苹果锚蛋白基因ANK家族生物信息学鉴定分析

园艺学报 2013，40（6）：1021–1032 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@https://www.wendangku.net/doc/9e7137007.html, 苹果锚蛋白基因ANK家族生物信息学鉴定分析

许瑞瑞1，张世忠2，宿红艳3，刘春香1，曹慧1,*，束怀瑞2,*

（1潍坊学院生物与农业工程学院，山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室，山东潍坊 261061；2山东农业大学园艺科学与工程学院，国家苹果工程技术研究中心，作物学国家重点实验室，山东泰安 271018；3鲁东大学，山东烟台 264025）

摘 要：利用生物信息学方法对苹果ANK基因家族成员及分类鉴定，同时对其染色体定位、系统进化关系及芯片表达特性进行了分析。苹果MdANK家族包含351个基因，根据蛋白结构域差异分为16个

类别，ANK-M类型最为庞大，有143个ANK蛋白；苹果的17条染色体均有ANK家族基因分布，其中

第2条染色体上分布最多，有36个ANK基因。MdANK编码的蛋白在72 ~ 2 429个氨基酸范围内，等电

点在4.30 ~ 11.13之间。芯片分析发现，在苹果果实成熟时期及砧木接穗互作过程中，多数MdANK基因

的表达都有不同程度变化。

关键词：苹果；ANK；基因家族；生物信息学

中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）06-1021-12 Bioinformatics Analysis of ANK Gene Family in Apple

XU Rui-rui1，ZHANG Shi-zhong2，SU Hong-yan3，LIU Chun-xiang1，CAO Hui1,*，and SHU Huai-rui2,*（1College of Biological and Agricultural Engineering，Weifang University，Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology in Universities of Shandong，Weifang，Shandong 261061，China；2College of Horticulture Science and Technology，Shandong Agricultural University，National Research Center for Apple Engineering and Technology，Tai’an，Shandong 271018，China；3Ludong University，Yantai，Shandong 264025，China）

Abstract：ANK（ankyrin repeat）containing proteins comprise a large protein family，which play important roles in plant growth， development，and signal transduction，no ANK genes have been reported in apple. In this study，MdANK gene family，gene classification，chromosome location，sequence alignment，conserved structure domains and expression profiles of MdANKs were predicted and analyzed with bioinformatics methods，alignment of amino acid sequences and phylogenetic analysis. The results showed that MdANK family contained 351 genes，which was further divided into 16 types and the largest group is the ANK-M type contains 143 proteins. Phylogenic analysis revealed that MdANK genes in apple could be divided into 15 subfamilies（from A to O）according to the phylogenetic analysis tree by MEGA 5.

A total of 112 MdANK genes were mapped to 17 chromosomes，whereas 22 MdANK genes were not mapped to any particular chromosome. For example，Chr 2 encompasses the largest number of 36 MdANK genes，while the lowest number（Chr 6，7 and 8）contained 6 MdANK genes. MdANK proteins contained

收稿日期：2012–12–24；修回日期：2013–05–27

基金项目：国家自然科学基金项目（31000307）；山东省优秀中青年奖励基金项目（BS2010NY004）；山东省自然科学基金项目（Y2007D60，ZR2009DQ003）；潍坊学院博士科研基金项目（2012BS15）

* 通信作者Author for correspondence（E-mail：hrshu@https://www.wendangku.net/doc/9e7137007.html,；hui5232@https://www.wendangku.net/doc/9e7137007.html,）

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from 72 to 2 429 amino acids and the isoelectric point is from 4.30 to 11.13. Expression analysis showed that the expression levels of most MdANK genes were altered during the ripening process and rootstock-scion interactions process. Our data will provide very useful information for cloning and functional analysis of members of this gene family in apple.

Key words：apple；ANK；gene family；bioinformatics

锚蛋白重复序列（ankyrin repeat，ANK）是生物体广泛存在的一类蛋白结构。ANK最早在酵母细胞周期调节因子Swi6/Cdc10及果蝇信号蛋白中发现（Breeden & Nasmyth，1987），随后在蛋白骨架中发现24个氨基酸残基的ANK序列（Lux et al.，1990）。典型的锚蛋白重复序列由33个氨基酸残基组成，数量不等的ANK单元串联起来，形成大的ANK结构域。大部分ANK蛋白的功能与蛋白互作相关（Michaely & Bennett，1992；Bork，1993），并在不同功能的蛋白中被发现（Mosavi et al.，2004），在动物及酵母细胞周期的调节、转录等方面扮演着重要的角色（Sedgwick & Smerdon，1999）。在模式植物拟南芥（Arabidopsis）中第一个被发现的ANK蛋白编码基因是AKR（Zhang et al.，1992），它受光信号调控，在细胞分化和生长过程中起到调节功能。随后越来越多的植物ANK蛋白功能被报道。拟南芥中ANK蛋白BOPI参与叶的形态建成（Ha et al.，2004）；拟南芥EMB506含有5个ANK结构域，可以与AKPR蛋白相互作用，在胚胎发育过程中起着重要的作用（Albert et al.，1999）；拟南芥XBAT32，编码泛素连接酶，通过乙烯信号转导途径参与侧根的形成（Nodzon et al.，2004；Lyzenga et al.，2012）。另外，它的同源基因XBAT35编码蛋白也具有泛素连接酶活性并参与乙烯信号转导途径（Carvalho et al.，2012）。据报道，ANK蛋白LIANK在百合花粉管的萌发和花粉管的生长过程中起至关重要的作用（Huang et al.，2006）。

研究发现，锚蛋白还参与植物对生物胁迫和非生物胁迫信号的响应。例如，拟南芥AKR2参与生物胁迫和非生物胁迫过程中抗氧化物质的代谢（Yan et al.，2002）；ACD6和NPR1参与水杨酸信号转导，对生物胁迫起到重要作用（Cao et al.，1997；Lu et al.，2003，2005）；水稻XB3参与XA21介导的植物免疫过程（Wang et al.，2006）；辣椒CaKR1可同时响应生物胁迫和非生物胁迫过程（Seong et al.，2007）。

目前，只有拟南芥和水稻中的ANK基因家族被鉴定出来并做了系统的生物信息学分析，在果树尤其是苹果中未见相关研究报道。2010年‘金冠’苹果全基因组测序完成后（Velasco et al.，2010），苹果RING finger家族（Li et al.，2011）、MdGLRs基因家族（罗华等，2012）、WRKY转录因子家族（许瑞瑞等，2012）及DREB（Zhao et al.，2012）转录因子也已通过生物信息学方法鉴定出来，并进行了全基因组分析和基因功能的预测，苹果基因功能数据库对苹果基因进行了广泛的家族分类（张世忠等，2012）。另外，ANK基因家族在拟南芥和水稻中的研究已有报道（Becerra et al.，2004；Huang et al.，2009），这为该家族的分类及功能分析提供了理论依据。作者拟从‘金冠’苹果全基因组出发，利用生物信息学方法，鉴定苹果ANK家族基因，分析基因结构域序列保守性及其家族进化关系，并通过分析基因表达谱筛选出在苹果果实成熟时期和砧木接穗互作过程中表达有不同程度变化的MdANK基因，以期为研究ANK在苹果生长发育和砧木接穗互作中的作用奠定一定的理论基础。

1 文献数据来源与分析方法

首先，从GDR（Genome Database for Rosaceae）数据库下载‘金冠’苹果全基因组序列（Jung et al.，2008），构建本地blast（Basic Local Alignment Search Tool）数据库，以拟南芥和水稻ANK家

6期许瑞瑞等：苹果锚蛋白基因ANK家族生物信息学鉴定分析 1023

族基因序列执行本地blast（1e-003）搜索（Mount，2007）；然后，利用苹果功能基因组数据库蛋白结构域搜索工具CD（conserved donmain）搜索含有ANK结构域（PF00023或SM00248）的基因（张世忠等，2012）。合并上述两部分结果，利用perl程序筛选，去掉重复序列，所得结果利用PFAM （Protein Family）及NCBI-CDD（Conserved Domains）工具进行蛋白结构预测（Mistry & Finn，2007；Marchler-Bauer et al.，2012），删除不含ANK结构域的基因，同时利用ExPASy Proteomics Server （http：//https://www.wendangku.net/doc/9e7137007.html,/）对所有ANK基因氨基酸序列进行分子量、等电点预测（Artimo et al.，2012）。

利用PFAM搜索ANK蛋白结构，使用DOG2.0（Domain Graph，version 2.0）进行蛋白结构绘制（Ren et al.，2009）。

从GDR数据库下载苹果基因组信息文件（assembly gff3 file），利用Perl程序选取ANK基因的染色体位置信息，并利用MapDraw程序进行染色体定位作图（刘仁虎和孟金陵，2003）。通过MUSCLE 进行序列比对（Edgar，2004），再利用MEGA5构建进化树，进化树生成算法采用邻接法（Neighbor- Joining，NJ），校验参数Bootstrap重复1 000次（Tamura et al.，2011）。

从EBI（The European Bioinformatics Institute）芯片数据库中下载果实发育芯片数据（E-MEXP- 2451）和砧木接穗互作芯片数据（E-GEOD-4762）及相应的探针序列（A-GEOD-11164和A-GEOD- 3715），分别构建探针序列的本地blast数据库，利用苹果ANK基因CDS序列进行比对，选取完全匹配探针代表该ANK基因（Kapushesky et al.，2010）。利用Perl从芯片数据中选取代表ANK基因的探针及表达量。采用Cluster3.0进行芯片聚类，Java Treeview查看芯片聚类结果并作图。

2 苹果ANK基因家族成员鉴定及分类

利用生物信息学方法，从‘金冠’苹果全基因组鉴定到351个ANK家族基因成员（表1），通过蛋白序列的PFAM及SMART结构域搜索分析，均含有ANK结构域（http：//https://www.wendangku.net/doc/9e7137007.html,/ mdank.txt）。苹果ANK基因编码的蛋白在72（MDP0000589579，属于ANK-M亚家族）~ 2 429（MDP0000163211，属于ANK-BPA亚家族）个氨基酸范围内，等电点在4.30（MDP0000218990，属于ANK-M亚家族）~ 11.13（MDP0000697244，属于ANK-M亚家族）之间。

表1 拟南芥、水稻和苹果ANK蛋白的分类及数量

Table 1 The classification and numbers of ANK in Arabidopsis，Oryza sativa and Malus × domestica

序号Number 亚家族

Subfamily

类型

Description

苹果

Malus × domestica

水稻

Oryza sativa

拟南芥

Arabidopsis

1 ANK-M Proteins with only ankyrin repeats 143 73 18

2 ANK-TM Ankyrin-transmembrane

proteins 83 37 40

3 ANK-TPR Protein with TPR or PPR repeats

4 22 1

4 ANK-RF Ring finger protein 8 9 5

5 ANK-ZF Zinc finger protein 15 7 6

6 ANK-BTB Proteins with BTB domain 8 6 7

7 ANK-IQ Calmodulin binding motif-containing protein 12 4 4

8 ANK-PK Protein kinases 18 4 7

9 ANK-BPA ARF GTPase-activating domain-containing protein 5 3 4

10 ANK-IT Potassium channels 10 0 1

11 ANK-SBP Protein with SBP doamins 5 0 0

12 ANK-GPCR Protein with GPCR_chapero_1 doamins 9 0 0

13 ANK-MS Protein with Motile_Sperm doamins 3 1 0

14 ANK-KinesinR Protein with Kinesin-relat doamins 7 0 0

15 ANK-UBN2 Protein with UBN2_3 doamins 5 0 0

16 ANK-O Proteins with other domains 26 10 13

总数 Total 351 175

105

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结构域分析结果显示，143个ANK蛋白只含有ANK重复，其它多数ANK蛋白包含多个结构域。根据蛋白结构域的差异，将苹果ANK蛋白分为16类（图1），分别是ANK-M（仅包含ANK

图1 ANK家族蛋白质结构

Fig. 1 Structure of representative ANK protein from each subfamily

6期许瑞瑞等：苹果锚蛋白基因ANK家族生物信息学鉴定分析 1025

结构域）、ANK-TM（跨膜蛋白）、ANK-TPR（TPR/PPR结构域蛋白，包括ANK-TPR和ANK-PPR）、ANK-RF（指环蛋白，又进一步分为ANK-C3HC4、ANK-RING_2及ANK-CCHC）、ANK-ZF（锌指蛋白，包括ANK-CCCH和ANK-DHHC）、ANK-BTB（BTB结构域蛋白）、ANK-IQ（钙离子结合蛋白）、ANK-PK（激酶蛋白，包含ANK-PKT）、ANK-BPA（GTP水解酶活性结构域蛋白）、ANK-IT （钾离子通道蛋白）、ANK-SBP（SBP结构域蛋白）、ANK-GPCR（GPCR分子伴侣结构域蛋白）、ANK-MS（Motile_Sperm结构域蛋白）、ANK-KinesinR（驱动蛋白相关结构域蛋白）、ANK-UBN2（UBN2_3结构域蛋白）及ANK-O（其他结构域，包括ANK-ACBP、ANK-Chromo、ANK-AAA、ANK-SOC、ANK-MTF、ANK-UCH、ANK-ARFG、ANK-KNOX、ANK-Mistic、ANK-Pellino、ANK-AdoptinN及ANK-RCC）。其中苹果ANK-M亚家族基因最多，有143个成员，与水稻类似，有73个水稻ANK-M蛋白，而拟南芥中只有18个ANK-M蛋白；其次是ANK-TM，苹果中有83个成员，水稻中有37个成员，有40个拟南芥ANK-TM蛋白，是拟南芥中成员最多的亚家族；ANK-SBP、ANK-GPCR、ANK-KinesinR和ANK-UBN2是苹果中特有的亚家族；而ANK-IT苹果中有10个成员，拟南芥中1个基因，水稻中未发现ANK-IT蛋白；苹果和水稻中分别有3个和1个ANK-MS蛋白，拟南芥中未发现ANK-MS亚家族蛋白成员（表1）。

3 苹果ANK基因染色体定位分析

利用染色体定位工具，分析‘金冠’苹果基因组信息，得到329个苹果ANK的染色体定位信息（图2），有22个ANK基因没有找到染色体定位信息。17条染色体均有MdANK分布，其中第2条染色体最多，有36个基因；其次是第17（34个）和第9、15条（30个）条染色体，而第6、7、8条染色体的最少只有6个。

4 苹果ANK基因系统进化分析

为了方便对苹果ANK蛋白的特征及进化进行分析，首先对所预测到的351个MdANK基因的进化关系进行评估。从系统进化树中可看出，所有苹果ANK共分为15类（A ~ O），其中B类ANK 成员最多，有84个基因；其次是A类和H类，分别有79和40个基因；J类基因最少，只有2个ANK成员（图3）。

5 果实成熟和砧木接穗互作时期MdANK基因的表达

通过查询EBI网站的芯片数据库，搜索出了苹果不同发育时期中ANK基因的表达变化情况。在果实成熟时期芯片中鉴定到179个基因表达（表2，http：//https://www.wendangku.net/doc/9e7137007.html,/mdank.txt），利用Cluster3.0软件，采用层次聚类算法（Hierarchical Clustering Algorithms）进行芯片聚类，结果如图4，A所示，由左向右依次对应的是苹果栽培品种‘Honey Crisp’（HC）和‘Crispps Pink’（CP）的3个时期：果实成熟期（week-0）、果实成熟前2周（week-2）、果实成熟前4周（week-4），且每个时期都有4次重复的结果，依次是GSM618107-GSM618110、GSM618111-GSM618114、GSM618115- GSM618118、GSM618119-GSM618122、GSM618123-GSM618126和GSM618127- GSM618130。在果实成熟过程中，品种间ANK基因表达类似，无显著差异。部分基因在果实成熟过程中表达量下调，其中10个基因下调明显（MDP0000167308、MDP0000886234、MDP0000842413、MDP0000183373、MDP0000248694、MDP0000263295、MDP0000216106、MDP0000255080、ANK-IT、ANK-TM、

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图2 苹果ANK基因在染色体上的位置

Fig. 2 The chromosome location of the ANK gene in apple

6期 许瑞瑞等：苹果锚蛋白基因ANK 家族生物信息学鉴定分析 1027

图3 苹果ANK 基因家族的系统进化树 每0.1刻度单位代表每个氨基酸的替换率。

Fig. 3 The unrooted neighbor joining phylogenetic tree of ANK gene family in apple

The scale bar represents 0.1 substitutions per amino acid position.

ANK-TM 、ANK-TM 、ANK-TM 亚家族），部分基因在果实成熟过程中表达上调，包括MDP0000268534、MDP0000150383、MDP0000176396、MDP0000196524、MDP0000243232、MDP0000206118、MDP0000260960及MDP0000131730（以上8个均为ANK-TM 亚家族）等基因。

在苹果砧木接穗互作相关的芯片结果中（图4，B ），搜索到312个基因的表达（详见http ：//www. https://www.wendangku.net/doc/9e7137007.html,/mdank.txt ），利用Cluster3.0软件，采用层次聚类算法（Hierarchical Clustering Algorithms ）进行芯片聚类。不同砧穗组合间存在差异，每种组合有2 ~ 3次的重复结果，其中MDP0000176396、

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6期 许瑞瑞等：苹果锚蛋白基因ANK 家族生物信息学鉴定分析 1029

图4 苹果ANK 基因芯片分析

A ：苹果ANK 基因在果实成熟过程中的表达谱；

B ：苹果ANK 基因在砧木接穗互作过程中的表达谱。

红色代表上调，绿色代表下调，黑色代表差异不明显，深浅代表强弱表达信号。 Ⅰ. Ambrosia/B9；Ⅱ. Gala/B9；Ⅲ. Melrose/B9；Ⅳ. Gala/B9；Ⅴ. Gala/G30；Ⅵ. Gala/M111；

Ⅶ. Gala/M27；Ⅷ. Gala/M7；Ⅸ. Gala/M9；Ⅹ. Gala/Supporter. Fig. 4 The microarray analysis of the ANK genes in apple

A. Expression profile of MdANK during fruit development in apple ；

B. Expression profile of MdANK in apple during rootstock-scion interactions

process. The color of red ，green and black represent down-regulation ，up-regulation and no significant changes ，respectively.

The various shades of red and green represent the different of expression signal values.

Ⅰ. Ambrosia/B9；Ⅱ. Gala/B9；Ⅲ. Melrose/B9；Ⅳ. Gala/B9；Ⅴ. Gala/G30；Ⅵ. Gala/M111；

Ⅶ. Gala/M27；Ⅷ. Gala/M7；Ⅸ. Gala/M9；Ⅹ

. Gala/Supporter.

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MDP0000262349、MDP0000279407、MDP0000303379及MDP0000304270（分别为ANK-TM、ANK-TM、ANK-TM、ANK-M、ANK-TM亚家族）在Ambrosia/B9及Melrose/B9组合时表达量较高；而MDP0000211999、MDP0000212988、MDP0000131730、MDP0000206118、MDP0000243232、MDP0000216345、MDP0000528243、MDP0000641033、MDP0000146156及MDP0000942136（分别为ANK-M、ANK-M、ANK-TM、ANK-TM、ANK-TM、ANK-TM、ANK-M、ANK-M、ANK-M、ANK-M亚家族）等在Ambrosia/B9组合中表达量较低；MDP0000191786、MDP0000200070及MDP0000308456（分别为ANK-TM、ANK-M、ANK-TM亚家族）在Melrose/B9组合中表达量较低。

6 讨论

ANK蛋白能够参与蛋白互作，响应多种生物和非生物胁迫反应，能够调控植物的生长发育等过程。ANK基因在植物中分布较广，蛋白种类及数量物种间存在着较大差异。随着植物基因组研究的深入，对基因家族的研究已成为现今植物基因功能研究的重点之一。其中，拟南芥ANK基因家族有105个成员，水稻中有175个成员，而在苹果中找到了351个ANK蛋白。为方便与已报道的物种中ANK家族的比较，各物种中亚家族的划分及蛋白数量统计见http：//https://www.wendangku.net/doc/9e7137007.html,/ mdank.txt。

已有研究表明拟南芥、水稻、百合、辣椒等物种中的ANK蛋白的一些家族成员参与了光信号调控、叶的形态建成、胚胎发育、侧根的形成以及对生物胁迫和非生物胁迫信号的响应等（Zhang et al.，1992；Cao et al.，1997；Albert et al.，1999；Yan et al.，2002；Ha et al.，2004；Nodzon et al.，2004；Lu et al.，2005；Wang et al.，2006；Seong et al.，2007；Lyzenga et al.，2012），根据系统进化树分析结果进行ANK基因同源性的比较，预测苹果ANK蛋白家族的某些成员也具有类似的功能，具体还需要试验的验证。我们推测：苹果中ANK蛋白数量更多，结构与功能更加多样性，有可能参与植物中更多、更复杂的生理生化功能。首先苹果中ANK蛋白的数量远远高于水稻和拟南芥中的数量；其次，苹果中亚家族数量也明显多与前两者，其中拟南芥和水稻中没有亚家族ANK-SBP、ANK-GPCR、ANK-KinsinR和ANK-UBN2；最后，苹果中仅含有ANK结构域的蛋白达143个，远高于拟南芥和水稻中的成员数量。

本研究结果还显示，有部分MdANK基因在果实发育过程中的表达量有不同程度的变化，并且发现变化明显的基因多属于ANK-IT和ANK-TM亚家族，说明这两个亚家族在果实发育过程可能起着更重要的作用，它们如何参与苹果果实的发育成熟，其具体功能还有待进一步研究。另外，还找到321个MdANK基因在苹果砧木接穗互作过程中表达量有变化，说明不同砧穗组合时引起了不同的MdANK基因成员表达量变化，其中变化明显的基因多数是ANK-TM和ANK-M亚家族，它们可能间接影响嫁接苗的生长，其具体通过哪些基因影响，如何影响的还有待进一步深入研究。

为了能更好的了解苹果中ANK基因家族的结构和功能，以‘金冠’苹果全基因组序列为背景，对苹果中351个MdANK进行鉴定和分析。本研究为苹果中ANK蛋白的功能研究提供有力数据。苹果中ANK蛋白如何与其它蛋白互作，调控果实生长发育以及如何参与逆境信号的传导将成为今后果树研究的重点，将为苹果优质高产奠定理论基础。

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