,可以是平均值,也可以是最大值。不同型号的CASA系统由于计算方法不一致,因此相互之间不可直接比较。⑥前向性(STR):也称直线性,计算公式为VSL/V AP,即精子运动平均路径的直线分

离度。⑦摆动性(WOB):即精子头沿其实际运动轨迹的空间平均路径摆动的尺度,计算公式为V AP/VCL。⑧鞭打频率(BCF):也称摆动频率,即精子头部跨越其平均路径的频率。

⑨平均移动角度(MAD):即精子头部沿其运动轨迹瞬间转折角度的时间平均值。⑩运动精子密度:每毫升精液中V AP>0 µm/s的精子数。这些参数可综合反映精子的运动状况,在评价精子获能和顶体反应中也有一定意义。

CASA系统一般包括下列几个部分(图4):①相差显微镜、恒温装置和专用计数板(Makler 板、Macro板或Microcell计数池等)组成的摄像系统。②高速、高分辨率的摄像机和电视监视器组成的摄像系统。③计算机分析处理系统及打印机打印输出。

不同厂家不同型号的CASA系统应根据其说明书具体操作。